Method Article

Analyse comparative de la structure de l’ARN des transcrits naissants et matures chez Saccharomyces cerevisiae

DOI:

10.3791/69945

⸱

February 27th, 2026

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1Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 2RNA Therapeutics Institute, UMass Chan Medical School

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La structure secondaire de l’ARN a principalement été observée dans l’ARN mature grâce à des méthodes de sondage structurel. Le séquençage co-transcriptionnel Structural Tracking (CoSTseq) unifie le run-on nucléaire, qui a été utilisé pour étudier la position de la polymérase sur l’ARN naissant, avec une sondage structurel. CoSTseq permet ainsi l’observation de la structure secondaire de l’ARN dans l’ARN en transcription active.

Abstract

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Pendant la transcription, l’ARN naissant commence à se jumeler en sortant des polymérases à ARN (Pols). Cette association de bases permet la formation de structures d’ARN qui influencent de manière critique l’expression génique au niveau du traitement, de la traduction et de la stabilité de l’ARN. Les méthodes établies pour étudier la structure secondaire de l’ARN sont limitées aux transcrits matures, tandis que peu de choses sont connues sur les états de repliement. De plus, l’abondance relativement faible (< 1 %) et la nature transitoire de l’ARN naissant compliquent son isolement et sa caractérisation. Le suivi de structure co-transcriptionnel (CoSTseq) exploite la répétition transcriptionnelle avec la sonde biotine-NTP et sulfate de diméthyle (DMS) pour acquérir simultanément la position Pol et le statut d’appariement de bases des transcrits naissants. Chez Saccharomyces cerevisiae, CoSTseq fournit les informations de séquence et de structure près de l’extrémité 3' des ARN naissants transcrits par l’un des trois pols à ARN. Pendant le run-on transcriptionnel, la biotine-NTP incorporée sur le site actif bloque efficacement Pols. Ensuite, le traitement avec DMS méthyle les nucléotides A, C et U non appariés. L’enrichissement de biotine et la synthèse d’ADNc ultérieurs avec une transcriptase inverse à commutation de gabarit permettent le séquençage par extrémités jumelées et le calcul des réactivités DMS en fonction de la position Pol. CoSTseq est facilement réalisé parallèlement à la sonde DMS (DMS-MaPseq), permettant également la capture du transcrit mature replié. Ici, un protocole détaillé est présenté pour le CoSTseq parallèle et le DMS-MaPseq, incluant la répétition transcriptionnelle, la préparation de la bibliothèque et l’analyse des données.

Introduction

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L’ARN peut se replier en structures secondaires et tertiaires grâce à l’appariement de bases au sein des molécules d’ARN, et ces structures peuvent être en outre influencées par des protéines qui agissent comme des chaperons pour guider le repliement del’ARN 1. La structure de l’ARN peut être très dynamique, les ARN cellulaires pouvant se conformer à une gamme de structures définies par le paysage thermodynamique pour générer des ensembles de conformations possiblesd’ARN 2. Les changements conformationnels dynamiques ont le potentiel d’affecter la régulation et l’expression desgènes 3,4. Inversement, l’ARN peut aussi adopter des structures fortement favorisées étroitement liées à sa fonction, telles que les ARNt, les petits ARN nucléaires et l’ARNr. Bien que ces exemples mettent en lumière des ARN matures ayant un rôle régulateur fort, les étapes de traitement eucaryotes de l’ARN coexistent souvent avec la transcription, notamment le pré-épissage de l’ARNm, le clivage à l’extrémité 3' et la modification de l’ARN. De même, le repliement de l’ARN peut se produire avant la maturation du transcript, comme discuté ailleurs5.

Bien que la séquence d’ARN puisse coder une structure secondaire, une détermination précise nécessite souvent une validation expérimentale in vitro ou in vivo. L’avènement de techniques de modification chimique spécifique à la structure comme DMS-MaPseq (profilage mutationnel de diméthyle sulfate avec séquençage) a ouvert la voie à la détermination de la structure secondaire de l’ARN cellulaire à partir de cellulesvivantes 6. Le DMS est introduit dans les cellules et méthyle spécifiquement les faces de base Watson-Crick de l’adénosie, de la cytosine et, dans une moindre mesure, de l’uride, qui ne sont accessibles qu’en cas de non-appariement. Après modification par DMS, une transcriptase inverse haute fidélité et hautement processive, telle que la transcriptase inverse d’introns thermostable du groupe II (TGIRT)7, peut être utilisée pour recoder des bases modifiées sous forme de mutations dans la bibliothèque finale d’ADNc. Ces mutations peuvent ensuite être utilisées pour déduire l’accessibilité de l’ARN au niveau des nucléotides. Bien qu’il s’agisse d’une technique puissante, DMS-MaPseq et les méthodes associées ont principalement été utilisées pour étudier l’ARN mature déjà entièrementreplié 6.

Plusieurs méthodes ont été développées pour étudier la régulation et le traitement de l’ARN naissant. Le séquençage global à exécution (GROseq) a été développé pour surmonter les limites de l’RNA-seq, qui permet la mesure en régime stationnaire des niveaux d’ARN dans les cellules et fournit ainsi des informations moyennant entre la transcription, le traitement de l’ARN et les processus de dégradation affectant les niveaux d’ARN. GROseq utilisait la bromouridine pour le fonctionnement nucléaire, où une polymérase à ARN (Pol) pouvait ajouter des nucléotides à l’ARN naissant à la résolution de dizaines de bases8. Le séquençage de précision à exécution (PROseq) a été construit sur cette méthodologie pour cartographier les pols d’ARN sur des ARN naissants à la résolution par paires de bases en utilisant des NTP de biotine. Ici, un NTP biotinylé est ajouté là où Pol a été détecté pour la dernière fois à l’extrémité 3' del’ARN 9 nouvellement synthétisé.

Récemment, Schärfen et al. ont développé et utilisé le Co-transcriptional Structure Tracking (CoSTseq), qui exploite et adapte la biotine run-on et le sondage DMS pour permettre la détermination de la structure de l’ARN des transcrits naissants chez S. cerevisiae10. CoSTseq permet de déterminer la structure secondaire de l’ARN lors de la transcription active ; ce protocole détaille comment le run-on nucléaire est combiné avec le sondage DMS lors des expériences CoSTseq. Étant donné que CoSTseq nécessite une manipulation minutieuse lors de la préparation de l’échantillon, ainsi qu’une attention particulière à la qualité des données lors de l’analyse CoSTseq, ce protocole détaille les meilleures pratiques pour générer des bibliothèques adaptées au séquençage en binôme sur la plateforme Illumina. Le protocole CoSTseq produit simultanément l’ARN naissant et l’ARN mature, ce dernier pouvant être analysé sous forme d’un ensemble de données DMS-MaPseq afin de permettre une comparaison rigoureuse entre l’ARN naissant et l’ARN mature (Figure 1). Expérimentalement, l’accès aux réactifs nécessaires à l’entretien des cultures de levure et à la réalisation de sondages nucléaires et DMS est requis, comme détaillé dans le protocole ci-dessous. Le rendement de l’ARN naissant est crucial pour le succès de la préparation des bibliothèques CoSTseq et de l’analyse des données ; Ainsi, les conditions de croissance établies par des incubateurs et des milieux de culture appropriés sont essentielles pour sécuriser une matière de départ suffisante. Enfin, pour réaliser une analyse computationnelle des données CoSTseq, l’accès à un cluster de calcul haute performance (HPC) est idéal.

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Figure 1 : Aperçu de la préparation combinée de la bibliothèque CoSTseq et DMS-MaPseq à partir du même échantillon biologique. (A) La perméabilisation de la paroi cellulaire et de la membrane nucléaire de la levure avec le sarkosyl permet l’incorporation de biotine-NTP à l’extrémité 3' de l’ARN naissant lors d’une réaction nucléaire de diffusion. (B) Le DMS méthyle les résidus A et C non appariés (parfois U) sur l’ARN naissant et mature dans la cellule perméabilisée, et l’ARN total est obtenu par extraction de phénol/chloroforme. L’ARN naissant est ensuite purifié de l’ARN total par des billes magnétiques conjuguées à la streptavidine ; L’extraction par TRIzol libère l’ARN naissant des billes. Parallèlement, le surnageant de billes contenant des ARNm polyadénylés peut être précipité par EtOH ; à partir de ce matériau, l’ARNm peut être isolé par pulldown de billes oligo(dT). Les ARNm poly A+ sont fragmentés avant la préparation de la bibliothèque. (C) Une transcriptase inverse à commutation de gabarit est utilisée pour générer séparément de l’ADNc à partir d’ARN naissant ou mature, suivie d’une ligation d’adaptateurs 5' et 3' pour introduire un UMI N7 et des codes-barres (voir Figure 2 pour les détails de CoSTseq). Notez que les étapes de transcription inversée DMS-MaPseq et CoSTseq utiliseront des adaptateurs hétéroduplex distincts avec des surplombs complémentaires à la biotine-NTP utilisée dans CoSTseq et des surplombs N utilisés dans DMS-MaPseq. Des cycles PCR minimaux sont utilisés pour l’amplification afin de limiter la polarisation dans la bibliothèque, et la sélection de la taille est appliquée pour retirer les dimers adaptateurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Protocol

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REMARQUE : Avant de commencer, assurez-vous que tous les tampons listés dans le Tableau 1 sont préparés. Tous les réactifs doivent être préparés dans de l’eau sans nucléase. La stérilisation par filtre des tampons est recommandée lors de l’utilisation de produits chimiques/réactifs de qualité non biologique moléculaire pour la préparation des tampons. Pour les sections 1 à 4, préparez à l’avance les éléments suivants :

1. Préparation des matériaux et réactifs

  1. Préparez une solution de sarkosyl (v/v) à 10 % au moins un jour à l’avance pour laisser suffisamment de temps à la dissolution complète. Stériliser la solution homogène par filtre avec un filtre de 0,22 μm. Le jour de l’expérience, utilisez le sarkosyl à 10 % pour préparer une solution à 0,5 % de sarkosyl, puis laissez-le sur la glace jusqu’à utilisation.
  2. Pré-refroidissez les ultracentrifugeuses à 4 °C. Dans la hotte à fumées, réglez le thermomixeur à 30 °C et préchauffez une aliquote de tampon de sondage de structure 2,5x. Ce thermomixeur sera utilisé plus tard pour le traitement DMS.
  3. Dans la hotte à fumée, réglez un bloc thermique à 65 °C et réchauffez 650 μL de phénol acide : chloroforme par réaction pour l’extraction d’ARN.
  4. Mélangez la DTT avec un tampon de transcription 2,5x jusqu’à une concentration finale de 2 mM. Préparez et refroidissez fraîchement les solutions de trempe et de lavage pour une utilisation immédiate après le traitement DMS (voir Tableau 1).
  5. Aliquote 40 μL de SDS à 20 % dans des tubes pour la lyse de la levure avant l’extraction de l’ARN. Préparez une solution de chlorure de zinc (ZnCl2) de 100 mM et stérilisez par filtre avant utilisation.
  6. Générer des souches de levure de délétion, d’appauvrissement ou de knock-in qui pourraient être nécessaires pour répondre à toute question de recherche spécifique sur l’appariement de bases d’ARN naissant, par rapport à la souche sauvage de levure bourgeonnante. Toujours réveiller fraîchement les souches en les striant sur une plaque d’agar à levure appropriée (YPD, dropout ou plaques antibiotiques). Commencez une culture liquide à partir d’une seule colonie la veille du début de l’expérience. Pour plus d’instructions sur la croissance et la manipulation des souches de levure, veuillez consulter Schärfen et al., 2025.

2. Préparation des cellules de levure pour CoSTseq

  1. Mise en place d’une préculture : cultiver la souche BY4741 de S. cerevisiae dans 50 mL de milieu YPAD jusqu’à ce que les cellules atteignent la phase logarithmique (densité optique (OD) à 600 nm = 0,6) à 30 °C avec secouement à 200 tr/min. Si nécessaire, diluez la culture à 0,2-0,3 et laissez la levure atteindre 0,6 OD.
  2. Récolte de la levure : Collectez et filez 1,8 OD (~3 mL) de culture de levure à 2 500 x g pendant 3 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie (4 °C). Jetez le surnageant dans un contenant à déchets. Laver les granulés en resuspendant 10 mL de solution tampon phosphatée (PBS) à froid. Faites tourner à nouveau à 2 500 x g pendant 3 minutes à 4 °C. Éliminez le surnageant et gardez la pastille de levure sur la glace.
  3. Perméabilisation des cellules de levure : Resuspendez soigneusement la pastille de levure dans 10 mL de sarkosyl froid à 0,5 %. Utilisez une pipette P1000 pour resuspendre les cellules et éviter de créer des bulles. Incubez sur glace pendant 20 minutes pour favoriser la perméabilisation. Pelletez les cellules de levure perméabilisées à 400 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Resuspendez les cellules de levure perméabilisées dans 100 μL d’eau sans nucléase.

REMARQUE : Bien que le marquage du DMS ne nécessite pas la perméabilisation de la paroi cellulaire, la réaction de diffusion nucléaire nécessite une perméabilisation pour que les nucléotides biotinylés atteignent le site de transcription. Cela est réalisé par le traitement par sarkosyl, qui perméabilise à la fois la paroi cellulaire de la levure et sa membrane nucléaire. De plus, le traitement par sarkosyl facilite le test continu en empêchant de nouveaux événements d’initiation de la transcription et en délogeant les facteurs d’allongement négatifs de Pol II et de lachromatine 11,12. Manipulez délicatement les échantillons et maintenez une vitesse centrifuge basse (400 x g) pour éviter la rupture cellulaire et favoriser l’incorporation réussie de la biotine dans des transcrits naissantsallongés 13.

3. Exploitation nucléaire et sondage DMS

REMARQUE : L’activation nucléaire avec la biotine-NTP introduit un obstacle stérique qui arrête les polars à ARN sur leur site actif et fournit une poignée de biotine pour l’enrichissement sélectif de l’ARN naissant. Selon la résolution souhaitée, un run-on nucléaire peut être réalisé avec un, deux ou les quatre ribonucléotidesbiotinylés 9. Pour des raisons d’économie, le flux de travail décrit ici n’utilise qu’un seul nucléotide biotinylé (c’est-à-dire la biotine-CTP).

  1. Mise en place de la réaction nucléaire de course
    1. Préparez 2,5x solution de travail du tampon de transcription avec une DTT fraîchement ajoutée de 5 mM et préchauffez un tampon de sondage de structure 2,5x à 30 °C (voir Tableau 1).
    2. Dans un tube propre de 2 mL, ajoutez 120 μL de tampon de transcription 2,5x, 3,75 μL de 10 mM d’ATP, 3,75 μL de 10 mM GTP, 3,75 μL de 10 mM UTP, 7,5 μL de 1 mM Bio-CTP, 15 μL de 10 % de sarkosyl, et portez le volume à 200 μL avec 46,25 μL d’eau sans nucléase.
    3. Ajoutez 100 μL de cellules au tube et incubez dans un thermomixeur réglé à 30 °C pendant 2 minutes en secouant à 500 tr/min.
      REMARQUE : Cette étape est très urgente. Essayez de limiter le nombre d’échantillons pour générer des données fiables. Il est recommandé de décaler le timing entre les échantillons pour la cohérence.
  2. Traitement DMS : Une fois l’incubation terminée, ajoutez rapidement 200 μL de tampon de sondage structurel préchauffé 2,5x et 25 μL de réactif DMS au tube simultanément. Vortex doucement en deux impulsions et continue d’incuber sur le thermomixeur pendant 4 minutes à 30 °C tout en secouant à 500 tr/min. Étalez 30 secondes entre les échantillons pour être cohérent.
    REMARQUE : Le sondage DMS est une réaction instantanée qui permet une haute résolutiontemporelle 14 du statut d’appariement des bases de l’ARN. Pour éviter la modification continue du DMS, il est crucial de tremper rapidement le marquage du DMS en utilisant l’agent réducteur fort β-mercaptoéthanol. De plus, tout DMS restant entravera la récupération de l’ARN lors de l’extraction. L’ajout d’alcool isoamylique saturé d’eau avant centrifugation peut éliminer les résidus insolubles de DMS dans la granulecellulaire 15. Cette étape est très urgente. Il est essentiel de travailler avec un nombre limité d’échantillons pour générer des données fiables.
    ATTENTION : Le DMS est un liquide hautement toxique et incolore avec une légère odeur d’oignon. Des précautions extrêmes sont nécessaires lors du travail avec DMS. Le contact direct et/ou l’inhalation de vapeurs peuvent provoquer une nécrose des yeux, de la bouche et des voies respiratoires, y compris des dommages graves aux organes. Utilisez des lunettes de protection, une blouse de laboratoire et de vrais gants. Double gant dès que possible et changez immédiatement les gants dès l’exposition ou après l’utilisation du DMS. Effectuez des étapes impliquant un DMS sous une hotte à fumée. Utilisez des conteneurs dédiés à déchets pour l’élimination DMS.
  3. Trempe et lavage
    1. Préparez à l’avance les tampons d’arrêt et de lavage comme indiqué dans le tableau 1 et placez-les sur la glace jusqu’à utilisation. Arrêtez la méthylation du DMS en ajoutant 1 mL de tampon d’arrêt.
    2. Centrifugez les échantillons marqués DMS pendant 5 minutes à 3 500 x g dans une centrifugeuse pré-refroidie. Jetez les déchets dans un contenant approprié.
    3. Ajoutez 1 mL de tampon de lavage au pellet et remettez en suspension. Répétez l’étape 3.3.2. Procédez immédiatement à l’extraction de l’ARN. Ne congelez pas la pastille de levure.
  4. Extraction par phénol-chloroforme
    1. Résuspendez la levure marquée par DMS dans 600 μL de tampon de lyse ARN, puis transférez la suspension dans des tubes contenant 40 μL de SDS à 20 %. Incubez à 65 °C pendant 30 secondes avec des secousses à 950 tr/min.
    2. Ajoutez 650 μL de phénol acide :chloroforme préchauffé au lysat de levure et continuez à chauffer sur le thermomixeur pendant 2 minutes à 65 °C en secouant à 950 tr/min. Laissez les échantillons reposer sur la glace pendant 5 minutes.
      REMARQUE : En attendant, passez le bloc chauffant ou le thermomixeur à température ambiante (RT).
    3. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 3 minutes en RT.
    4. Déplacez la couche supérieure dans un nouveau tube et ajoutez 650 μL de chloroforme. Vortex brièvement. Centrifugez à nouveau et collectez la couche supérieure dans un nouveau tube contenant 700 μL d’isopropanol.
    5. Inversez pour mélanger et incuber dans le congélateur à -20 °C pendant 30 minutes, permettant à l’ARN de précipiter. Centrifugez à 20 000 x g pendant 45 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant. Lavez la pellete avec 750 μL d’éthanol à 75 % (EtOH).
      REMARQUE : C’est un point d’arrêt/pause dans le protocole. Les échantillons peuvent être laissés dans un EtOH à 75 % toute la nuit à -80 °C.
    6. Faites tourner pendant 3 minutes à 20 000 x g et jetez le surnageant. Faites sécher à l’air le pellet d’ARN et dissoudrez-le dans 81 μL d’eau sans nucléase. Quantifiez le rendement de l’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre réglé sur une longueur d’onde de 260 nm. Appliquez 1 μL de la resuspension ci-dessus pour mesurer. Diluez l’échantillon d’ARN si nécessaire. Au moins 80 μg d’ARN total devraient être présents pour passer à l’étape suivante.
      REMARQUE : Si nécessaire, l’ARN marqué par DMS peut être stocké à -80 °C pendant jusqu’à 2 semaines.

4. ARN naissant (CoSTseq)

REMARQUE : L’ARN total obtenu à partir de l’extraction phénol-chloroforme contient des ARN matures marqués par DMS ainsi que des ARN naissants biotinylés marqués par DMS provenant des trois polymérases. Pour purifier les ARN naissants de l’ARN total, les étapes suivantes utiliseront des billes de streptavidine pour enrichir l’ARN naissant biotinylé. En raison de la forte affinité de la biotine pour la streptavidine (Kd = 10-14 - 10-15 M), deux extractions consécutives de réactifs d’ARN (voir Tableau des matériaux) sont effectuées pour éluer l’ARN des billes de streptavidina. Notez que moins de 1 % de l’ARN de la levure est constitué d’ARN naissant, selon la condition de croissance16.

  1. Tirage à la biotine
    1. Préparation des billes magnétiques de Streptavidine
      1. Préparez le tampon de prélavage A et le tampon de prélavage B comme indiqué dans le tableau 1 pour la composition. Homogénéisez les billes magnétiques de Streptavidine par vortex. Obtenir 44 μL de billes magnétiques homogénéisées par échantillon de 80 μg d’ARN total.
        REMARQUE : Augmentez en multipliant le volume par le nombre d’échantillons.
      2. Placez les billes magnétiques sur le support magnétique et retirez la solution de rangement. Résuspendez les billes magnétiques dans 1 mL de tampon de prélavage A.
      3. Incubez pendant 2 minutes à température ambiante. Magnétiser et retirer le surnageant. Répétez le lavage. Laver 1x avec 1 mL de tampon de prélavage B. Magnétiser et retirer le surnageant, puis passer rapidement à l’étape de liaison et de lavage.
    2. Reliure et lavage
      1. Préparez les tampons de liaison 2x, 1x tampons de liaison, tampons à haute teneur en sel et à faible sal, comme indiqué dans le Tableau 1.
      2. Resuspendez les billes prélavées en ajoutant deux fois le volume initial (88 μL) de tampon de liaison 2x. Transférer 80 μL de billes dans un tube stérile de 1,5 mL contenant 80 μL de l’échantillon d’ARN biotinylé.
      3. Faites tourner le mélange de billes et d’échantillons sur un rotateur pendant 20 minutes à température ambiante. Collectez l’ARN mature contenant le flux traversant par étape magnétique (procédez à l’étape de précipitation).
      4. Rincez le complexe ARN bille-naissant avec 500 μL de tampon à haute teneur en sel 2x. Effectuez un rinçage avec 500 μL de liaison 1x, suivi d’un autre rinçage avec 500 μL de tampon faible en sel.
  2. Élution par extraction de réactifs d’ARN
    1. Préchauffez un thermomixeur à 60 °C. Refroidir une centrifugeuse capable d’atteindre une vitesse de 20 000 x g à 4 °C.
    2. Ajouter 300 μL de réactif ARN (voir Tableau des matériaux) au complexe ARN bile-naissant et resuspendre. Incubez sur un thermomixeur pendant 5 minutes réglé à 60 °C.
    3. Ajoutez 60 μL de chloroforme, un vortex, et incubez 3 minutes à la réchauffe récréative. Faites tourner à 14 000 x g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie.
    4. Déplacez la phase aqueuse supérieure vers un nouveau tube de collecte (~180 μL). Abandonnez la phase organique, laissant derrière elles les billes et la phase aqueuse restante.
    5. Répétez l’extraction pour obtenir un volume final de 360 μL de phase aqueuse dans le tube de collecte.
    6. Ajoutez 360 μL de chloroforme au tube de collecte et formez brièvement le vortex. Faites tourner à 14 000 x g pendant 5 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie.
    7. Transférez (environ 350 μL) de la couche supérieure vers un tube frais. Précipiter l’ARN en ajoutant 900 μL d’EtOH absolu et 1 μL de co-précipitant.
    8. Vortex brièvement et permet aux précipitations de se produire à -20 °C pendant 20 minutes ou -80 °C pendant la nuit.
    9. Dans la centrifugeuse pré-refroidie, centrifugez à 20 000 x g pendant 20 minutes. Jetez soigneusement le surnageant.
    10. Lavez le pellet avec 750 μL d’EtOH à 75 %, suivi d’une autre centrifugation à froid à 20 000 x g pendant 5 minutes.
    11. Séchez le pellet pour enlever les résidus d’EtOH pendant 10 minutes. Dissoudre la pastille d’ARN dans 3,75 μL deH2O.
      REMARQUE : Le blot par points de l’ARN élué suivi d’une sonde avec un conjugué streptavidine-HRP est la méthode la plus efficace pour évaluer le pulldown de la biotine. Cependant, cette approche consomme une quantité importante de matériel d’échantillon, ne laissant pas assez de matériel pour la préparation à la bibliothèque.
  3. Précipitations du surnageant
    1. Précipiter le surnageant contenant des ARN matures en ajoutant 2,5 à 3 volumes d’EtOH. Laisser les précipitations à -20 °C pendant 1 heure.
    2. Dans une centrifugeuse pré-refroidie, faites tourner pendant 45 minutes à 20 000 x g. Aspirez soigneusement le surnageant.
    3. Lavez la pelote d’ARN avec 0,5 mL d’EtOH à 75 %. Sécher et dissoudre le pellet dans 50 μL d’eau sans nucléase. Placez le tube sur un bloc chauffant à 65 °C pour améliorer la dissolution du comprimé d’ARN.
    4. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre pour les étapes suivantes.

5. ARN mature (DMS-MaPseq)

  1. Sélection Poly A
    REMARQUE : Les ARN matures polyadénylés sont purifiés à l’aide d’une capture d’affinité basée sur des billes oligo(dT). Ce protocole est optimisé pour utiliser le kit de purification mRNA DIRECT de Dynabeads (voir Tableau des matériaux). En préparation initiale, préchauffez 1 mL d’eau sans nucléase à 80 °C pour l’élution et réglez un bloc thermique à 70 °C.
    1. Préparation de l’ARN pour le pulldown de poly A : transférer 50 μg d’ARN précipité et le porter à un volume final de 300 μL avec de l’eau sans nucléase. Chauffez l’ARN à 70 °C pendant 2 minutes pour perturber les structures secondaires et placez-le immédiatement sur la glace. Mélangez brièvement l’ARN avec 300 μL de tampon de lyse/liaison et de vortex.
    2. Préparation des billes magnétiques : Mettez les billes magnétiques en suspension en les faisant passer en vortex pendant au moins 30 secondes. Transférez 100 μL de billes suspendues par échantillon dans un tube stérile de 1,5 mL. Magnétisez pour éliminer le tampon de stockage. Rincez les billes magnétiques dans un volume égal de tampon de lyse/liaison, magnétisez et jetez le surnageant.
    3. Reliure et lavage
      1. Ajoutez les 100 μL de billes prélavées aux 600 μL d’ARN d’échantillon préparé. Faites pivoter en continu sur un rotateur pendant 5 minutes à température ambiante.
      2. Collectez les billes en les plaçant sur un support magnétique et jetez le filtre à travers. Lavez les billes avec 600 μL de tampon de lavage A. Pipette pour mélanger.
      3. Ramassez à nouveau les perles pour jeter le lavage. Lavez les billes avec 300 μL de tampon de lavage B. Pipette pour mélanger.
      4. Ramassez à nouveau les perles pour jeter le lavage. Mélangez les billes avec 90 μL d’eau tiède (80 °C) et laissez la liaison en ajoutant 90 μL de tampon de lyse/liaison. Répétez l’étape 5.1.3.1-5.1.3.3.
    4. Élution : Resuspendez les billes dans 30 μL d’eau tiède (80 °C) sans nucléase. Incubez à 75 °C à 80 °C pendant 2 minutes. Soumettez rapidement les billes à un champ magnétique et collectez les éluates dans un tube sans RNase. Répétez l’élution et collectez l’ARN élué.
  2. Fragmentation
    REMARQUE : La fragmentation des ARNm peut être obtenue par des moyens enzymatiques ou chimiques. Ici, le chlorure de zinc et la chaleur sont utilisés pour la fragmentation. Contrairement aux enzymes qui nécessitent une séquence spécifique ou des éléments structurels, les ions de zinc agissent comme un acide de Lewis pour activer l’oxygène 2' (un nucléophile) et fendre la colonne vertébrale phosphodiestre. Cela entraîne la formation d’esters phosphatiques cycliques 5' OH et 2',3' sur les brins ARN17 produit.
    1. Préchauffez le thermocycleur avec la température du bloc réglée à 94 °C et la température du couvercle réglée à 105 °C. Placez 54 μL d’ARNm élué dans un tube PCR.
    2. Ajoutez 6 μL de solution de chlorure de zinc à 100 mM (concentration finale de 10 mM), un vortex pendant 2 s, puis incubez immédiatement à 94 °C pendant 55 s sur le thermocycleur préchauffé.
    3. À la fin de l’incubation, trempez la réaction de fragmentation avec 6,6 μL de 0,5 M EDTA (concentration finale de 50 mM), pipetez de haut en bas pour mélanger, puis placez rapidement les tubes sur la glace. Transférez le contenu dans des tubes stériles de 1,5 mL.
    4. Permettre la précipitation des ARNm fragmentés avec l’ajout de 150 μL d’isopropanol, 15 μL d’acétate de sodium 3 M, pH 5,2 et 1 μL de co-précipitant.
    5. Placez à -20 °C pendant 30 minutes. Faites tourner à 20 000 x g pendant 45 minutes dans une centrifugeuse pré-refroidie. Lavez le pellet avec 75 % d’EtOH et dissouds-le dans 15 μL d’eau sans nucléase.
  3. Traitement PNK
    REMARQUE : La fragmentation chimique avecZnCl 2 génère des extrémités 5' et 3' inadaptées à la ligation17. Ainsi, après la fragmentation chimique, les ARN sont soumis à un traitement par polynucléotide kinase (PNK), qui phosphoryle les extrémités phosphatées 5' OH et déphosphoryle 3' phosphate, lesquelles peuvent ensuite être ligaturées aux adaptateurs18.
    1. Ajoutez 1 μL d’inhibiteur de ribonucléase, 2 μL de tampon PNK 10x et 2 μL de PNK T4. Incubez à 37 °C pendant 60 minutes. Arrêtez la réaction en ajoutant 30 μL d’eau sans nucléase, 50 μL de tampon de liaison à l’ARN et 50 μL d’EtOH.
    2. Utilisez une méthode de purification de l’ARN à base de colonne de spin pour éliminer les contaminants et concentrer l’ARN. Cela peut se faire en utilisant un kit commercialement disponible (kit de nettoyage et de concentration d’ARN, voir Tableau des matériaux). En résumé, mélangez deux volumes de tampon de liaison ARN avec 1 volume d’échantillon, mélangez un volume égal de ce mélange avec 100 % d’EtOH, puis chargez sur la colonne de spin avec un tube de collecte frais. Faites tourner cet échantillon et jetez le flux traversant. Laver la colonne de spin avec 700 μL de tampon de lavage ARN et une fois avec 400 μL de tampon de lavage ARN. Écartez le flux à travers. Faites tourner la colonne vide pendant 1 minute pour assurer l’élimination complète du tampon de lavage.
    3. Éluvez l’ARN dans 10 μL d’eau tiède sans nucléase.
      REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de centrifugation à 10 000 - 16 000 x g en RT pendant 30 s.

6. Réaction de transcription inverse par changement de modèle

REMARQUE : Les ARN naissants issus du pulldown de la biotine (étape 4.2) et de l’ARNm fragmenté après traitement PNK (étape 5.3) sont soumis aux étapes suivantes pour la préparation de la bibliothèque ( voir Figure 1 et Figure 2). En résumé, un modèle d’ARN synthétique/duplex de démarrage d’amorce ADN (adaptateur hétéroduplex ARN/ADN R2) sur lequel le changement de gabarit peut avoir lieu sera préparé. Cet hétéroduplex fournit une courte séquence complémentaire qui permet le changement de gabarit par la transcriptase inverse (RT) pour changer de brins, c’est-à-dire lorsque le RT change de brin de l’ARN à l’amorce ADN, permettant ainsi une synthèse d’ADNc fluide de l’ARN vers la séquence adaptatrice. La transcriptase inverse induro est utilisée ici, qui a été testée et optimisée pour ce protocole. D’autres transcriptases inverses à commutation de modèles peuvent être utilisées pour la préparation de la bibliothèque CoSTseq si désiré, mais nécessitent une optimisation par l’utilisateur.

  1. Séquences adaptatrices hétéroduplex ADN/ARN
    REMARQUE : Les adaptateurs hétéroduplex ADN/ARN utilisés pour la transcription inverse de l’échantillon DMS-MaPseq sont les mêmes que ceux listés dans Xu et al.7 et référencés par Schärfen et al.10.
    1. Pour l’adaptateur hétéroduplex ADN/ARN qui sera utilisé pour la transcription inverse de l’échantillon CoSTseq, utilisez un adaptateur avec un « G » dans la région de surplomb. Cela permettra à G de capturer la biotine-C à l’extrémité 3' de l’ARN. Si vous utilisez un NTP biotinylé différent, modifier l’amorce d’ADN hétéroduplex pour que le nucléotide d’appariement approprié soit le surplomb (voir Tableau 2).
    2. Pour l’adaptateur DMS-MaPseq, assurez-vous qu’il y a un seul surplomb N, étant donné que l’extrémité 3' sera aléatoire après fragmentation. Pour un aperçu des étapes suivantes de préparation à la bibliothèque, voir la Figure 2.
  2. Préparation d’un hybride ADN/ARN pour le changement de gabarit : Préparer 1 μM d’amorces ARN R2 et ADN R2R dans un tampon composé de 10 mM de Tris-HCl, pH 7,5 et 1 mM EDTA. Faites couver le mélange d’amorce à 82 °C pendant 2 minutes, puis refroidissez à 25 °C à un rythme de 0,1 °C/s. Alignez le mélange et congelez pour une utilisation ultérieure.
  3. Transcription inverse par commutation de modèle
    1. Ajoutez les réactifs suivants et incubez pendant 30 minutes à température ambiante : 2 μL de tampon de réaction 5x, 1 μL d'1 μM ADN/ARN hétéroduplex (utiliser hétéroduplex contenant un seul surplomb G pour l’échantillon CoSTseq ; utiliser un hétéroduplex contenant un surplomb aléatoire d’N pour l’échantillon DMS-MaPseq), 0,5 μL d’enzyme, 0,5 μL inhibiteur de RNase, 3,75 μL d’échantillon d’ARN (ou ajouter de l’eau pour atteindre 7,75 μL de volume total).
    2. Incubez ce mélange (sans dNTP) pendant 30 minutes en temps de réanimation. Ensuite, ajoutez 1,25 μL de 10 mM dNTP à la réaction et appliquez les conditions de cycle suivantes dans un thermocycleur : 25 °C pendant 10 minutes, 42 °C pendant 10 minutes, 50 °C pendant 10 minutes, 55 °C pendant 10 minutes, 60 °C pendant 30 minutes, 65 °C pendant 20 minutes, 75 °C pendant 15 minutes.
    3. Ajoutez 1 μL de RNase H et incubez à 37 °C pendant 20 minutes. Purifiez la réaction PCR à l’aide d’une méthode de purification de l’ADN en colonne pour éliminer les amorces, nucléotides et enzymes restants. Élute dans un volume final de 20 μL.

figure-protocol-1
Figure 2 : Représentation schématique détaillée de la préparation de la bibliothèque CoSTseq. L’ARN naissant portant une extrémité biotinylée à 3' est incubé avec un adaptateur de commutation gabarit contenant un surplomb G complémentaire à la biotine-CTP. Pour l’ARN mature fragmenté (DMS-MaPseq), un adaptateur avec surplomb N-en est utilisé (voir Figure 1). La synthèse de cDNA est réalisée à l’aide d’une transcriptase inverse hautement processive, telle que la transcriptase inverse des introns thermostable du groupe II (TGIRT), suivie d’un traitement à la RNase H pour dégrader le brin d’ARN. Par la suite, la ligase ADN/ARN d’application 5' relie l’extrémité 5' adenylée par le ribose (rA pp) du liaiseur UMI N7 au 3' OH de l’ADNc simple brin. L’adaptateur UMI N7 comprend une extrémité 3′ bloquée, empêchant l’auto-ligation entre les adaptateurs. Enfin, l’amplification PCR est réalisée à l’aide d’amorces incluant des régions superposées et des surplombs de 5′ portant des codes-barres uniques Illumina i5 et i7 attribués à chaque échantillon. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

7. Ligation adaptateur 5' pour la préparation des bibliothèques finales d’ADNc pour le séquençage par balises à extrémités appariées

  1. Préparation de l’adaptateur 5' à extrémité
    1. Adénylate l’adaptateur à l’extrémité 5' utilisant une réaction à base de ligase ARN (par exemple, ligase d’ARN M, listée dans le tableau des matériaux) avec les composants de réaction suivants : 8 μL de tampon de réaction d’adénylation 10x 5' ADN, 8 μL de 1 mM ATP, 100 μM d’ADN R1R (il s’agit de l’amorce TruSeq contenant un identifiant moléculaire unique ou UMI), 8 μL de ligase M-ième ARN, 52 μL d’eau sans nucléase.
      REMARQUE : Pour les détails concernant la conception de l’adaptateur UMI N7 , voir le tableau 2 et la figure 2.
    2. Incubez cette réaction à 65 °C pendant 1 heure, puis à 85 °C pendant 5 minutes. Procéder à la purification du produit par précipitation EtOH ou par une méthode de nettoyage de l’ADN basée sur une colonne de spin à membrane de silice pour isoler l’ADNc, conformément aux instructions du fabricant.
    3. Pour la précipitation d’EtOH, l’ADN peut être précipité à -20 °C (minimum 20 min) à l’aide d’acétate de sodium (pH 5,2) à une concentration finale de 0,3 M et 2x-2,5x de 95 % à 100 % d’EtOH froid. Centrifugez la réaction précipitée par l’EtOH pendant 15 minutes à vitesse maximale dans une centrifugeuse pré-refroidie (4 °C), lavez la pellete avec 70 % d’EtOH, récentrifugez et faites sécher la pellete à l’air. Resuspendez (ou éluvez, si vous utilisez une colonne de spin) le pellet dans 40 μL d’eau sans nucléase. Conserver à -20 °C sur le long terme.
  2. Ligature adaptateur 5'
    1. Pour un volume de réaction unique de 20 μL, ajoutez les composants suivants à 10 μL d’ADN c : 2 μL de tampon 10x NE 1, 2 μL de 50 mMMnCl 2, 2 μL de ligase AppDNA/ARN 5', 4 μL de 10 μM (100 ng/μL) de l’adaptateur adénylé de l’étape 7.1.
    2. Incubez cette réaction à 65 °C pendant 1 heure, puis 3 minutes à 90 °C. Nettoyez la réaction à l’aide du kit de purification PCR minElute et éluez dans un volume final de 20 μL d’eau sans nucléase.
  3. Amplification PCR minimale des bibliothèques d’ADNc avec test pilote
    1. Avant de procéder, préparez un stock de 10 μM d’amorces indicielles contenant des codes-barres uniques. Chaque échantillon unique de CoSTseq ou DMS-MaPseq doit être associé à un code-barres unique pour une analyse en aval fluide. Voir les séquences d’amorces dans le tableau 2. Les amorces individuelles contenant des codes-barres directs et inverses peuvent être combinées dans un mélange 1:1 et stockées sous forme de prémix à code-barres.
    2. En utilisant 2 μL du produit PCR de l’étape 7.2, ajouter 2,5 μL de tampon PCR haute fidélité (par exemple, un tampon HiFi commercial), 0,375 μL de dNTP (10 mM), 0,75 μL de prémix à barres (ou 0,375 μL d’amorces uniques i5 et i7 individuelles), 0,25 μL de polymérase ADN à démarrage chaud haute fidélité (par exemple, enzyme commerciale HiFi à démarrage à chaud), 6,625 μL d’eau sans nucléase.
    3. Incubez cette réaction à 95 °C, puis répétez [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] pendant 23 cycles, terminant par une incubation de 1 minute à 72 °C. Utilisez un gel d’agarose à 1 % pour déterminer le nombre optimal de cycles.
      REMARQUE : Pour tester des conditions de cyclage plus faibles, un échantillon peut être préparé à la fin d’un cycle inférieur (par exemple, fin de 15 ou 16 cycles) et appliqué sur un gel d’agarose afin de comparer l’intensité du frottis de la bibliothèque d’ADNc sur un gel d’agarose sur plusieurs longueurs de cycle.
  4. PCR finale pour amplification de bibliothèque
    1. En utilisant 18 μL du produit PCR de l’étape 7.2, ajoutez ce qui suit du kit PCR HiFi KAPA : 22,5 μL de tampon PCR haute fidélité, 3,375 μL de dNTP (10 mM), 6,75 μL de prémix à barres (ou 3,375 μL d’amorces uniques i5 et i7 individuelles), 2,25 μL de polymérase ADN à démarrage chaud haute fidélité, et 59,625 μL d’eau sans nucléase.
    2. Incubez cette réaction à 95 °C, puis répétez [15 s 98 °C, 30 s 62 °C, 30 s 72 °C] pour le nombre de cycles déterminé à l’étape 7.3. Terminez par une incubation de 1 minute à 72 °C.
  5. Sélection de taille
    1. Effectuer la sélection de taille sur le produit PCR en utilisant une purification à base de billes paramagnétiques (par exemple, AMPure XP ou équivalent). Utilisez 1,3 fois le volume de billes (par exemple, pour une réaction PCR de 50 μL, utilisez 65 μL de boue de billes) et mélangez bien jusqu’à ce qu’elles soient homogènes. Laissez les billes lier l’échantillon pendant 10 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Ce rapport échantillon/billes de 1:1,3x permet de retirer les dimères adaptateurs d’amorce et garantit que les fragments d’ADN conservés ne sont pas inférieurs à 150 pb et pas plus grands que 800 pb.
    2. Retirez le surnageant sans déranger les billes et procédez à laver les billes avec 80 % d’EtOH selon le protocole du fabricant.
    3. Éluser le produit final à 11 μL. Faire passer 1 μL sur un gel d’agarose pour vérifier les bibliothèques. Soumettez le produit final pour séquençage.

8. Analyse des données

REMARQUE : Le package complet de CoSTseq et le code d’analyse sont disponibles sur GitHub (https://github.com/NeugebauerLab/CoSTseq), et le flux de travail pour l’analyse est montré à la Figure 3. Ce pipeline est conçu pour gérer à la fois les données de séquençage CoSTseq et DMS-MaPseq. CoSTseq utilise Snakemake, un flux de travail bioinformatique qui paralléllise facilement l’analyse en optimisant le nombre de cœurs CPUdisponibles 19. Le flux de travail est défini par un Snakefile, qui consiste en un ensemble de règles établissant les analyses à exécuter. Il n’est pas nécessaire de modifier le fichier Snakefile disponible lors de l’installation du package GitHub.

  1. Ajustez le fichier de configuration (fichier .yaml) avec les chemins de fichiers corrects vers l’endroit où les données brutes sont stockées. Dans ces réglages, il devrait y avoir un chemin vers les séquences d’adaptateurs et les noms d’échantillons associés. Modifie le fichier de configuration pour exécuter des analyses spécifiques définies dans le fichier Snake.
  2. Pour commencer l’analyse, téléchargez les lectures brutes en fin de fastq.gz format. Les lectures de procédé utilisent fastp20 pour couper les séquences d’adaptateurs et le filtre qualité pour les lectures avec des scores Phred d’au moins 20. Alignez ces lectures au génome de référence en utilisant STAR21 pour générer des fichiers BAM.
  3. À titre de confirmation supplémentaire, visualisez les fichiers BAM générés après avoir exécuté le pipeline d’analyse CoSTseq dans le navigateur Integrated Genome Viewer (IGV). Avec IGV, les fichiers BAM devraient être facilement interprétables pour afficher des lectures sur toutes les parties des gènes d’intérêt, indiquant que les lectures représentent de l’ARN naissant. Comme prévu, les lectures d’ARN mature devraient présenter une couverture minimale aux régions introniques, étant donné que ces lectures devraient être dérivées de transcrits matures et probablement efficacement épissés.
  4. Utilisez la sortie fastp (un fichier .html qui peut être ouvert dans un navigateur web) pour un pourcentage estimé de lectures dupliquées. Notez que les lectures de CoSTseq peuvent être très fortement dupliquées, ce qui souligne la critique de l’étape suivante.
  5. En utilisant UMICollapse22, dédupliquer les lectures pour effondrer les lectures avec des UMI et alignements identiques, permettant de préserver uniquement les lectures uniques et d’atténuer le biais PCR. Les fichiers résultants doivent être exempts de lectures dupliquées et au format BAM, où les lectures alignées sur l’ARNr seront séparées de celles associées aux gènes non-ARNr.
  6. Pour le dernier composant majeur du pipeline modulaire CoSTseq, utilisez une implémentation Python personnalisée pour calculer le nombre de mutations et la couverture de lecture sur chaque nucléotide. Les fonctions décrivant cette implémentation se trouvent dans le code source sur GitHub, et le fichier Snake détaille l’entrée, la sortie, les paramètres et les fonctions pour générer ces données stockées au format .pkl.
    REMARQUE : Il existe une multitude d’autres analyses pouvant être réalisées en utilisant le pipeline d’analyse CoSTseq, bien que les paramètres puissent nécessiter une optimisation pour des besoins d’analyse personnalisés. Une méthode précieuse adaptée pour CoSTseq est HDProbe, un paquet R qui permet des comparaisons génomiques des taux de mutation10. En résumé, HDProbe nécessite des données de tous les réplicats et peut catégoriser méthodiquement les différences significatives de taux de mutation par rapport au témoin. D’autres types d’analyses que l’on peut souhaiter réaliser incluent la prédiction de structure basée sur les réactivités expérimentales du DMS. Cela peut être réalisé à l’aide du packageRNAstructure 23.

figure-protocol-2
Figure 3 : Étapes d’analyse et résultats attendus du pipeline d’analyse modulaire CoSTseq. Étapes d’analyse, indiquant l’utilisation recommandée des outils existants en plus du pipeline d’analyse CoSTseq prêt à l’emploi avec les fichiers de sortie et le contenu attendus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette section présente les résultats réels générés par la mise en œuvre du flux de travail et de l’analyse CoSTseq, tels que décrits dans ce protocole. Tout d’abord, cette section décrit les résultats attendus après l’évaluation de la qualité des préparations réussies de la bibliothèque avant et après le séquençage. Avant le séquençage, les chercheurs peuvent utiliser une analyse PCR test et TapeStation pour confirmer la présence d’ARN après enrichissement de biotine. Cela indique un iso...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’ARN commence à se replier co-transcriptionnellement en raison d’une cinétique plus rapide de l’appariement de bases comparé au taux de synthèse 24,25,26,27. Nos connaissances actuelles sur le repliement de l’ARN naissant proviennent d’études monomoléculaires d’ARN procaryotes, de sondes in vitro ou d’approches in silico. Dans ce protocole, u...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs tiennent à remercier le Dr SK Boopathy Jegathambal pour son codage et les membres du laboratoire Neugebauer, en particulier P. Bech, pour leurs discussions utiles. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (R01GM112766 à KMN) et une bourse prédoctorale de l’American Heart Association (908949 à LS). LPS a été soutenu par une subvention de formation des NIH 5T32GM14943803. LRAB a été soutenu par une bourse postdoctorale de l’American Heart Association (26POST1569544). L’acquisition de données au Yale Center for Genomic Analysis a été soutenue par le National Institute of General Medical Sciences des National Institutes of Health sous le numéro 1S10OD03036301A1. Ce travail relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles des NIH.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ATP 10 mMInvitrogen18330019
10 mM de biotine-11-CTPBiosciences de JenaNU-831-BIOX
10mM GTPInvitrogen18332015
10mM UTPInvitrogen18333013
10X NEBuffer 1New England BiolabsB7001SUtilisé à l’étape 7.2.1
10X Solution Saline Tamponnée au Phosphate (PBS)Gibco70011-044
20 % SDSRPI  ;L23100-500
Phénol acide : chloroforme & nbsp ;AmbionAM9722
Des perles AMPure XP pour la sélection de la tailleBeckman Coulter  ;A63880Utilisé pour la sélection de taille à l’étape 7.5.1
Bacto PeptoneGibco211677
Extrait de levure bactoGibco212750
VéloSigma AldrichB3876-100G
ChloroformeSigma Aldrich319988
D-(+)-GLUCOSESigma AldrichG5767-500G
DIFCO AGARBD DIFCO214010
Sulfate de diméthyleSigma AldrichD186309-5ML
Dynabeads & commerce ; MyOne Streptavidine C1 perles   ;Invitrogen65001Utilisé pour le pulldown de biotine dans la section 4.1
Dynabeads & commerce ; ARNm DIRECT & TRADE ; Purification KitInvitrogen61011Utilisé pour la sélection Poly A dans la section 5.1
EDTA, pH 8, 0,5MSigma Aldrich & nbsp ;03690-100ML
ÉthanolSigma AldrichE7023-500ML
GlycoBlueInvitrogenAM9516Co-précipitant utilisé aux étapes 4.2.7 et 5.2.4
Induro & reg ;   ; Transcriptase inverseNew England BiolabsM0681SEnzyme RT utilisée à l’étape 6.3.1
Alcool isoamyliqueSigma Aldrich & nbsp ;W205710-1KG-K
IsopropanolJT-BAKER9084-05-01
Kit PCR KAPA HiFi HotStart   ;   ;Roche07958889001DNA Pol haute fidélité utilisé dans les versions 7.3.2 et 7.4.1 pour les réactions PCR
Chlorure de magnésiumSigma AldrichSLCM2154
MinElute PCR Purification KitQiagen28004Utilisé pour le nettoyage de l’ADN aux étapes 6.3.3 et 7.2.2
Ligase de l’ARN M-ièmeNew England BiolabsM2611A
Oligo Clean & ConcentrateurZymo ResearchD4060Suggéré pour le nettoyage d’ADN Oligo à l’étape 7.1.2
Acétate de potassium & nbsp ;Sigma Aldrich236497-500G
Chlorure de potassiumJT Baker3040-01
Hydroxyde de potassiumAvantor6984-04-01
ARN Clean & Clean ; Concentrateur-5Zymo ResearchR1014Kit de nettoyage ARN utilisé à l’étape 5.3.2 après le traitement PNK
RNaseOUT & trade ; Inhibiteur de la ribonucléase recombinanteThermo Fisher Scientific10777019Inhibiteur de RNase utilisé à l’étape 5.3.1 lors du traitement par PNK
SarkosylIBI ScientificIB07080
Acétate de sodiumQualité biologique351-035-721
Chlorure de sodiumSigma AldrichS5150-1L
Hydroxyde de sodium & nbsp ;Macron7708-10
SUPERase· ; En Commerce ; Inhibiteur RNase (20 U/&mu ; L)Thermo Fisher ScientificAM2696Inhibiteur de RNase utilisé à l’étape 6.3.1
T4 Polynucléotide kinaseNew England BiolabsM0201S
Thermostable 5' App ADN/ARN LigaseNew England BiolabsM0319L
Tris-HCl, pH 7,4, 1MThermo ScientificJ60202. K2
Triton X-100TEKNOVAT1105
TRIzol&trade ; RéactifInvitrogen15596-026Pour l’élution de l’ARN naissant dans la Section 4.2 ; également appelé « réactif ARN » à la Section 4
&beta ;-mercaptoéthanolSigma AldrichM6250-1L

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