Article de méthode

Visualisation tridimensionnelle des vaisseaux lymphatiques dans la peau humaine et leurs modifications structurelles lors du lymphœdème

DOI :

10.3791/69972

⸱

13 février 2026

 ,  ,  ,  , 
1MIRAI Technology Institute, Shiseido Co., Ltd., 2Department of Plastic, Reconstructive, and Aesthetic Surgery, Chiba University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, une visualisation tridimensionnelle de la structure des vaisseaux lymphatiques dans la peau humaine a été réalisée à l’aide de microscopie confocale ou à feuilles lumineuses, après l’application de trois techniques distinctes de déblaiement des tissus. La combinaison de ces méthodes avec la coloration immunohistochimique permet d’éclairer les changements fonctionnels des vaisseaux lymphatiques au cours de la progression du lymphœdème.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vaisseaux lymphatiques de la peau, comprenant les capillaires et les vaisseaux collecteurs, jouent un rôle clé dans l’élimination des déchets et les réponses immunitaires, et sont essentiels au maintien de l’homéostasie tissulaire. Cependant, la peau humaine, avec ses trois couches — épiderme, derme et graisse sous-cutanée — contient une matrice extracellulaire dense riche en collagène, ce qui rend difficile visualiser les réseaux lymphatiques en trois dimensions. Pour répondre à cette limitation, cet article présente trois méthodes distinctes, chacune adaptée à des molécules spécifiques d’intérêt et à des objectifs expérimentaux, pour la visualisation tridimensionnelle des lymphatiques cutanés humains à l’aide de réactifs de déliciation tissulaire en combinaison avec la microscopie confocale ou la microscopie à feuilles lumineuses. En ciblant les molécules de jonction adhésive dans les cellules endothéliales lymphatiques par immunohistochimie, des modifications structurelles aux implications fonctionnelles claires, en particulier le remodelage caractéristique des jonctions capillaires en forme de bouton à fermeture éclair, ont été évaluées dans des tissus cutanés issus de patients atteints de lymphœdème secondaire. Cette technique de visualisation tridimensionnelle révèle des structures vasculaires qui ne sont pas discernables par l’analyse conventionnelle des coupes tissulaires histologiques, enrichissant ainsi la compréhension de la structure et de la fonction des vaisseaux lymphatiques.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’intérêt pour la fonction des vaisseaux lymphatiques s’est accru depuis la reconnaissance de leur rôle dans le maintien de l’homéostasie cutanée, au-delà de leur implication bien établie dans la métastasecancéreuse 1,2. Les vaisseaux lymphatiques sont structurellement divisés en capillaires et vaisseaux collecteurs, chacun possédant des caractéristiques distinctes. Les capillaires lymphatiques sont constitués d’une structure à couches uniques formée par des cellules endothéliales lymphatiques et servent de sites de collecte initiaux pour le liquide interstitiel, les déchets et les cellules immunitaires. En revanche, les vaisseaux lymphatiques collecteurs ont une structure bicouchée avec des cellules musculaires lisses entourant la couche endothéliale lymphatique, permettant un transport actif du liquide lymphatique collecté par le réseau capillaire vers la circulationcentrale 3. Les modèles murins ont été utilisés pour élucider les caractéristiques structurelles, en particulier des vaisseaux lymphatiques bronchiques, et ont montré comment les affections inflammatoires induisent un remodelagestructurel 4. Des travaux antérieurs ont démontré que l’inflammation induite par les ultraviolets provoque une dilatation anormale des capillaires lymphatiques, ce qui compromet leur fonction de collecte de liquide. Les mécanismes moléculaires sous-jacents à cette dysfonction ont été identifiés, montrant spécifiquement que l’augmentation de l’expression de VEGF-A, couplée à une diminution de l’expression de VEGF-C, entraîne ces altérationsstructurelles 5,6,7.

Bien que les techniques de visualisation tridimensionnelle aient considérablement fait progresser la compréhension du réseau lymphatique dans les modèlesmurins 8,9, une analyse structurelle comparable des vaisseaux lymphatiques humains reste un défi. Cette lacune analytique découle des difficultés liées au travail avec les tissus humains, notamment la disponibilité limitée des échantillons et les problèmes techniques nécessaires à la réalisation d’une imagerie tridimensionnelle complète. En particulier, la peau, caractérisée par une structure en trois couches comprenant l’épiderme, le derme et la graisse sous-cutanée, et servant de barrière à l’environnement externe, présente des défis plus importants que d’autres organes mous. De plus, la peau humaine présente des défis analytiques distincts par rapport aux modèles murins, notamment une plus grande épaisseur tissulaire, ce qui entrave la pénétration en profondeur par imagerie. De plus, l’abondance des composants extracellulaires de la matrice, en particulier le collagène, ainsi que leurs altérations structurelles liées à l’âge, créent des barrières optiques qui réduisent l’efficacité des techniques émergentes de déblaiement des tissus, qui ont révolutionné l’imagerie lymphatique chezla souris 10.

Divers agents dégageants des tissus ont été testés auparavant pour visualiser les capillaires cutanés humains, démontrant leur compatibilitétissulaire 11. Suite à ce travail, des réactifs dégageants des tissus ont été utilisés avec succès pour visualiser les vaisseaux lymphatiques de la peau humaine en trois dimensions12. En se concentrant sur les jonctions adhérentes des cellules endothéliales lymphatiques, des modifications structurelles des vaisseaux lymphatiques associées à la progression du lymphœdème ont étéidentifiées 13. L’objectif de cet article est de décrire en détail les procédures de visualisation tridimensionnelle des vaisseaux lymphatiques de la peau humaine en utilisant des combinaisons de trois techniques de déblaiement cutané, ainsi que la microscopie confocale et la microscopie à feuilles lumineuses, et une coloration immunohistochimique adaptée à des objectifs de recherche spécifiques. Dans cette étude, bien que nous nous concentrions uniquement sur les tissus cutanés humains frais qui ont été corrigés le jour de l’excision et n’ont pas subi de cycles de congélation-dégel, ces techniques fournissent des éclairages non seulement sur les changements structurels des vaisseaux lymphatiques pendant la maladie et le vieillissement, mais aussi sur les altérations fonctionnelles associées.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des échantillons de peau de sujets humains ont été prélevés à l’hôpital universitaire de Chiba (Chiba, Japon). Toutes les procédures impliquant des sujets humains ont été approuvées par le comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital universitaire de Chiba et le Centre mondial d’innovation Shiseido, et tous les sujets ont fourni un consentement éclairé écrit. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Prétraitement des échantillons de peau humaine

  1. Retirer le tissu sous-cutané des échantillons excisés lors de l’acquisition.
    REMARQUE : L’intervalle entre l’excision et l’acquisition de la peau était d’environ h. Pendant le transport, le tissu a été immergé dans le DMEM et conservé sur des plaques de glace.
  2. Placez les échantillons avec le côté épidermique vers le bas sur une plaque chauffante à 60 °C pendant 45 secondes pour séparer l’épiderme et le derme.
  3. Immergez immédiatement les spécimens dans un PBS glacé.
  4. Séparez l’épiderme et le derme à l’aide d’une pince à épiler.
  5. Fixez les parties dermiques dans du paraformoldéhyde à 4 % à 4°C pendant 16 heures, puis lavez avec du PBS avant utilisation.
    REMARQUE : Après fixation, les échantillons étaient stockés dans le PBS à 4 °C, et les étapes d’immunocoloration ont été initiées en quelques mois.
    ATTENTION : La solution PFA est toxique. Toute la préparation et la manipulation doivent être effectuées dans une hotte à fumée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.

2. Immunocoloration intégrale combinée à des réactifs de nettoyage

  1. Technique iDISCO
    1. Taillez les spécimens à environ 5 mm × 5 mm × 5 mm de taille.
    2. Transférez les échantillons dans des Triton X-100 à 5 % et 2,5 % Tween 20 en PBS sur un vibrateur orbital réglé à 50 tr/min à 24 °C pendant 16 heures pour la perméabilisation.
    3. Lavez les échantillons avec du PBS à 24 °C pendant 1 heure, en répétant le processus trois fois.
    4. Immergez les échantillons dans un tampon de blocage A fraîchement préparé (1 % de BSA, 0,1 % Tween 20, 0,03 % d’azide de sodium en PBS) sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 24 °C pendant 72 heures.
    5. Incubez les échantillons avec un anticorps primaire contre la podoplanine (1:100) dans un tampon de blocage A sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 37 °C pendant 72 heures.
    6. Lavez les échantillons avec le tampon de lavage A (0,1 % Tween-20 en PBS) à 24 °C pendant 1 heure, en répétant le processus trois fois. Ensuite, maintenez les échantillons dans le tampon de lavage A sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 72 heures.
    7. Incubez les échantillons avec un anticorps secondaire contre l’IgG de souris conjugué à Alexa Fluor 647 (1:1000) dans un tampon bloquant A sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 37 °C pendant 72 heures.
    8. Répétez l’étape 1.6.
    9. Incubez les spécimens avec 50 % de MeOH à 24 °C pendant 3 heures.
    10. Incubez les spécimens avec 70 % de MeOH à 24 °C pendant 3 heures.
    11. Incubez les spécimens avec 100 % de MeOH à 24 °C pendant 16 heures.
    12. Incubez les échantillons avec du dichlorométhane à 24 °C pendant 15 minutes, répétant le processus deux fois.
    13. Éliminer les échantillons avec de l’éther dibenzylique à 24 °C pendant 16 h.
      REMARQUE : Si le tissu n’est pas encore devenu transparent à ce stade, une attente supplémentaire n’entraînera aucune amélioration significative.
    14. Capturez des images des spécimens avec un microscope à feuille lumineuse.
      REMARQUE : Utilisez une feuille lumineuse avec un objectif EC Plan-Neofluar 5×/0.16 ; régler l’illumination (excitation) à 63 nm et la détection à 648 nm ; acquérir une pile Z d’une taille de pas de 5,8 μm.
      ATTENTION : Le méthanol, le dichlorométhane et l’éther dibenzylique sont dangereux. Toute la préparation et la manipulation doivent être effectuées dans une hotte à fumée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
  2. Réactif Rapiclear 1.52
    1. Taillez les spécimens à environ 5 mm × 5 mm × 2 mm de taille.
    2. Transférez les échantillons dans un Triton-X 100 à 2 % dans un PBS sur un vibreur orbital réglé à 50 tr/min à 24 °C pendant 16 heures pour la perméabilisation.
    3. Immergez les échantillons dans un tampon de blocage B fraîchement préparé (5 % de sérum d’âne et 1 % de Triton-X 100 en PBS) sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 16 heures.
    4. Incubez les échantillons avec des anticorps primaires contre la podoplanine et la VE-cadherine (tous deux à 1:100) dans un tampon B bloquant sur un vibrateur orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 72 heures.
    5. Lavez les échantillons avec le tampon de lavage B (3 % de NaCl et 0,2 % de Triton-X 100 en PBS) à 24 °C pendant 1 heure, en répétant le processus trois fois. Ensuite, maintenir les échantillons dans le tampon de lavage B sur un vibrateur orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 16 heures.
    6. Lavez les échantillons avec du PBS à 24 °C pendant 1 heure.
    7. Incuber les échantillons avec des anticorps secondaires contre l’IgG de souris et l’IgG du lapin, conjugués respectivement à Alexa Fluor 647 et 568 (tous deux à 1:1000), dans un tampon B de blocage sur un vibreur orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 16 heures.
    8. Répétez les étapes 1,5. et 1.6.
    9. Éliminer les échantillons avec au moins 5 fois le volume d’échantillon de Rapiclear 1,52 à 24 °C pendant 16 heures.
      REMARQUE : Le dégagement des régions périphériques du tissu a été observé en moins d’une heure.
    10. Insérez les échantillons dégagés dans une chambre de gel de polydiméthylsiloxane placée sur une couche de couverture avec un réactif Rapiclear 1.52 frais.
    11. Imagez les spécimens avec un microscope confocal.
      REMARQUE : Utilisez un microscope confocal avec un objectif Plan-Apochromat 10×/0,45 M27 ; régler l’excitation à 633 nm et 561 nm, et la portée de détection 641-754 nm et 566-628 nm, avec un détecteur GaAsP ; acquérir une pile Z d’une taille de pas de 3,15 μm.
  3. Technique CUBIC
    1. Taillez les spécimens à environ 5 mm × 5 mm × 3 mm de taille.
    2. Immergez les échantillons dans 50 % de CUBIC-L à 24 °C pendant 24 heures en prétraitement pour la délipidation.
    3. Transférez les échantillons dans 100 % CUBIC-L sur un vibrateur orbital réglé à 50 tr/min à 37 °C pendant 7 jours pour la délipidation.
    4. Lavez les échantillons avec du PBS à température ambiante pendant 24 heures.
    5. Immergez les échantillons dans un tampon de blocage A fraîchement préparé sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 24 °C pendant 72 heures.
    6. Incubez les échantillons avec un anticorps primaire contre la VE-cadherine, la podoplanine et le CD31 (1:100, 1:100 et 1:200, respectivement) dans un tampon de blocage A sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 37 °C pendant 72 heures.
    7. Lavez les échantillons avec le tampon de lavage A à 24 °C pendant 1 heure. Répétez le processus trois fois, puis maintenez les échantillons dans le tampon de lavage A sur un vibrateur orbital réglé à 50 tr/min à 4 °C pendant 72 heures.
    8. Incubez les spécimens avec des anticorps secondaires contre l’IgG de souris, l’IgG du lapin et l’IgG du mouton, conjugués respectivement à Alexa Fluor 647, 568 et 488 (tous à 1:1000), dans un tampon de blocage A sur un shaker orbital réglé à 50 tr/min à 37 °C pendant 72 heures.
    9. Répétez l’étape 3.7.
    10. Faites un pré-clear des spécimens avec 50 % CUBIC-R+(M) à 24 °C pendant 16 heures.
    11. Éliminer les spécimens avec 100 % CUBIC-R+(M) à 24 °C pendant 16 heures.
      REMARQUE : Si le tissu n’est pas encore devenu transparent à ce stade, une attente supplémentaire n’entraînera aucune amélioration significative.
    12. Imagez les spécimens avec un microscope confocal.
      REMARQUE : Utilisez un microscope confocal avec un objectif Plan-Apochromat 20×/0,8 M27 ; régler l’excitation à 633 nm, 561 nm et 488 nm, et la portée de détection 641-754 nm, 566-628 nm et 479-550 nm, avec un détecteur GaAsP ; acquérir une pile Z avec une taille de pas de 0,78 μm.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Différence de transmission lumineuse des tissus cutanés humains dégagés avec et sans épiderme
La figure 1 montre des photographies représentatives de spécimens de peau humaine avec et sans épiderme, après perméabilisation et nettoyage avec le réactif Rapiclear 1.52. L’ablation épidermique améliore la transparence tissulaire en éliminant la mélanine, un puissant absorbeur de lumière, comme le confirme la visibilité accrue de la ligne noir...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La visualisation tridimensionnelle des réseaux lymphatiques dans les tissus biologiques est d’une importance cruciale pour comprendre leurs caractéristiques structurelles et leurs fonctions physiologiques, ainsi que les changements pathologiques. Ce protocole présente trois méthodes distinctes de déblaiement des tissus, optimisées pour les tissus cutanés humains, chacune adaptée à des objectifs d’observation spécifiques.

L’ablation épidermique est considérée c...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

K.T., E.G., N.I. et K.K. sont employés de Shiseido Co., Ltd.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-CD31R& Systèmes DAF806dilution à 1:200
Anticorps anti-PodoplanineDakoM3619dilution à 1:100
Anticorps anti-VE-cadherineTechnologie de signalisation cellulaire#2500dilution à 1:100
CUBIC-LIndustrie chimique de TokyoT3740
CUBIC-R+(M)Industrie chimique de TokyoT3741
DMEM, hypoglycémie, pyruvateThermo Fisher SCIENTIFIC11885084
Anti-IgG anti-souris Donkey (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor 647Thermo Fisher SCIENTIFICA-31571dilution à 1:1000
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor 568Thermo Fisher SCIENTIFICA10042dilution à 1:1000
Anticorps secondaire adsorbé croisé contre l’IgG de mouton (H+L), Alexa Fluor 488Thermo Fisher SCIENTIFICA-11015dilution à 1:1000
Rapiclear 1.52Laboratoire SunjinRC152001
ZEISS Lightsheet Z.1 MicroscopeCarl Zeiss
ZEISS LSM 880 Confocal Laser Scanning MicroscopeCarl Zeiss

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Skobe, M., Detmar, M. Structure, function, and molecular control of the skin lymphatic system. J Investig Dermatol Symp Proc. 5 (1), 14-19 (2000).
  2. Yang, Y., Wang, X., Wang, P. Signaling mechanisms underlying lymphatic vessel dysfunction in skin aging and possible anti-aging strategies. Biogerontology. 24 (5), 727-740 (2023).
  3. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The Lymphatic Vasculature in the 21st Century: Novel Functional Roles in Homeostasis and Disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  4. Baluk, P., McDonald, D. M. Imaging Lymphatics in Mouse Lungs. Methods Mol Biol. 1846, 161-180 (2018).
  5. Kajiya, K., Hirakawa, S., Detmar, M. Vascular endothelial growth factor-A mediates ultraviolet B-induced impairment of lymphatic vessel function. Am J Pathol. 169 (4), 1496-1503 (2006).
  6. Kajiya, K., Detmar, M. An important role of lymphatic vessels in the control of UVB-induced edema formation and inflammation. J Invest Dermatol. 126 (4), 919-921 (2006).
  7. Sawane, M., Kidoya, H., Muramatsu, F., Takakura, N., Kajiya, K. Apelin attenuates UVB-induced edema and inflammation by promoting vessel function. Am J Pathol. 179 (6), 2691-2697 (2011).
  8. Kirschnick, N., et al. Rapid methods for the evaluation of fluorescent reporters in tissue clearing and the segmentation of large vascular structures. iScience. 24 (6), 102650(2021).
  9. Orlich, M., Kiefer, F. A qualitative comparison of ten tissue clearing techniques. Histol Histopathol. 33 (2), 181-199 (2017).
  10. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
  11. Kajiya, K., Bise, R., Commerford, C., Sato, I., Yamashita, T., Detmar, M. Light-sheet microscopy reveals site-specific 3D patterns of the cutaneous vasculature and pronounced rarefication in aged skin. J Dermatol Sci. 92 (1), 3-5 (2018).
  12. Sawane, M., et al. Apelin provides an alternative function to estrogen in regulating lymphatic vascular integrity. J Dermatol Sci. 111 (3), 124-127 (2023).
  13. Itai, N., et al. Lymphangiogenesis and lymphatic zippering in skin associated with the progression of lymphedema. J Invest Dermatol. 144 (3), 659-668.e7 (2024).
  14. Breiteneder-Geleff, S., et al. Podoplanin-a specific marker for lymphatic endothelium expressed in angiosarcoma. Verh Dtsch Ges Pathol. 83, 270-275 (1999).
  15. Suami, H., Scaglioni, M. F. Anatomy of the lymphatic system and the lymphosome concept with reference to lymphedema. Semin Plast Surg. 32 (1), 5-11 (2018).
  16. Avraham, T., et al. Fibrosis is a key inhibitor of lymphatic regeneration. Plast Reconstr Surg. 124 (2), 438-450 (2009).
  17. Giannotta, M., Trani, M., Dejana, E. VE-cadherin and endothelial adherens junctions: active guardians of vascular integrity. Dev Cell. 26 (5), 441-454 (2013).
  18. Newman, P. J., et al. PECAM-1 (CD31): cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily. Science. 247 (4947), 1219-1222 (1990).
  19. Bhutto, I. A., et al. Visualization of choroidal vasculature in pigmented mouse eyes from experimental models of AMD. Exp Eye Res. 238, 109741(2024).
  20. Cichoń, M. A., Elbe-Bürger, A. Epidermal/Dermal separation techniques and analysis of cell populations in human skin sheets. J Invest Dermatol. 143 (1), 11-17.e8 (2023).
  21. Takahashi, K., et al. An analysis modality for vascular structures combining tissue-clearing technology and topological data analysis. Nat Commun. 13 (1), 5239(2022).
  22. Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
  23. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  24. Tainaka, K., et al. Chemical landscape for tissue clearing based on hydrophilic reagents. Cell Rep. 24 (8), 2196-2210.e9 (2018).
  25. Banerji, S., et al. LYVE-1, a new homologue of the CD44 glycoprotein, is a lymph-specific receptor for hyaluronan. J Cell Biol. 144 (4), 789-801 (1999).
  26. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).
  27. Johnson, L. A., et al. Inflammation-induced uptake and degradation of the lymphatic endothelial hyaluronan receptor LYVE-1. J Biol Chem. 282 (46), 33671-33680 (2007).
  28. Pechtimaldjian, L., et al. Skin-iDISCO+: An optimized tissue-clearing and labeling protocol for morphometric analysis of human cutaneous vasculature. STAR Protoc. 6 (1), 103524(2024).
  29. Hägerling, R., et al. VIPAR, a quantitative approach to 3D histopathology applied to lymphatic malformations. JCI Insight. 2 (16), e93424(2017).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Demander l’autorisation de réutiliser le texte ou les figures de cet article JoVE

Demander une autorisation

Mots-clés

Lymphatic VesselsHuman SkinThree Dimensional VisualizationLymphedemaTissue ClearingConfocal MicroscopyLight Sheet MicroscopyImmunohistochemistryCapillary JunctionsLymphatic Endothelial Cells

Articles connexes