Un test FRET à molécule unique permet une analyse quantitative du recuit médié par Hfq entre les ARNs bactériens et les ARNm, permettant de mesurer la cinétique et la stabilité des interactions. Des résultats représentatifs démontrent comment la longueur des graines, les motifs de liaison Hfq et l’espacement des motifs influencent la formation du duplex ARN.
Article de recherche
Effet de la longueur de la graine et des motifs de liaison sur le recuit d’ARNm médié par Hfq analysé à l’aide d’un FRET à molécule unique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Définir les règles qui régissent le recuit entre les petits ARN bactériens (ARNs) et leurs cibles d’ARNm est complexe car ces ARN sont très hétérogènes dans leur séquence et leur structure. Pour démêler la contribution des caractéristiques individuelles, nous avons systématiquement varié les déterminants clés, notamment la force de la graine, les motifs de liaison Hfq et l’espacement entre eux. Les effets de ces caractéristiques sur la stabilité duplex ARNs-ARNm ont été testés à l’aide du transfert d’énergie par résonance de Förster à molécule unique (smFRET), qui permet de surveiller des molécules d’ARN individuelles à l’échelle de la milliseconde et donne accès à des événements dynamiques souvent obscurcis dans les essais d’ensemble.
Nous démontrons que les régions de graines courtes (4-5 pb) forment des complexes instables et à courte durée de vie, tandis que des graines plus longues (8-10 pb) produisent des duplex stables. L’extension des motifs de liaison Hfq ou l’introduction d’un espaceur entre les sites de liaison sur l’ARNm a encore augmenté la durée de vie des interactions, soulignant l’importance de la résistance des motifs et de l’arrangement spatial dans l’efficacité du recuit médié par Hfq. De plus, cette approche fournit un cadre robuste et reproductible pour disséquer la dynamique des interactions ARN-ARN à résolution moléculaire unique et pour sonder les mécanismes de chaperons ARN.
Introduction
L’expression des gènes bactériens est largement régulée au niveau post-transcriptionnel par de petits ARN. Ces ARN courts (généralement de 50 à 300 nt) agissent par appariement de bases avec les ARNmcibles 1. Dans de nombreux cas, les ARNs-s recuit aux sites de liaison aux ribosomes pour réprimer la traduction ou déclencher la désintégration de l’ARNm en recrutant desRNases 2,3. Bien que ces interactions aient été largement étudiées à l’aide de tests génétiques et biochimiques, la plupart des approches disponibles suggèrent une régulation indirecte à partir d’effets à l’état stationnaire sur les niveaux d’ARN ou la sortie de protéines, ce qui rend difficile la résolution des dynamiques de liaison sous-jacentes.
Une régulation efficace de la cible nécessite souvent la chaperonne à ARN Hfq, une petite protéine hexamérique de typeSm 4,5. Hfq prolonge la demi-vie des sRNAs en les protégeant desnucléases 6 et favorise le recuit avec les ARNmcibles 7,8. Hfq atteint ces fonctions via trois surfaces distinctes de liaison à l’ARN avec des préférences différentes : la face distale reconnaît les motifs AAN généralement présents dans les ARNm, la face proximale se lie à des séquences riches en U typiques des terminateurs d’ARNs, et le rebord interagit électrostatiquement avec les dorsalesd’ARN 9. Hfq, cependant, est présent en bien moins grande quantité que le pool total d’ARNinteractifs 10,11. Malgré cette limitation apparente, les ARNs-s nouvellement synthétisés trouvent rapidement leur cible et déclenchent la régulation en quelques minutes après latranscription 12. Ce paradoxe suggère que les interactions ARN-Hfq sont très dynamiques, les ARN s’associant et se dissociant continuellement plutôt que de rester liés dans des complexesstables 13,14. Comprendre comment de telles interactions transitoires produisent une régulation fiable nécessite un accès expérimental aux événements de liaison individuels plutôt qu’aux moyennes de population.
Les interactions entre les ARNs-s’il et les ARNm sont médiées par des séquences de graines parfaitement complémentaires, qui doivent localiser leurs sites de correspondance au sein d’ARNm souvent longs et très structurés. De plus, la distance entre la région de la graine d’ARNss et le site de liaison Hfq sur l’ARNm peut varierconsidérablement de 15, compliquant encore davantage le processus de recuit. Hfq aide à surmonter ces défis en transférant de manière flexible les ARNs-s entre des sites de liaison potentiels sur la cible, augmentant ainsi la probabilité de rencontrer la bonne régionde jumelage 16. L’appariement médié par Hfq peut également remodeler les structures locales d’ARNm, déroulant transitoirement des régions appariées de bases et exposant des séquences autrement inaccessibles. Cependant, de telles remodelations peuvent aussi entraîner des événements de recuit non productifs ou avortés. Ces interactions transitoires peuvent parfois être stabilisées par de forts motifs de liaison Hfq situés près du sited’appariement 17. Malgré cette flexibilité, toutes les rencontres ARNs-ARNm ne conduisent pas à une formation duplex stable, et les facteurs déterminant l’efficacité du recuit restent peu compris. En particulier, il reste incertain comment les déterminants individuels de la séquence contribuent quantitativement à la durée de vie de liaison et à la stabilité complexe.
Ici, nous avons établi un système minimal reconstitué à molécule unique qui permet la manipulation progressive des déterminants de séquence et la mesure directe de la cinétique du recuit à l’aide de smFRET. Dans ce système, nous avons conçu des paires d’ARN avec un recuit initialement inefficace et modifié systématiquement des caractéristiques clés, notamment la résistance des graines, la résistance des motifs de liaison Hfq et l’espacement entre ces sites, afin de disséquer comment les paramètres individuels influencent la stabilité du duplex. En isolant des caractéristiques de séquence définies dans un système in vitro contrôlé, cette approche permet la dissection mécaniste des règles de ciblage des ARNs, difficiles à démêler in vivo en raison de la complexité du réseau et des effets régulateurs indirects.
Protocole
Ce protocole décrit le test FRET à molécule unique pour surveiller le recuit ARNs-mRNA. Il comprend des procédures pour la conception, la synthèse et la passivation des lames de modèles, l’imagerie de molécule unique et l’analyse quantitative des données.
Préparation des ARN
Concevoir les séquences d’ARNs-s-M et d’ARNm in silico. Chaque ARNsn doit se terminer par un terminateur de transcription et contenir un motif de liaison Hfq riche en U ainsi qu’une séquence de graines complémentaire à l’ARNm cible. L’ARNm correspondant doit inclure des répétitions AAN servant de motif de liaison à Hfq et de séquence complémentaire à la région de graine d’ARNs. Les séquences en dehors de la liaison Hfq sont aléatoires tout en évitant les motifs AAN et les tracts riches en U pour éviter les interactions Hfq non intentionnelles. Ajouter une séquence complémentaire lien-câble à l’extrémité 3' de l’ARNm pour permettre l’immobilisation à la surface lors de l’imagerie. Prédire les structures secondaires ARN excluant la séquence complémentaire du câble en utilisant la structure ARN via le serveur web oulocalement 18. Pour une analyse web, téléchargez les séquences FASTA sur le serveur web RNAstructure (https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb) et sélectionnez Prédire une structure secondaire. Utilisez des paramètres par défaut (température 37 °C, sans contraintes de pliage). Après le calcul, on inspecte le diagramme de structure et la probabilité de repliement. Les régions étaient classées comme occluses si les nucléotides du motif de la graine ou de liaison à Hfq présentaient des probabilités de pairage de bases prédites >60 %. Les séquences dépassant ce seuil ont été repensées.
Préparez des modèles d’ADN pour la transcription in vitro en étendant les oligonucléotides superposés à l’aide d’ADN polymérase, en suivant le protocole du fabricant. La concentration de l’amorce était de 3 μM chacune. Le programme thermocycleur a été utilisé comme recommandé par le fabricant, sauf que le nombre de cycles d’amplification a été réduit à 8, ce qui a suffi à prolonger les amorces.
Transcrivez l’ARN à 37 °C pendant 3 h jusqu’à la nuit à l’aide d’ARN polymérase T7 dans un tampon de transcription 1× (80 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM spermidine, 10 mM NaCl), complétés avec 1 mM chaque NTP, 40 mM DTT et 30 mMMgCl 2. Arrêtez la réaction en ajoutant de l’EDTA à une concentration finale de 30 mM. Pour la précipitation de l’ARN, ajoutez 1/10 de volume de 3 M NaOAc (pH 5,4), suivi de 2,5 à 3 volumes de ≥99 % d’éthanol. Mélangez bien et éclovez à -80 °C pendant 1 heure. ARN en pellets par centrifugation à ≥20 000 × g pendant 35 minutes à 4 °C. Retirez le surnageant, lavez la pellete avec 70 % d’éthanol, puis laissez-le sécher brièvement à l’air. Dissoudez la pastille d’ARN dans 20 μL d’urée 8 M et chauffez à 90 °C pendant 2 minutes. Purifiez l’ARN sur des gels de polyacrylamide à 8 % contenant 8 M urea. Retirez les bandes d’intérêt et éluez l’ARN pendant la nuit dans le tampon d’élution (0,3 M acétate de sodium, pH 5,4, 1 mM EDTA). Récupérez l’ARN par précipitation à l’éthanol (suivez les instructions pour la précipitation de l’ADN) et dissoudez le pellet dans de l’eau sans nucléase.
Pour préparer les ARN au marquage fluorescent, effectuer la transcription in vitro telle que décrite, en complétant la réaction avec un GMP de 32 mM afin de générer des transcrits transportant un monophosphate de 5'. Traiter l’ARN avec de l'1-éthyl-3-[3-diméthylaminopropyl] carbodiimide, chlorhydrate19 (EDC) et de l’imidazole pour introduire un groupe amine à l’extrémité 5'. Incubez l’ARNsn dans un tampon carbonate-bicarbonate (pH 8,5) avec soit Alexa Fluor 555, soit Cy3 ester NHS, en suivant les instructions du fabricant. Purifiez l’ARN modifié à l’aide de colonnes de spin chromatographie, précipitez avec de l’éthanol et dissoudez la pellete dans de l’eau sans nucléase. Déterminez l’efficacité du marquage spectrophotométriquement en mesurant l’absorbance à 260 nm et au maximum d’absorption spécifique à la teinte à l’aide d’un Nanodrop ou d’un spectrophotomètre équivalent. Calculez les concentrations d’ARN et de colorants en utilisant la loi de Beer-Lambert et les coefficients d’extinction correspondants fournis par le fabricant de fluorophores. L’efficacité de marquage est définie comme le rapport molaire du colorant/ARN et approchait régulièrement de 100 %. Les ARN marqués peuvent être stockés à -20 °C.
Ordre des oligonucléotides d’ADN portant une moitié 3′-biotine et un liaison C6 5′-amino. Précipiter l’ADN en utilisant de l’éthanol et de l’acétate de sodium comme décrit ci-dessus. Étiquetez le groupe amine avec l’ester Cy5 NHS dans un tampon carbonate-bicarbonate (pH 8,5) selon les instructions du fabricant. Déterminer la concentration d’ADN marqué spectrophotométriquement comme décrit ci-dessus. Les ADN marqués peuvent être stockés à -20 °C.
Purification des Hfq
Cultivez les cellules Escherichia coli BL21 (DE3) Δhfq ::cat-sacB portant le plasmide d’expression Hfq pET21b-EcHfq, dans lequel le gène hfq d’E. coli est exprimé par un promoteur inducible par IPTG. Hfq s’exprime sans balise d’affinité ; la protéine native contient suffisamment de résidus d’histidine exposés à la surface pour permettre une purification par chromatographie d’affinité Ni2+ . Cultivez les cellules dans 1 L de milieu LB-Miller complété avec 100 μg/mL d’ampicilline à 37 °C pour un ODde 600 de 0,6. Induire l’expression de Hfq en ajoutant l’IPTG à une concentration finale de 1 mM et incuber pendant 4 heures à 37 °C. Prélever les cellules par centrifugation à 5 000 × g pendant 10 minutes, puis resuspendre le pellet dans 50 mL de tampon de lyse (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 250 mM MgCl2, 1 mM 2-mercaptoéthanol, Attention : le 2-mercaptoéthanol est toxique, manipuler dans une hotte à fumer). Lyser les cellules par sonication sur glace en utilisant un réglage d’impulsion de 50 % du cycle de travail. Appliquez trois impulsions de 40-s avec des intervalles de refroidissement d’une minute sur glace entre les pulsations. Centrifugez le lysat à 27 000 × g pendant 20 minutes à 4 °C. Chauffez le surnageant à 85 °C pendant 45 minutes, puis centrifugez à nouveau dans les mêmes conditions. Traiter le surnageant obtenu avec la RNase A (30 μg/mL) et la DNase I (5 U/mL) pendant 1 heure à température ambiante avec un léger secouement, suivi d’une filtration à travers un filtre de 0,45 μm. Appliquez le lysat clarifié sur une colonne de chromatographie d’affinité préchargée avec NiSO4. Lavez la colonne avec un tampon (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 500 mM NH4Cl, 0,5 mM 2-mercaptoéthanol). Éluer la protéine à l’aide du même tampon avec une concentration linéaire de gradient d’imidazole de 10 mM à 1 M. Regrouper les fractions contenant Hfq et les charger sur une colonne de chromatographie HiLoad 16/600 Superdex 200 à exclusion de taille équilibrée avec un tampon HB (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 250 mM NH4Cl, 1 mM EDTA, 10 % de glycérol). Faites fonctionner la colonne selon les instructions du fabricant. Une analyse SDS-PAGE représentative de la purification du Hfq est présentée dans la Figure supplémentaire 1. Concentrez la protéine purifiée, si nécessaire, à l’aide de filtres centrifuges (MWCO de 3 kDa). Les aliquotes Hfq purifiées peuvent être stockées à -80 °C.
Expériences sur une seule molécule
Passivation des lames de quartz20
Préparez des lames en quartz avec cinq trous parallèles (0,8 mm de diamètre) percés près de chaque long bord. Placez les lames et les goulottes en quartz dans un bocal de coloration Hellendahl (porte-lames) et soniquez dans de l’acétone pendant 20 minutes (attention : l’acétone est inflammable et volatile ; travaillez dans une hotte à vapeur). Répétez l’étape de nettoyage avec du méthanol (attention : le méthanol est toxique et inflammable ; manipulez dans une hotte à fumée). Rincez soigneusement les lames à l’eau et soniez en 1 M KOH pendant 1 h (attention : KOH est caustique, portez des gants et une protection oculaire). Rincez les lames à l’eau, puis soniez séquentiellement avec de l’acétone et du méthanol pendant 20 minutes chacun. Répétez le nettoyage du KOH avec 5 M KOH pendant 1 heure, suivi d’un rinçage approfondi à l’eau (attention : manipulez le KOH concentré avec un équipement de protection approprié). Faites sécher les lames à l’air libre. Préparez un jeu propre de bocaux de teinture Hellendahl et rincez-les à l’hexane (attention : l’hexane est très inflammable ; manipulez dans une hotte à fumée), puis laissez-les sécher à l’air. Placez les lames dans le porte-lamelles et rincez les lames deux fois avec de l’hexane. Ajoutez 75 mL d’hexane à la lame et injectez soigneusement 50 μL de dichlorodiméthylsilane (DMDCS) sous la surface de l’hexane (REMARQUE : éviter d’exposer le DMDCS à l’air). Incubez les toboggans avec un léger balancement pendant 1,5 heure. Rincez et sonicez les lames dans l’hexane pendant 1 minute puis répétez cette étape trois fois pour éliminer les résidus de DMDC. Faites sécher les lames à l’air libre et scellez-les sous vide dans des tubes de 50 mL (par exemple, Falcon ou tubes coniques). Les lames préparées peuvent être stockées à −20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
Assemblage et fonctionnisation des canaux d’écoulement
Un canal d’écoulement simple peut être assemblé à l’aide d’une lame en quartz, d’une toile de verre, d’un ruban double face, de pointes de pipette et d’époxy. Appliquez de fines bandes de ruban adhésif double face entre les trous de la lame en quartz et placez la gaine de couverture par-dessus. Scellez les bords les plus longs avec de l’époxy. Découpez environ 5 mm de segments à partir d’une pointe de pipette (à la fois la pointe étroite et le collier plus large) et insérez un trou dans un trou pour servir de sortie et l’autre dans un trou parallèle pour former un réservoir d’entrée. Fixez les deux avec de l’époxy. Le réservoir d’entrée doit retenir le liquide sans fuite avant l’injection. Pour faire passer les solutions par le canal, connectez un tube d’une seringue de 1 mL à la sortie.
Prétraiter les canaux séquentiellement avec les réactifs suivants pour fonctionner la surface : BSA biotinylée (0,2 mg/mL) pendant 5 minutes, Tween-20 (0,2 %) pendant 10 minutes, et NeutrAvidin (0,1 mg/mL) pendant 1 minute. Environ 100 μL de chaque solution suffisent par canal. Évitez d’aspirer plus de liquide que ce qui est présent dans le réservoir d’entrée, car cela introduirait de l’air dans le canal et générerait des bulles. Laissez un petit volume de solution dans le réservoir entre les étapes pour empêcher le canal de sécher. Rincez soigneusement avec 1× tampon TNK (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl) entre chaque étape. Ce traitement établit une surface biotine-NeutrAvidin pour l’immobilisation de l’ARN.
Préparez les duplex ARNm-attache immédiatement avant l’immobilisation en mélangeant un ARNm de 40 nM avec un câble ADN marqué par Cy5 biotinylé de 20 nM. Dénaturez le mélange à 75 °C pendant 5 minutes dans un tampon TNK 1× (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl), puis réfoldez à 37 °C pendant 15 minutes et équilibrez à 20 °C.
Diluez l’échantillon 50 fois dans un tampon d’imagerie (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl, 50 mM KCl, 4 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique, 0,01 % octéthylène glycol monododécyle éther, 0,8 % de glucose, inhibiteur de RNase 2 U/mL) et injectez-le dans le canal d’écoulement pour immobiliser les ARNm. Incubez pendant 1 minute, puis lavez avec un tampon d’imagerie complété par un système de récupération d’oxygène (165 U/mL glucose oxydase et 2170 U/mL catalase) pour réduire le photoblanchiment.
Préparez les complexes ARNs-Hfq en mélangeant les composants dans un ratio 1:1 jusqu’à une concentration finale de 250 nM dans un tampon TNK 1× et incubez pendant 5 à 15 minutes à température ambiante. Diluez les complexes par 50 dans le tampon d’imagerie contenant le système de récupération de l’oxygène et injectez-les dans le canal de flux immédiatement avant l’imagerie.
Acquisition de données à une seule molécule
Installez le microscope à fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) basé sur prismes en allumant la caméra EMCCD et les lasers. Montez la lame préparée avec les canaux d’écoulement assemblés sur l’étage du microscope et placez le prisme au-dessus. Utilisez un logiciel unique (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab) pour acquérir des données. Dans le logiciel, déterminez le niveau d’arrière-plan en sélectionnant AutoScale et copiez la valeur obtenue dans le champ Arrière-plan. Réglez la fréquence d’acquisition à 100 ms. Excite Alexa Fluor 555 ou Cy3 avec un laser 532 nm et Cy5 avec un laser 633 nm. Collecter simultanément les émissions des deux canaux grâce à un objectif d’immersion hydrique de 60×. Pour chaque film, commencez par dix images d’excitation 633 nm afin de localiser les ARNm marqués en Cy5 dans le champ de vision. Continuez à enregistrer pendant 5 minutes avec une excitation à 532 nm. Terminez l’acquisition par 1 s d’excitation à 633 nm pour vérifier le photoblanchiment Cy5. Cela produira le fichier film .pma, qui pourra être utilisé pour l’analyse.
Analyse de données à molécule unique
Analysez des fichiers .pma bruts à l’aide de scripts IDL personnalisés pour effectuer la cartographie des canaux donneur-accepteur et extraire les trajectoires d’intensité de fluorescence. Premièrement, enregistrez un film d’étalonnage à l’aide de billes fluorescentes multicolores détectables dans les canaux donneurs et accepteurs lors de l’excitation avec le laser 532 nm ou 633 nm. Utilisez ce film de calibration pour générer un fichier de cartographie qui aligne les canaux donneur et accepteur. Appliquez le fichier de cartographie résultant à tous les enregistrements expérimentaux pour identifier les paires donneur-accepteur correspondantes, détecter les taches fluorescentes et exporter les traces de temps d’intensité pour une analyse FRET en aval. Des instructions détaillées étape par étape sont fournies avec le script (https://github.com/Ha-SingleMoleculeLab).
Traces d’intensité de processus dans MATLAB en utilisant le script s_tr_E.m. Lancez le script et entrez dans le répertoire contenant les fichiers .traces et .pks, suivi de l’index du fichier et de la résolution temporelle. Sélectionnez la fenêtre de cadre utilisée pour l’identification des points lorsqu’on le demande. Le script affiche ensuite les intensités donneuse et acceptante par tache unique. Naviguez à travers les molécules en utilisant des commandes clavier (b pour revenir en arrière, g pour sauter à une molécule spécifiée). Définissez les bases des donneurs et accepteurs (k) et corrigez la fuite (l) en cliquant sur les graphiques lorsque nécessaire. Sauvegardez les traces acceptées individuellement sous forme de fichiers .dat contenant les intensités de temps, de donneur et d’accepteur en appuyant sur s. Utilisez les fichiers exportés pour l’analyse quantitative en aval.
Utilisez le programme peak-finder pour analyser les traces individuelles des smFRET et extraire les événements de liaison pour la quantification, y compris l’analyse du temps de séjour et les distributions d’états des FRÈTES. Lance le programme et ouvre le dossier contenant les fichiers de trace .dat exportés via le menu Fichier. Définissez les valeurs de référence et les valeurs de fuite donneur-accepteur déterminées précédemment à l’aide du script MATLAB. Ensuite, réglez les seuils d’intensité pour guider la détection automatique des pics de sorte que tous les événements de liaison vérifiés visuellement dépassent les valeurs sélectionnées. Si le bruit provoque la division d’un événement en plusieurs pics, fusionnez-les manuellement à l’aide de la fonction de fusion intégrée. Cliquez sur Enregistrer les pics pour exporter les événements détectés sous forme de fichiers .csv contenant l’heure de début, l’heure de fin et l’efficacité moyenne des frettes pour chaque événement. Les fichiers de sortie sont enregistrés dans le répertoire peaks, tandis que les valeurs de fret résolues par trame pour chaque événement sont écrites dans le répertoire peak-fret. L’efficacité des frettes est calculée en divisant l’intensité de fluorescence de l’accepteur par la somme des intensités donneur et accepteur, en utilisant des valeurs corrigées pour la fuite de fond et la fuite du donneur dans le canal accepteur. Inspectez manuellement les traces pour le photoblanchiment Cy5, identifiées par une baisse soudaine de l’efficacité des FRET accompagnée d’une augmentation de l’intensité Cy3. Lorsque le photoblanchiment se produit, supposons que la liaison persiste tant que la fluorescence Cy3 reste détectable, et corrigez les durées de pic en modifiant les fichiers .csv correspondants.
Importez les valeurs d’efficacité des frettes résolues par trame depuis les fichiers de frettes de crête dans GraphPad Prism. Générez des histogrammes de fréquences à fréquences en utilisant la fonction de distribution de fréquence et ajustez les distributions avec des modèles gaussiens pour identifier la population dominante de fréquences rapides.
Déterminez les temps de permanence pour les événements de liaison individuels en soustrayant l’association des points de temps de dissociation à l’aide d’un tableur. Calculez la fraction d’événements transitoires (<10 s) pour chaque répétition expérimentale. Des analyses statistiques ont été réalisées dans GraphPad Prism. Les comparaisons entre deux affections ont été évaluées à l’aide de tests t non appariés, et les comparaisons entre trois affections ou plus ont été analysées à l’aide d’ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey.
Résultats
La longueur de la graine détermine le régime dynamique de l’appariement ARNs-ARNm
Nous avons établi un test minimal à molécule unique pour tester comment les caractéristiques de séquence gouvernent le recuit médié par Hfq. Les ARN-modèles ont été conçus selon les architectures précédemment décrites des paires ARNs-m 16,17 dépendantes de Hfq et portaient un motif de liaison Hfq riche en adénosine sur l’ARNm ainsi qu’un site de liaison de bord riche en uridine sur l’ARNsn (Figure 1A). L’ARNsn a été marqué avec Alexa Fluor 555 (donneur) à l’extrémité 5ʹ et le câble ARNm-ADN avec Cy5 (accepteur), permettant la détection de proximité induite par l’appariement de bases via le FRET.
La variation de la complémentarité de la graine de 4, 5, 8 à 10 points base produisait des comportements dynamiques distincts. Avec une graine à 4 pb, les interactions étaient principalement transitoires et présentaient des efficacités de fretage hétérogènes, suggérant un appariement de bases incomplet (Figure 1B-D). En revanche, les graines à 8 et 10 points à base ont produit des duplex stables qui persistaient souvent pendant la fenêtre d’observation (Figure 1C). Les interactions ont produit l’état attendu de fréquence à fréquences élevées (FRET E ≈ 0,79-0,80, Figure 1D), cohérent avec un appariement complet de bases entre ARN. Une graine de 5 pb a produit des événements de liaison de courte durée mais bien définis (E FRET ≈ 0,66), fournissant une plage dynamique efficace pour les modifications ultérieures de la séquence ARN (Figure 1B-D). Nous avons donc utilisé la complémentarité à 5 points de base pour tous les tests en aval.
Des motifs de liaison Hfq plus forts augmentent la stabilité du complexe ARNs-ARNm
Nous avons ensuite demandé comment la résistance de la liaison Hfq module la durée de vie de la liaison à une complémentarité fixe de 5 pb. L’extension du motif ARNm de AAN4 à AAN6 augmentait significativement la probabilité de former des complexes stables (p < 0,001). La durée de vie moyenne est passée de 7,5 s à 18 s, et la fraction d’événements instables < 10 s est passée de 80 ± 2 % à 68,3 ± 2,9 % (Figure 2A-C).
Nous avons ensuite testé l’effet du motif de liaison Hfq sur l’ARNs. Le raccourcissement du site de liaison du bord de UUAUUUUUUU à CUUC (ARN-s, « bord court ») a produit des interactions très instables (durée de vie moyenne 1,9 s avec AAN4), et renforcer le motif de l’ARNm dans ce contexte n’a eu qu’un effet modeste (moyenne 3,0 s avec AAN6, non significative, Figure 2B,C). Ainsi, les deux partenaires contribuent à la stabilité du complexe produit en particulier, mais des contacts sRNA-Hfq faibles limitent les gains d’un motif ARNm plus fort.
Un espaceur entre les sites Hfq- et les sites de graines sur l’ARNm favorise des complexes à plus longue durée de vie
Hfq peut rester lié à la région AAN tout en utilisant sa surface de bord pour faciliter la recherche du site optimal de jumelaged’ARNss 16. Cette propriété suggérait qu’un espacement supplémentaire entre les deux régions de liaison de l’ARNm pourrait influencer la stabilité des interactions.
Pour tester cela, nous avons introduit un espaceur simple brin de 15 nts entre les sites de liaison Hfq et ARNss (N15). Cette modification a considérablement augmenté la durée de vie des événements de recuit stable de 7,5 s (AAN4) à 47 s (AAN4-N15) (p < 0,01) (Figure 3A,B). Le pourcentage d’événements de liaison durant moins de 10 s a également diminué de 80 ± 2 % à 44 ± 6 % (Figure 3C). Ces données indiquent qu’une flexibilité accrue entre les modules de liaison peut stabiliser les intermédiaires de recuit et favoriser des duplex à plus longue durée de vie.
DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :
Toutes les données soutenant les résultats de cette étude, y compris les trajectoires FRET à molécule unique, les ensembles de données traités et les scripts d’analyse, sont publiquement disponibles dans le dépôt de données Mendeley à l’adresse : doi :10.17632/3z8fng2c8g.1
Figure 1 : Effet de la complémentarité ARNs-ARNm sur l’efficacité de liaison. (A) test smFRET pour le recuit ARNs-mRNA. L’appariement de bases entre l’ARNss marqué par Alexa Fluor 555 et le complexe immobilisé d’attache mRNA-Cy5-ADN produit un signal FRET élevé. Les ARNm modèles contiennent un site de liaison Hfq (AAC)4 (bleu) et un site de liaison à l’ARNsn (S5, rouge), suivis de cinq nucléotides et de la région hybride ARN-ADN. Les ARNs comprennent un site de liaison au bord (orange). Les panneaux dans (B-D) sont regroupés selon la condition expérimentale (longueur de la graine). (B) Événement de liaison représentatif à l’ARNs-s-M sur une seule molécule d’ARNm. Des traces d’intensité de fluorescence de l’ARNsn marqué Alexa Fluor 555 (donneur, vert) et du câble Cy5-ADN (accepteur, rouge) sont montrées. Cy5 était directement excité pendant les dix premières et dernières images de l’enregistrement. (C) Rastergrammes représentant 50 molécules représentatives d’ARNm liées par sRNA-Hfq. Chaque barre horizontale représente une interaction ARNs-ARNm unique. (D) Histogrammes des efficacités des FRET pour les interactions entre ARNm et ARNst contenant 4 pb (N = 416 ARNm), 5 pb (N = 513 ARNm), 8 pb (N = 191 ARNm) ou 10 pb (N = 105 ARNm) régions complémentaires. Les efficacités des FRET ont été calculées à partir des intensités donneuses et accepteurs corrigées au départ et à la fuite pour des événements de liaison individuels à intervalles de 0,1 s. Les ajustements gaussiens (bleus) indiquent la population dominante de frets et n’ont pas été utilisés pour calculer E_FRET valeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 2 : Effet de la longueur du motif de liaison à Hfq sur les interactions ARNs-ARNm. La région de paire de bases dans toutes les variantes mesure 5 pb de long. (A) Rastergrammes montrant 50 ARNm représentatifs liés par des complexes ARNs-Hfq. Chaque barre horizontale représente une seule interaction. Les diagrammes dessinés ci-dessus illustrent les plans d’ARN correspondants avec des variations du nombre de répétitions (AAC) dans l’ARNm et de la longueur de la région de liaison du bord dans l’ARNsn (SR = « bord court »). Coloriation comme dans la Figure 1A. (B) Des diagrammes de dispersion de la durée de vie de liaison ARNs-ARNm. Chaque point représente un événement de liaison unique. Durée de vie moyenne (ligne horizontale rouge) : 7,5 s pour l’ARNm-AAN4 + ARNs-s-(ARNm = 188), 18 s pour ARNm-AAN6 + ARNs-s-ARN1 (N = 142 ARNm), 1,9 s pour ARNm-AAN4 + ARNs-SR (N = 85 ARNm), et 3 s pour ARNm-AAN6 + ARNs-SR (N = 149 ARNm). (C) Graphique à barres montrant le pourcentage d’événements de liaison inférieurs à 10 s. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport à deux ensembles de données indépendants. Analyse statistique par ANOVA unidirectionnelle avec le test post-hoc de Tukey pour les comparaisons multiples. p < 0,001, ****p < 0,0001 ; NS, pas significatifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure 3 : Effet de la longueur de l’espaceur entre les sites de liaison Hfq et ARNs-sV sur les interactions ARNs-ARNm. La région de paire de bases dans toutes les variantes mesure 5 pb de long. (A) Rastergrammes représentant 50 ARNm représentatifs liés par un complexe ARNs-Hfq. Chaque barre horizontale représente un événement de liaison unique. Les diagrammes dessinés ci-dessus illustrent le dessin d’ARN correspondant. N15 = 15 nt espaceur de suite aléatoire. Coloriation comme dans la Figure 1A. (B) Des diagrammes de dispersion de la durée de vie de liaison ARNs-ARNm. Chaque point représente un événement de liaison unique. Durée de vie moyenne (ligne horizontale rouge) : 7,5 s pour l’ARNm-AAN4 + ARNs-s-M (N = 188 ARNm) et 47 s pour l’ARNm-AAN4-N15 + ARNs-s-M (N = 289 ARNm). (C) Graphique à barres montrant le pourcentage d’événements de liaison inférieurs à 10 s. Les barres d’erreur représentent l’écart-type par rapport à deux ensembles de données indépendants. Analyse statistique par test t non apparié. **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
Figure supplémentaire 1 : Purification d’E. coli Hfq. Analyse SDS-PAGE de l’expression et de la purification de Hfq. (Haut) Échantillons collectés lors de la purification sur une colonne d’affinité Ni2+ (HiTrap), y compris avant l’induction, après l’induction, pellet, lysat, charge, flow-through, fractions de lavage et fractions de pic éluées. (Bas) SDS-PAGE des fractions de pointe après chromatographie par exclusion de taille sur une colonne HiLoad 16/600 Superdex 200. Les formes monomériques (~11 kDa) et hexamériques (~66 kDa) de Hfq sont indiquées. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
Cette étude établit un test à molécule minimale unique pour analyser comment des caractéristiques spécifiques de la séquence d’ARN déterminent l’efficacité du recuit ARNs-m médié par Hfq. En variant la longueur de la graine, la force du motif de liaison Hfq et l’espacement entre les modules de liaison, nous avons quantifié directement comment chaque paramètre contribue à la stabilité duplex à la résolution d’une seule molécule. Contrairement aux mesures d’ensemble, qui rapportent des effets moyens de population, cette approche résout directement les événements de liaison et de dissociation individuels, permettant de mesurer l’hétérogénéité cinétique et les interactions transitoires. Nos résultats montrent que même les régions courtes de graines peuvent s’engager de manière transitoire, tandis que les graines plus longues produisent des duplex stables avec une durée de vie prolongée. Ces résultats sont cohérents avec des données antérieures in vivo et d’ensemble montrant que les régions naturelles de graines dans les ARNs bactériens couvrent généralement 6 à 12 nucléotides et forment rarement des duplex entièrementcomplémentaires 21,22,23.
Nous avons également constaté que les motifs de liaison Hfq à l’ARNm et à l’ARNss-s influencent fortement la stabilité du duplex. L’extension du motif AAN sur l’ARNm augmentait la durée de vie de liaison, tandis que raccourcir le site de liaison du rebord de l’ARNsn les déstabilisait nettement. Cela soutient un modèle coopératif dans lequel le visage distal de Hfq ancre des motifs d’ARNm riches en adénosine, et le rebord recrute des ARNss riches en uridine pour favoriser un alignement efficace des régionscomplémentaires 9,17. Contrairement aux tests génétiques ou basés sur des rapports de rédaction, qui détectent généralement uniquement des résultats régulateurs productifs, ce système sépare quantitativement la stabilité de liaison des effets en aval, permettant une comparaison directe de la manière dont les caractéristiques individuelles de la séquence modulent la durée de vie des interactions physiques. Un motif fort de liaison de bord est particulièrement important lorsque des réarrangements structurels sont nécessaires pour l’appariement ARNs-ARNm, car il améliore la rétention d’ARN sur Hfq17. On pense également que le rebord favorise le balayage latéral des ARNm par les complexesARNs-Hfq 16, une propriété qui peut être particulièrement importante lorsque les sites cibles sont éloignés de la région de liaison Hfq. Nos résultats avec un espaceur de 15 nt entre les sites de liaison confirment cette vision, montrant qu’une flexibilité supplémentaire entre le motif graine et Hfq améliore la stabilité de l’appariement, possiblement en réduisant les contraintes stériques lors de l’échange de brins.
Au-delà des systèmes naturels, les résultats sont pertinents pour la conception d’ARNs synthétiques ou modifiés. La plupart des stratégies de conception existantes se concentrent sur l’optimisation d’une région de départ ou d’un échafaudagegénéral 23,24,25, mais nos données mettent en avant des déterminants supplémentaires tels que l’espacement entre le motif de liaison Hfq et la région cible. Parce que les caractéristiques de séquence sont introduites de manière contrôlée et modulaire, l’essai fournit un cadre expérimental systématique pour tester les règles de conception. Ce principe pourrait guider la future construction d’ARNs artificiels avec une efficacité réglementaire améliorée.
Bien que cette approche permette une analyse quantitative et reproductible des interactions ARN-ARN, elle présente également des limites. L’analyse étudie les régions entièrement complémentaires, tandis que la plupart des interactions physiologiques ARNs-mRN contiennent des inadéquations et des bombements pouvant affecter la reconnaissance et la régulation. La méthode mesure la durée de vie de liaison ARNs-ARNm mais ne traite pas directement les résultats régulateurs en aval, tels que l’inhibition de la traduction ou la désintégration de l’ARNm. Les futures adaptations de ce test pourraient inclure des régions de graines incompatibles, une teneur variée en GC, ou des ribosomes et des dégradosomes afin d’examiner systématiquement comment ces facteurs influencent la cinétique de liaison.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Nous remercions la Professeure Sarah Woodson pour avoir facilité l’accès à l’instrumentation à molécule unique. Cette étude a été financée par le Centre National des Sciences, Pologne (2022/46/E/NZ1/00462 à EMM), ainsi qu’une subvention d’installation EMBO (IG 5730-2024 à EMM).
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,45 & mu ; Filtre m | Millipore | HABG04700 | |
| Colonne Hi-Trap de 5 mL ; | Cytiva | GE17-0408-01 | |
| Acétone ; | Merck | 270725 | Qualité HPLC |
| Solution d’acrylamide : bis-acrylamide | Merck | A2792-100ML | |
| ALEXA555 Ester succinimidyle NHS | Thermo Fischer | A20009 | |
| Filtres centrifuges Amicon Ultra (NMWL, 3 kDa) | Merck | UFC900308 | |
| Chlorure d’ammonium | Merck | 1330-500G | |
| Ampicyline | Merck | A9518-5G | |
| ATP | Linegal Chemicals | K054.1 ; | |
| Bêta-mercaptoéthanol | Merck | M3148-500ML | |
| BIO-BSA | Merck | A8549-10MG | |
| Colonnes Bio-Spin avec Bio-Gel P-30 | Bio Rad | 7326231 | Pour purifier l’ARN marqué |
| Catalase | Merck | C9322 | |
| CTP | Linegal Chemicals | K057.4 ; | |
| Ester HNS Cy3 | Cytiva | PA13105 | |
| Ester succinimidyle du NHS Cy5 | Cytiva | PA15101 | |
| DDT | Thermo Fischer | R0861 | |
| Dichlorodiméthylsilane | Merck | 440272 | |
| Oligomères d’ADN (câble) un liaison 5&prime ;-amino C6 ; | Thermosciences | N/D | |
| Dnase I | Thermo Scientific | 18047019 | |
| EDC | Thermosciences | PG82079 | |
| EDTA | Merck | ED2SS-1KG | |
| Caméra EMCCD & nbsp ; | Andor | ||
| Éthanol | Merck | 1085430250 | |
| Glucose | Merck | D9434-1KG | |
| Glucose oxydase | Merck | G2133-50KU | |
| Glycérol | Merck | G5516-1L | |
| GMP | Merck | G8377 | |
| GTP | Linegal Chemicals | K056.4 ; | |
| Hcl | Merck | 1.00318 | |
| Hexane | Thermo Fischer | 045652.M1 | |
| Colonne d’exclusion de taille HiLoad 16/60 Superdex 200 | Cytiva | GE28-9893-35 | |
| IPTG | Merck | 420322-1GM | |
| KCl | Merck | P9541-1KG | |
| KOH | Merck | 484016-1KG | |
| Chlorure de magensium | Merck | M8266-1KG | |
| Méthanol & nbsp ; | Merck | 34885-M | Qualité HPLC |
| Neutravidine | Thermo Fischer | 31000 | |
| Sulfate de nickel | Merck | 1067261000 | |
| Nikkol | Merck | P8925-1G | |
| Polymérase Q5 | NEB | M0491S | Utilisé pour la production de gabarit de transcription in vitro |
| RNase A | Thermosciences | EN0531 | |
| RNasin Plus | Promega | N2611 | |
| Acétate de sodium | Merck | S7545-100G | |
| Chlorure de sodium | Sigma-Aldrich | S3014-1KG | |
| Spermidine | Merck Life Science | S2626 | |
| Tris Base | Thermo Scientific | 17926 | |
| Trolox | Merck | 238813-1G | |
| Urée | Merck | U1250-5KG | |
| UTP | Linegal Chemicals | K055.3 ; |
Références
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