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Article de méthode

Nouveau modèle de rat de thrombose veineuse veineuse sévère établi par combinaison de semi-ligature, chlorure ferrique et thrombine

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DOI :

10.3791/69961

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13 février 2026

 , 
1Department of Emergency, Xuanwu Hospital, Capital Medical University, 2Department of Neurology, The People's Hospital of Qingxian

Dans cet article

Résumé

Le nouveau modèle chez le rat de thrombose veineuse cérébrale sévère (CVST), construit par semi-ligature combinée à du chlorure ferrique et de la thrombine, peut mieux imiter le mécanisme physiopathologique du CVST sévère chez l’humain.

Résumé

La thrombose du sinus veineux cérébral (CVST) est un type distinct d’AVC qui touche principalement les jeunes personnes, en particulier les femmes enceintes. Environ 60 % des patients atteints de CVST développent un infarctus veineux cérébral ou une hémorragie, définie comme une CVST sévère. Actuellement, diverses méthodes sont employées tant au niveau national qu’international pour induire la CVST chez des modèles animaux. Cependant, ces modèles ne parviennent pas à reproduire pleinement les mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux TSVC sévères, limitant ainsi la recherche fondamentale sur cette pathologie. Un nouveau modèle chez le rat de CVST sévère peut être établi par semi-ligature en combinaison avec du chlorure ferrique et de la thrombine. La semi-ligature a été réalisée en mesurant le flux sanguin cérébral (CBF) dans la région d’intérêt (ROI) avant et après la ligature du sinus sagittal supérieur (SSS) à l’aide d’un imageur de perfusion (PSI). La semi-ligature du SSS induit une stase sanguine dans le sinus veineux. L’application topique de chlorure ferrique à la surface du SSS entraîne des lésions endothéliales, tandis que l’injection directe de thrombine dans le sinus crée un état hypercoagulable localisé. Cette approche imite efficacement les trois composantes clés de la formation de la thrombose : la stase, les lésions endothéliales et l’hypercoagulabilité. Le modèle résultant présente une charge thrombotique importante impliquant simultanément plusieurs sinus veineux. Le thrombus induit reste stable pendant au moins une semaine. La coloration au chlorure 2,3,5-triphényltétrazolium (TTC) démontre que ce modèle peut produire de manière constante un infarctus veineux cérébral de grande surface, qui persiste jusqu’à 7 jours. Ce modèle peut même induire des crises d’épilepsie chez les rats, une capacité que les modèles précédents n’avaient pas pu atteindre. La rupture de la barrière hémato-encéphalique a été observée à l’aide de la coloration bleu d’Evans (EB). Ainsi, le modèle sévère de CVST établi par semi-ligature combinée à l’administration de chlorure ferrique et de thrombine reproduit plus précisément la progression physiopathologique du CVST sévère chez l’humain, démontrant stabilité et fiabilité.

Introduction

La thrombose du sinus veineux cérébral (CVST) est une forme distincte de trouble cérébrovasculaire qui diffère de l’AVC artériel. Elle survient plus fréquemment chez les personnesplus jeunes 1,2, en particulier chez les femmesenceintes 3, et son incidence a augmenté régulièrement ces dernières années. Une étude épidémiologique menée en Australie indique que l’incidence annuelle du CVST varie de 13,0 à 15,7 cas par milliond’individus 4. Aux États-Unis, l’incidence du CVST présente une tendance à la hausse avec l’âge. Néanmoins, l’âge maximal d’apparition chez les femmes est inférieur à celui deshommes de 5 ans. Entre 2021 et 2023, 43 patients pour million ayant consulté les urgences aux États-Unis ont été diagnostiqués avec unCVST 6. En milieu clinique, la thrombose des sinus multiples est la forme la plus fréquemment observée, représentant environ 57,14 % de tous les cas. Cela est suivi par l’atteinte du sinus sagittal supérieur (SSS ; 16,19 %), du sinus transverse (11,43 %) et du sinus sigmoïde (8,57 %). Les principales manifestations cliniques incluent les maux de tête, pouvant être accompagnés d’épilepsie, des troubles de la conscience et des symptômes neurologiquesfocaux 7,8,9. Cependant, ces manifestations ne sont pas spécifiques. Environ 60 % des patients atteints de CVST développent un infarctus veineux cérébral ou une hémorragie, classée comme un CVSTsévère 10,11. Bien que le traitement du CVST inclue une thérapie anticoagulante et une intervention chirurgicale, le taux de mortalité du CVST sévère reste jusqu’à 34,2 %. Cette forte mortalité peut être attribuée au fait que les mécanismes physiopathologiques sous-jacents à la TSVC sévère ne sont pas encore pleinement compris. Un modèle animal approprié de la CVST sévère est donc un outil expérimental essentiel pour étudier sa pathogenèse, sa progression physiopathologique et ses stratégies thérapeutiquespotentielles 12.

Actuellement, les méthodes pour induire les modèles animaux CVST peuvent généralement être classées dans les catégories suivantes : ligaturepermanente 13,14, inductionchimique 15,16,17, approches interventionnelles 18,19, implantation de greffonsauto-fabriqués 20,21,22, et électrocoagulation bipolaire 23,24. Le thrombus induit par les modèles animaux précédents a eu une courte durée et n’a pas pu provoquer simultanément plusieurs thrombes veineux des sinus et un infarctus veineux cérébral de grande surface. Par conséquent, le développement d’un modèle de TSVC sévère impliquant simultanément plusieurs sinus veineux est devenu une priorité urgente. La méthode de semi-ligature combinée au chlorure ferrique et à la thrombine peut établir un nouveau modèle chez le rat de CVST sévère. De plus, le nouveau modèle de CVST sévère simule plus fidèlement le processus physiopathologique humain du CVST sévère à travers trois aspects clés : la charge du thrombus du sinus veineux, l’infarctus cérébral veineux et la perturbation de la barrière hémato-encéphalique. Ce modèle est applicable à la recherche sur les mécanismes physiopathologiques et les stratégies thérapeutiques pour le TSVC sévère. Ce nouveau modèle de rat pourra être utilisé à l’avenir pour étudier le mécanisme physiopathologique du TSVC sévère.

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Protocole

Le protocole expérimental a été approuvé par le Comité des expériences animales et du bien-être expérimental des animaux de la Capital Medical University (AEEI-2020-119) à Pékin, en Chine, et a été réalisé conformément aux règlements du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’institution.

1. Préparation animale

  1. Assignez au hasard des rats mâles Sprague-Dawley (SD) adultes en bonne santé, avec un poids corporel moyen de 300 ± 10 g, soit au groupe expérimental, soit au groupe opératoire simulé. Tous les animaux étaient maintenus selon un cycle alterné de 12 heures lumière/obscurité avec accès à nourriture et eau à volonté de manière indépendante.

2. Application de la PSI

  1. Utilisez la PSI pour surveiller en continu les altérations du flux sanguin cérébral (CBF) au sein du SSS des rats tout au long du processus de modélisation. Sélectionnez une aire circulaire fixe au sein du SSS comme région d’intérêt (ROI). En surveillant les changements du ROI dans le CBF lors de la chirurgie, on détermine l’achèvement de la semi-ligature et le succès de l’induction par thrombus.

3. Établissement du modèle de rat sévère à la CVST

  1. Anesthésiez les rats en utilisant 5 % d’enflurane, avec un mélange gazeux composé de 70 % de protoxyde d’azote et 30 % d’oxygène délivré via un masque anesthésique. Maintenez la concentration d’enflurane dans une fourchette de 1 % à 2 % tout au long de l’opération. Placez les rats anesthésiques en position couchée, la tête fixée à la ligne médiane à l’aide d’un cadre stéréotaxique. Maintenez la température corporelle à 37 ± 0,5 °C tout au long de l’opération à l’aide d’un coussin chauffant thermostatique.
  2. Réaliser une incision longitudinale de 1,5 cm le long de la ligne médiane de la région crânienne du rat. Disséquez le tissu sous-cutané pour exposer le crâne sous-jacent.
  3. Sous visualisation microscopique, créez une fenêtre crânienne longitudinale (10 x 4 mm) entre le bregma et le lambda à l’aide d’une perceuse dentaire à grande vitesse. Exposez le SSS et le cortex cérébral bilatéral tout en préservant l’intégrité de la dure-mère. Lors du forage crâné, refroidissez la mèche en continu avec du sérum physiologique normal pour éviter les dommages thermiques à la dure-mère et au cortex.
  4. Après exposition au SSS, évaluez le CBF du ROI dans le SSS à l’aide du PSI, et enregistrez les données correspondantes. Semi-ligater le SSS rostralement et caudal en utilisant un 8-0 Points de suture en polyamide sous observation microscopique.
    REMARQUE : Lors de la ligature du SSS, la force doit être modérée et non excessive. Sinon, un effet de semi-ligature ne peut pas être obtenu. La ligature devrait idéalement être réalisée lors d’une seule procédure continue. Des tentatives répétées de ligature peuvent entraîner une perforation du SSS, compromettant ainsi le succès de la fabrication du modèle.
  5. Utilisez le PSI pour évaluer le CBF du ROI situé au segment ligaturé du SSS, confirmant que le CBF avait diminué à environ 50 % de ce qu’il y avait avant la semi-ligaturade. Notez les résultats de façon systématique.
  6. Dans des conditions protégées par la lumière, plongez un fil de soie 3-0 de 7 mm de longueur dans 40 % de chlorure ferrique et utilisez-le pour recouvrir la surface du site de ligature SSS pendant une durée de 5 minutes. Lavez le champ avec du sérum physiologique normal après avoir retiré le fil de soie.
  7. Injectez 0,1 mL de solution de thrombine (500 U/mL) dans la cavité sinusale du segment ligaturé à l’aide d’un microinjecteur en moins de 1 minute. Répétez l’injection deux fois de suite, pour une dose totale de thrombine de 150 U. Le reflux de thrombine dans l’espace épidural n’a pas conduit à une mauvaise thrombose.
    1. Pour faciliter l’injection de la thrombine dans le SSS, pliez doucement l’aiguille du micro-injecteur avant l’insertion. Ce réglage permet un meilleur contrôle de l’angle de l’aiguille lors de la perforation et aide à prévenir une pénétration involontaire à travers le SSS.
  8. Réévaluer le CBF du ROI en utilisant le PSI après l’injection de thrombine. Assurez-vous que les résultats confirment une diminution significative de la CBF par rapport à celle qui suit la semi-ligaturade, indiquant une induction réussie de la thrombose. Enregistrer les données de manière systématique pour une analyse plus approfondie.
  9. Scellez la fenêtre osseuse avec de la cire osseuse, suivie de la suture de l’incision. Après l’intervention, administrez du kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée à chaque rat pour soulager la douleur postopératoire.
  10. Dans le groupe opératoire simulé, effectuer uniquement la craniotomie, sans interventions chirurgicales supplémentaires.

4. Charge de la thrombose du sinus veineux et infarctus cérébral

  1. Évaluez la charge de la thrombose du sinus veineux à trois moments : 1 jour, 2 jours et 7 jours après la création du modèle. Sacrifiez des rats et effectuez une perfusion cardiaque avec une solution saline normale à différents moments.
  2. Effectuer une craniotomie pour évaluer visuellement l’étendue de l’atteinte de la thrombose du sinus veineux. Isoler le thrombus et soumettre à une analyse quantitative. Exciser le tissu cérébral et le sectionner en tranches coronales de 2 mm d’épaisseur.
  3. Immergez les tranches dans une solution à 2 % pour essayer de croire et incubez dans un bain-marie à 37 °C pendant 20 minutes pour faciliter la coloration. Ensuite, évaluez visuellement l’infarctus veineux cérébral et quantifiez le volume de l’infarctus à l’aide du logiciel ImageJ pour une analyse statistique ultérieure.
    Volume d’infarctus = surface d’infarct en mm carrés x épaisseur [2 mm]

5. Perturbation de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique (BBB)

  1. Le deuxième jour suivant l’opération, sélectionnez au hasard des rats du groupe modèle et du groupe d’opération simulée et administrez une injection intraveineuse de bleu d’Evans (EB) à 2 % à travers la veine caudale.
  2. Après 2 heures d’administration réussie de l’injection, euthanasiez les rats, puis perfonez avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) à travers le ventricule gauche. Prélever les tissus cérébraux et les sectionner en tranches de 2 mm d’épaisseur pour évaluer l’étendue de la pénétration de l’EB.

6. Analyse statistique

  1. Réalisez une analyse statistique à l’aide du logiciel SPSS 17.0. Présenter les données de mesure comme moyenne ± écart-type. Utilisez l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) ou un test t d’échantillons indépendants pour les comparaisons de groupes.
  2. Pour l’analyse de variables continues mesurées à plusieurs points temporels du même groupe, utilisez des mesures répétées ANOVA pour évaluer les différences entre groupes entre les différents temps. Une valeur p inférieure à 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

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Résultats

Processus de modélisation
La figure 1A représente le SSS du rat, comme indiqué par la flèche. Le rostral et le caudal du SSS ont été semi-ligés (Figure 1B), suivis d’application d’un fil imbibé de chlorure ferrique sur la surface des régions ligiguées (Figure 1C). La thrombine a ensuite été injectée dans les segments ligés pour induire la thrombose. La zone indiquée par la flèch...

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Discussion

Un nouveau modèle chez le rat de CVST sévère construit par semi-ligature combinée à du chlorure ferrique et de la thrombine ne peut pas seulement simuler la stase sanguine et les lésions endothéliales, mais aussi l’état hypercoagulable du sang, c’est-à-dire qu’il simule les trois éléments de la formationde la thrombose 25. Ce qui est encore plus excitant, c’est que le modèle de rat développé avec cette méthode est capable de provoquer des crises d’épilepsie. Les c...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Nous remercions l’Institut des maladies critiques du cerveau de la Capital Medical University pour son soutien technique. Cette étude a été soutenue par la Fondation des sciences naturelles de Pékin (n° 7182064).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2,3,5-triphényltétrazolium chlorureSigma-Aldrich
40 % chlorure ferrique   ;Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd., Chine
Evans blue  ;Sigma-Aldrich
Bouillotte & nbsp ;Appareil Harvard Holliston, MA, États-Unis50-7061-f,   ;
Perceuse dentaire à grande vitesse & nbsp ;Saeshin, Busan, Corée du SudStrong-207B
Posemètre laser à speckles & nbsp ;Système PSI PeriCam, Suède
MicroscopeCarl Zeiss, Inc., Berlin, Allemagne
Suture en polyamide   ;Usine de micro-appareils Ningbo Chenghe, Chine
Cadre stéréotaxiqueDavid Kopf Instruments, Tujunga, Californie, États-Unis
ThrombineChang Chun Lei Yunshang Pharmaceutical Co., Ltd., Chine

Références

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