Cryosectionnement d’implants synthétiques biocompatibles utilisant une résine UV curable pour une analyse d’immunofluorescence améliorée

Résumé

Ce travail présente un protocole de cryosectionnement utilisant la stabilisation par résine curable par UV pour maintenir l’intégrité de l’interface implant-tissu tout en préservant l’accessibilité des antigènes, permettant une analyse fiable et à haute résolution par immunofluorescence des implants polymères synthétiques.

Résumé

L’évaluation histologique des implants synthétiques biocompatibles pose d’importants défis techniques en raison de l’incompatibilité entre les méthodes conventionnelles de traitement tissulaire et les propriétés physicochimiques de ces matériaux. Les approches actuelles utilisant l’inclusion complète de la résine assurent une préservation structurelle adéquate mais compromettent gravement l’accessibilité des épitopes, limitant ainsi les applications immunohistochimiques essentielles à la caractérisation des réponses immunitaires de l’hôte. Inversement, l’incorporation conventionnelle de paraffine présente une mauvaise adhésion aux substrats synthétiques et limite la sélection des anticorps pour un profilage immunologique complet. Les protocoles standards de cryosection renforcent la compatibilité immunohistochimique en améliorant la préservation de l’antigène ; Cependant, ces méthodes aboutissent souvent à une intégrité structurelle insuffisante des spécimens contenant des implants, compromettant l’évaluation morphologique et la qualité du sectionnement. Pour remédier à ces limitations, un nouveau protocole de traitement a été développé intégrant une résine curable par UV pour la stabilisation sélective des tissus implantés avant la cryosection. Cette méthodologie utilise une résine photopolymérisable pour fournir un support mécanique tout en préservant l’accessibilité de l’épitope et les déterminants antigéniques, qui sont généralement compromis par la polymérisation complète de la résine. Le protocole permet la génération reproductible de sections de haute qualité à une épaisseur optimale pour l’évaluation de l’immunofluorescence, assurant une préservation structurelle supérieure à la coupe congelée standard sans la réticulation étendue qui limite la pénétration des anticorps dans les échantillons conventionnels intégrés en résine. Cette approche représente une solution pratique et rentable pour le traitement histologique des implants synthétiques, offrant des capacités analytiques renforcées pour l’évaluation de la biocompatibilité et facilitant la caractérisation détaillée des réponses immunitaires locales aux interfaces implant-tissu.

Introduction

La microscopie à immunofluorescence est une technique analytique essentielle en médecine régénérative, facilitant la visualisation de l’architecture tissulaire et de la composition cellulaire à l’aide d’anticorps conjugués au fluorophore. Cette méthodologie intègre la spécificité moléculaire de la reconnaissance immunochimique à la sensibilité et à la polyvalence de la détection de fluorescence, permettant une observation détaillée des distributions cellulaires des cibles dans leurs microenvironnements tissulaires. Les approches d’immunofluorescence englobent à la fois des stratégies de marquage direct et indirect, les protocoles d’immunofluorescence indirecte offrant une amplification du signal améliorée via des systèmes secondaires d’anticorps conjugués à divers fluorophores couvrant le spectre visible et proche^{infrarouge 1}. La capacité inhérente de la méthodologie à la détection simultanée multi-cibles par séparation spectrale facilite une caractérisation phénotypique complète des populations cellulaires hétérogènes et de leurs relations spatiales au sein de microenvironnements tissulaires^{complexes 2}.

Les capacités techniques de la microscopie à immunofluorescence vont au-delà de la localisation des protéines conventionnelles pour inclure des applications analytiques quantitatives, incluant les mesures d’intensité de fluorescence, les analyses de colocalisation et les évaluations de la distribution spatiale essentielles à la compréhension de la fonction cellulaire et de l’organisation^{tissulaire 3}. Dans le cadre de la recherche sur la biocompatibilité des implants, l’analyse par immunofluorescence fournit des informations essentielles sur les réponses immunitaires de l’hôte, y compris les réactions des corps étrangers, les cascades inflammatoires et les processus d’intégration tissulaire qui déterminent l’acceptation ou le rejet de l’implant aux niveaux cellulaire et^{moléculaire 4}.

La mise en œuvre réussie des protocoles d’immunofluorescence nécessite une attention attentive aux méthodologies de traitement tissulaire qui préservent l’intégrité morphologique tout en maintenant le signal fluorescent et en minimisant l’autofluorescence de fond. La sélection traditionnelle du milieu d’immersion dépend du type de tissu, des besoins analytiques en aval et des antigènes spécifiques d’intérêt. Pour les matériaux synthétiques et les implants, la littérature actuelle recommande principalement un incrustation complète de résine afin de maintenir la stabilité structurelle lors des procédures de^{sectionnement 5}. Cependant, cette approche présente des limites importantes en raison de la nécessité d’ultramicrotomes spécialisés et de lames pour sectionner les blocs de résine polymérisée, ce qui représente un investissement important en équipements et une expertise technique. L’incorporation par paraffine, tout en assurant un support structurel adéquat pour la sectionnement, introduit des modifications conformationnelles des déterminants antigéniques lors de la fixation et du traitement grâce à une déshydratation intensive, un durcissement chimique et une infiltration avec des solvants organiques capables de dénaturer les protéines et de masquer les épitopes. Le traitement par paraffine produit également des interférences autofluorescentes intrinsèques qui compromettent la détection du signal et l’analyse quantitative. Ces altérations nécessitent des procédures de récupération d’antigènes, généralement impliquant la récupération d’épitope induite par la chaleur (HIER) ou la récupération d’épitope induite par protéolytique (PIER), afin de restaurer l’accessibilité des^{anticorps 6}. Malgré ces interventions, de nombreux anticorps disponibles dans le commerce restent incompatibles avec les échantillons incorporés dans la paraffine, et les conditions de récupération sévères peuvent encore compromettre la qualité du signal fluorescent et introduire des artefacts de photoblanchiment.

La cryosection offre une méthodologie de traitement alternative pour les applications en immunofluorescence. Deux méthodes de cryoconservation peuvent être utilisées pour la préparation tissulaire. La première approche consiste à une cryoconservation rapide par immersion directe d’échantillons de tissus frais dans un bain d’isopentane pré-refroidi avec de l’azote liquide pour atteindre des températures inférieures à –20 °C, suivie d’un coupement à l’aide de microtomes cryostatiques équipés de chambres de coupe à température contrôlée. Le second protocole utilise une courte période de fixation dans le paraformaldéhyde (PFA) ou le formol, suivie d’une cryoprotection via une infiltration graduée de saccharose avant congélation. Le processus de cryoconservation crée une matrice rigide qui maintient l’intégrité des tissus tout en préservant les conformations protéiques natives essentielles à la reconnaissance des anticorps. La coupe congelée maintient les tissus dans un état proche de la nativité avec des modifications chimiques^{minimales 7}, réduisant ainsi le besoin de procédures de récupération antigénique agressives et permettant l’utilisation d’une gamme plus large d’anticorps primaires, y compris ceux incompatibles avec les tissus incrustés dans la paraffine en raison du masquage de l’épitope ou de la^{dénaturation 8}.

Le processus de cryosection utilise généralement un composé à température de coupe optimale (OCT), un milieu d’incorporation soluble dans l’eau composé d’alcool polyvinylique et de polyéthylène glycol, qui assure un soutien structurel lors du coupage tout en restant transparent et compatible avec les systèmes de détection de fluorescence. L’incrustation OCT facilite la génération de sections fines et uniformes d’une épaisseur allant de 5 à 15 μm, selon les besoins analytiques spécifiques et les caractéristiques^{tissulaires 9}. La préservation des conformations protéiques natives dans les sections gelées maintient des rapports signal/bruit optimaux essentiels à l’analyse quantitative de l’immunofluorescence, tout en conservant des épitopes intacts qui permettent l’utilisation d’une gamme plus large d’anticorps primaires, y compris ceux incompatibles avec les tissus plongés en^{paraffine 8}.

Cependant, la coupe des tissus congelés présente des défis techniques uniques, notamment lors du traitement de matériaux synthétiques d’implants possédant des propriétés physico-chimiques distinctes par rapport aux tissus biologiques natifs. La dilatation thermique différentielle entre polymères synthétiques et interfaces tissulaires biologiques lors de la congélation peut entraîner une contrainte mécanique localisée qui compromet l’intégrité structurelle et crée des artefacts de^{coupe 10}. De plus, la rigidité inhérente de nombreux matériaux synthétiques par rapport aux tissus biologiques gelés peut provoquer une déviation de la lame lors du coupage, entraînant une épaisseur de section inégale et des dommages à la fois à l’échantillon et à l’équipement de coupe. Ces limitations techniques nécessitent des protocoles de traitement spécialisés capables de répondre aux exigences uniques des échantillons contenant un implant tout en conservant les avantages du coupement congelé pour les applications d’immunofluorescence.

Pour remédier à ces limitations, cette étude a développé un protocole de cryosection combinant une stabilisation sélective à la résine UV curable avec des paramètres de coupe cryostatique contrôlés afin de permettre une analyse immunofluorescence multi-paramètre à haute résolution des constructions tissulaires implantées.

Protocole

Cette recherche a été réalisée conformément aux directives du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de la Mayo Clinic (IACUC) sous le numéro d’approbation A00003765-18-24. Toutes les procédures impliquant des implants synthétiques biocompatibles ont été réalisées dans des conditions stériles, conformément aux protocoles de biosécurité appropriés.

1. Traitement des échantillons et cryoprotection

REMARQUE : Manipulez exclusivement le formol dans une hotte chimique et portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, car le formol contient du formaldéhyde, un puissant irritant, un sensibilisant et un cancérogène puissant.

1. Fixer des échantillons synthétiques biocompatibles intégrés au tissu dans du formol tamponné neutre à 10 % pendant la nuit à 4° C en utilisant un minimum de 10 volumes de fixateur par rapport au volume tissulaire pour assurer une immersion complète et une pénétration adéquate. L’objectif de cette période de fixation limitée est d’obtenir un minimum de réticulation tout en préservant la morphologie tissulaire. ( Voir le tableau des matériaux pour les matériaux utilisés dans le protocole.)
2. Transférer les échantillons dans une solution de saccharose à 15 % préparée dans une solution saline tamponnée phosphate (PBS) pour une incubation nocturne à 4° C avec une agitation douce. Assurez-vous d’une infiltration complète du saccharose, comme en témoigne l’enfoncement des tissus.
3. Transférer les échantillons dans une solution de saccharose à 30 % dans PBS pour une seconde incubation nocturne à 4° C. Confirmer l’équilibrage complet par l’enfoncement du tissu au fond du récipient, indiquant une infiltration adéquate de saccharose et un déplacement d’eau.
4. Préparez un ratio volumétrique 1:1 de solution de saccharose à 30 % et de composé OCT. Incubez les échantillons dans ce milieu de transition pendant 2 h à 4° C, puis transférez à 100 % d’OCT pendant 1 h pour atteindre un équilibre complet, comme l’indique une apparence uniformément opaque du tissu.
5. Positionner soigneusement les échantillons dans des cryomoules standards remplis de composé OCT frais, assurant une orientation optimale pour les plans de sectionnement. Orientez-vous avec l’interface implant-tissu accessible pour les procédures ultérieures. Éliminez les bulles d’air à l’aide de pinces pré-refroidies.
6. Placez immédiatement des cryomoules remplis sur la plateforme de glace sèche afin de créer un gradient de température favorisant la formation rapide de cristaux de glace de bas vers le haut. Surveillez pendant 10 à 15 minutes jusqu’à la solidification complète, confirmée par l’aspect blanc opaque caractéristique du composé OCT congelé. Transférez les blocs congelés vers un stockage à –80° C ou directement dans la chambre du cryostat pour un coupage immédiat.

2. Installation du cryostat et sectionnement initial

1. Maintenez la chambre à température contrôlée par cryostat à –15° C. Vérifiez la température grâce à une surveillance numérique intégrée et équilibrez toute la nuit avant l’introduction de l’échantillon.
2. Installer de nouvelles lames jetables. Définir l’angle de la pale pour le coupement combiné de matériaux synthétiques et biologiques selon les spécifications du fabricant.
3. L’épaisseur de section désirée (50–100 μm) est programmée dans le cryostat en sélectionnant le réglage Épaisseur sur le panneau de contrôle, en ajustant à l’aide des flèches , et en confirmant le paramètre en appuyant sur la touche Set .
4. Avancez à travers l’échantillon intégré pour atteindre la profondeur prédéterminée correspondant à l’interface implant-tissu. Surveillez la surface avancée de la section pour identifier le plan optimal pour l’application de résine UV, caractérisée par des changements subtils d’opacité tissulaire et une exposition initiale à la périphérie de l’implant, et la profondeur est confirmée lorsque ces caractéristiques restent visibles de manière constante sur les sections successivement coupées.
   REMARQUE : Arrêtez immédiatement la section dès l’arrivée à l’interface critique pour empêcher l’avancement au-delà de la région cible.

3. Application de résine polyvalente aux UV

REMARQUE : Manipulez la résine polyvalente aux UV dans un espace bien ventilé tout en portant des équipements de protection appropriés et protégez les yeux et la peau des lumières LED-UV de durcissement (LED-UV). Ces résines contiennent des irritants pouvant provoquer des réactions cutanées et oculaires, et l’exposition aux LED aux UV peut entraîner des lésions oculaires induites par les UV.

1. Coupez le parafilm à l’aide de ciseaux à des dimensions de 2 à 3 mm dépassant le périmètre de l’implant. Séparez soigneusement du support en papier protecteur à l’aide de pinces stériles.
2. Distribuez 5 à 10 μL de résine UV sur la surface du parafilm exposée (Figure 1A). Le volume de résine est optimisé par la réalisation d’applications de test préliminaires dans lesquelles des volumes incrémentaux sont dispensés, et l’étalement obtenu est évalué visuellement afin d’assurer une couverture uniforme de la surface de l’échantillon sans débordement ni accumulation excessive de résine qui pourrait gêner le coupage.
3. Remplacez immédiatement le support en papier protecteur sur le parafilm chargé en résine. Appliquez un rouleau de couture en polyuréthane (2 pouces) avec une pression constante lors de passages parallèles et superposés, suivi de passages perpendiculaires pour obtenir une fine couche de résine uniforme (Figure 1B).
4. Retirez soigneusement la couche de papier protecteur, révélant un film résine uniformément réparti. Positionner le parafilm de résine directement sur la surface exposée de l’implant, en assurant un alignement précis avec l’interface implant-tissu (Figure 1C).
5. Appliquez un rouleau de couture en polyuréthane depuis le centre de l’implant vers l’extérieur pour éliminer les bulles d’air et assurer un contact intime entre la résine et les surfaces synthétiques et biologiques (Figure 1D).
6. Position de la source lumineuse UV de 405 nm à 2–3 cm de distance, directement à la surface de l’implant. Exposez pendant 90 s pour assurer une polymérisation complète, vérifiée par une évaluation tactile de la dureté de la résine et des caractéristiques non collantes (Figure 1E). Placez un couvercle protecteur UV sur la fenêtre de la chambre du cryostat avant la photopolymérisation UV afin de protéger l’opérateur de l’exposition nocive aux UV lors de la procédure de durcissement à la résine.

4. Récupération de section et préparation de la glissière

1. Retirez le parafilm en un seul mouvement continu pour éviter une perturbation mécanique de l’interface résine-tissu. L’adhésion complète à la résine est confirmée en inspectant la surface exposée sous éclairage cryostat pour vérifier une couverture résine uniforme, l’absence de soulèvement au bord du tissu et l’absence de résidus visibles de parafilm.
2. Échantillons de section à une épaisseur prédéterminée de 8 μm en utilisant un mécanisme d’avancement de microtome calibré. Surveillez chaque section pour détecter une épaisseur constante et l’absence d’artefacts (compression, déchirure, coupe incomplète). Positionnez la plaque antiroulement de manière optimale pour éviter le roulement (Figure 1F).
   REMARQUE : Les lames adhésives hydrophiles en verre chargé positivement sont utilisées car elles offrent une meilleure rétention des échantillons difficiles, améliorant l’adhérence lors du transfert de section et du traitement ultérieur. Faites des diapositives d’étiquettes individuellement avant le transfert de section.
3. Positionnez la surface adhésive de la glissière, en assurant le contact initial au bord de la section avant le contact progressif sur toute la zone. Assurez-vous que la surface de résine durcie aux UV adhère à la lame tout en maintenant la surface tissulaire vers le haut pour assurer l’immunofluorescence (Figure 1G).
4. Appuyez doucement sur l’ensemble coulisse de section pour éliminer les bulles d’air. Vérifier l’orientation correcte sous éclairage au cryostat, confirmant l’interface implant-tissu intacte.

5. Stockage et conservation

1. Placez les lames terminées dans des boîtes de stockage pré-étiquetées à –20° C pour les applications nécessitant un traitement dans les 72 heures.
2. Utiliser des conditions de 80° C pour les périodes de conservation dépassant une semaine.

6. Protocole de coloration par immunofluorescence

REMARQUE : Manipulez la pepsine avec un EPI approprié, car c’est un irritant cutané et respiratoire.

1. Récupérer les lames du stockage et transférer dans des chambres d’humidité pendant 15 à 20 minutes pour un équilibre à température ambiante.
2. Effectuez trois cycles de lavage PBS consécutifs de 2 minutes.
3. Récupération d’antigènes :
   1. Méthode de récupération d’épitopes induite par la chaleur (HIER) : positionnement des lames horizontales dans des contenants sans micro-ondes avec une solution de récupération de cible 1x. Micro-ondes (sortie de 1000 watts) à haute puissance, pendant 15 minutes, suivies d’un refroidissement à température ambiante.
   2. Méthode de récupération d’épitopes induite par protéolytique (PIER) : Appliquer 100 à 150 μL de solution de pepsine prête à l’emploi par section. Couvrir avec des cache-couches temporaires en plastique et incuber à 37° C pendant 10 minutes dans une chambre humidifiée.
4. Effectuez trois cycles de lavage PBS consécutifs (2 min chacun).
5. Appliquer 1 mL de solution bloqueante contenant 0,1 % de saponine et 2,5 % de sérum normal de chèvre dans PBS. Incubez 30 minutes à température ambiante dans une chambre humidifiée.
6. Effectuez trois cycles de lavage PBS consécutifs (2 min chacun).
7. Appliquer des solutions primaires d’anticorps de 100 μL à des concentrations optimales :
   1. Anti-collagène IV polyclonal de lapin à dilution 1:100.
   2. Anti-Laminine lapin, polyclonal à dilution 1:500.
   3. Anticorps monoclonal anti-F4/80 de lapin à dilution 1:500.
8. Couvrez avec des cache-couvercles temporaires en plastique et incubez toute la nuit à 4° C dans des chambres humidifiées.
9. Effectuez trois cycles de lavage PBS (2 min chacun).
10. Appliquez des anticorps secondaires à une concentration de 10 μg/mL.
    1. Donkey Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor Plus 555
    2. Anti-Lapins IgG Alexa Fluor 488 contre les Chèvres
11. Incubez 60 minutes à température ambiante dans des conditions d’obscurité.
12. Coloration optionnelle à l’agglutinine du germe de blé (WGA) :
    1. Appliquez WGA-Alexa Fluor 647 à 5 μg/mL dans PBS avec 2,5 % de sérum normal de chèvre.
    2. Couvrez et éclovez à 37° C pendant 30 minutes. Effectuez trois cycles de lavage PBS consécutifs de 2 minutes.
13. Appliquez un support de montage dur de 80 μL avec un contre-teinture nucléaire par section.
14. Couvrez la housse de couverture avec le verre de couverture pour éliminer les bulles d’air.
15. Laissez les lames durcir horizontalement à température ambiante pendant 2 heures dans l’obscurité.
16. Conserver à 4° C jusqu’à une semaine pour une qualité d’imagerie optimale.

7. Microscopie à fluorescence et acquisition d’images

1. Réalisez l’imagerie à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée avec des ensembles de filtres du fabricant : excitation/émission 360/460 nm, excitation/émission 470/525 nm, excitation/émission 545/605 nm, excitation/émission 620/700 nm.
2. Les images sont capturées en sélectionnant chaque canal de fluorescence dans le menu Filtres du logiciel du microscope. Avant l’optimisation de l’exposition, une procédure de balance des blacks est effectuée en sélectionnant « Ajuster la balance des noirs » afin d’assurer une correction de base précise pour chaque canal. Les paramètres d’exposition sont ensuite optimisés en ouvrant la fenêtre de capture d’image , en activant le mode Live , et en ajustant les contrôles d’exposition et d’intensité lumineuse jusqu’à obtenir un rapport signal/bruit élevé sans saturation de pixels. La saturation est surveillée à l’aide de l’affichage histogramme du logiciel et de l’outil Highlight Saturated Pixels . Chaque canal est ajusté indépendamment avant l’acquisition de l’image.
3. Effectuer l’acquisition automatisée des tuiles avec le chevauchement de 10 % du fabricant entre les champs adjacents. Maintenir un ajustement automatique de la mise au point tout au long de la séquence d’acquisition.

Résultats

Évaluation de la qualité et optimisation des sections
Après la stabilisation et le coupage en résine UV à 8 μm d’épaisseur, collectez les sections sur des lames adhésives et évaluez le contrôle qualité. Les sections de haute qualité démontrent une morphologie intacte sans fissures majeures ni artefacts de fracturation, avec une architecture tissulaire continue et une interface implant-tissu préservée (Figure 2A). Les sections présentant d...

Discussion

Cette méthode de stabilisation par résine curable par UV offre une approche alternative pour la cryosection des échantillons de tissu incrustés en OCT contenant des matériaux synthétiques qui seraient autrement difficiles à traiter avec des techniques standard de coupe congelée. Bien qu’une variété d’options d’adhésifs, telles que les lames chargées, les rubans adhésifs et autres supports adhésifs, soient disponibles pour aider à prévenir le détachement de coupes de tissu ou d’échantillo...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5W Lumière ultraviolette à cou de poule 395&ndash ; 405 nm pour le durcissement à la résine	Amazon	UPC & lrm ; 603335835561
Anticorps - Anti-F4/80 (Monoclonal)	Abcam	ab300421	1:500
Anticorps - Collagène IV (Polyclonal)	Abcam	ab6586	1:100
Anticorps - Anti-Âne IgG AlexaFluor Plus 555	Invitrogen	A32794	10 ug/mL
Anticorps - Anti-IgG contre les lapin pour les chèvres AlexaFluor 488	Invitrogen	A-11008	10 ug/mL
Anticorps - Laminine (polyclonale)	Invitrogen	PA1-16730	1:500
BioMed Clear	Formlabs	FLBMCL01	Matériau biocompatible #1
BioMed Durable	Formlabs	FLBMDU01	Matériau biocompatible #2
Formol tamponné à 10 %	Santé Cardinale	C4320-101
BZ-X Filter Cy5	Keyence	OP-87766  ;	Ensemble de filtres
FILTRE BZ-X DAPI&NBSP ;	Keyence	OP-87762	Ensemble de filtres
Filtre BZ-X GFP  ;	Keyence	OP-87763	Ensemble de filtres
Filtre BZ-X TRITC  ;	Keyence	OP-87764	Ensemble de filtres
Logiciel analyseur BZ-X800	Keyence	BZ-X800	Logiciels intégrés
Fisherbrand Premium Coverglass & nbsp ; 50 x 24 mm	Fisher Scientific	12-544-14
Imprimante 3D Form4B	FormLabs	F4B-Imprimante
Réservoir de résine Form4	Formlabs	RT-F4-01
Sérum de chèvre	Gibco	16210064
HM525 NX Cryostat	Epredia	956641EC
Four à micro-ondes domestique	Panasonic	NN-S766BA	Puissance de 1000 watts
Cache-couvercles en plastique IHC-Tek 24 mm x 60 mm	IHC Monde	IW-2601	Enveloppe temporaire
JDiction Résine UV à faible viscosité	Amazon	6974143904430	Haute autofluorescence
Keyence BZ-X800  ;	Keyence	BZ-X800
Faisons du type résine UV résine transparente dur	Amazon	ALR00038	Haute autofluorescence
Mettons la résine UV transparente de type haute viscosité	Amazon	ALR00048
Lames en verre micro lames Matsunami MAS	Approvisionnement des nouveaux arrivants	SUMAS1190	Culasse adhésive
Implant chirurgical Medpor	Stryker	8662	Matériau biocompatible #3
Mr. Résine UV Résine Cristalline	Amazon	B08FRF9QTB	Haute autofluorescence
Lame MX35 Ultra Microtome	Epredia	3053835
Film de laboratoire Parafilm M	Parafilm	P7543-1EA
Pepsin	Sigma	R2283-15ML
Solution saline tamponnée phosphate pH 7,4	Sigma  ;	P3813
Plan Apo & lambda ; 40X	Keyence	BZ-PA40	Objectif
Plan Apo & lambda ; 4X  ;	Keyence	BZ-PA04	Objectif
Rouleau de couture en polyuréthane	Amazon	682698799567
Fixation antidécoloration en verre ProLong avec teinture NucBlue	Invitrogen	P36985	Hoechst 33342 Contre-teinte
Saponine	Millipore	558255-100GM
StainTray	Simport	M920-2
Feuilles de silicone stériles	Bentec	PR72034-51N
Solution de récupération de cible, citrate pH6	Agilent	S236984-2
Composé Tissue-Tek O.C.T	Sakura	4583
Agglutinine du germe de blé AlexaFluor 647	Invitrogen	W32466	5 ug/mL