Un flux de travail pour l’imagerie en temps réel et l’analyse quantitative des réseaux de microtubules acentrosomaux dans les ovocytes de Drosophila

Summary

Ici, nous présentons un protocole qui combine l’imagerie en temps réel avec des outils d’analyse automatisée pour analyser la dynamique des microtubules dans l’ovocyte de Drosophila . Ce flux de travail permet une mesure efficace et reproductible du comportement des microtubules, y compris la croissance, l’orientation, la vitesse et l’organisation spatiale, et peut être adapté à d’autres types cellulaires une fois optimisé.

Abstract

Le cytosquelette du microtubule (MT) est essentiel pour de nombreuses fonctions cellulaires, notamment la forme cellulaire, la polarité, la migration et la division. Alors que les centrosomes fonctionnent comme le principal centre organisateur de la MT (MTOC) dans les cellules animales en division, de nombreuses cellules différenciées, y compris les ovocytes de Drosophila , dépendent de voies acentrosomales pour assembler les réseaux MT. Contrairement à la vaste connaissance de l’organisation de la MT dans les cellules proliférantes, on sait peu de choses sur la façon dont les réseaux MT s’assemblent sans centrosomes. Les ovocytes de Drosophila fournissent un modèle puissant pour étudier l’organisation et la dynamique de la MT acentrosomal. Cependant, leur réseau dense de MT remet en question l’imagerie conventionnelle. L’imagerie en direct permet la visualisation en temps réel de la croissance et de l’orientation de la MT, mais les méthodes d’analyse standardisées restent limitées. Ici, nous présentons un protocole basé sur l’imagerie en temps réel pour analyser la dynamique de croissance de la MT dans les ovocytes de Drosophila en utilisant la protéine fluorescente verte (End-Binding Protein 1 (EB1)-Green Fluorescent Protein (GFP), une protéine de suivi à extrémité positive qui marque les sites de polymérisation active de la MT. La microscopie confocale Airyscan haute résolution permet la détection des comètes EB1, tandis que les macros personnalisées des Fidji et les scripts Python fournissent une quantification rationalisée et reproductible de la densité, de la vitesse, de la longueur et de l’orientation des comètes. Nous avons validé cette méthode en comparant les ovocytes témoins à ceux soumis à une dépolymérisation MT induite par le froid, ainsi qu’aux mutants de Patronine (CAMSAP chez l’humain), un stabilisateur conservé à l’extrémité moins de la MT et un composant central des centres organisateurs microtubulaires non centrosomaux (ncMTOC), comme contrôle positif pour une dynamique MT altérée. Nos analyses ont révélé des dynamiques de la MT spécifiques à une région, incluant l’enrichissement antérieur des comètes EB1 et des biais d’orientation caractéristiques, et ont confirmé la sensibilité du flux de travail à la détection de perturbations subtiles dans la croissance de la MT. Cette approche fournit un cadre fiable et convivial pour étudier le comportement de la MT dans les ovocytes. Le protocole étape par étape permet d’étudier les régulateurs de la MT dans ce contexte et peut être adaptable à d’autres types cellulaires différenciés, tels que les neurones et les cellules épithéliales, avec une optimisation appropriée. Plus largement, il soutient les études mécanistes et les criblages génétiques examinant la diversité des architectures MT qui sous-tendent des fonctions cellulaires spécialisées.

Introduction

Le cytosquelette du microtubule (MT) est un composant essentiel de la cellule eucaryote, jouant un rôle essentiel dans l’établissement et le maintien de la forme, de la polarité et de la division cellulaires. Le comportement dynamique des polymères MT, caractérisé par la croissance et le retrait, est crucial pour de nombreux procédés basés sur la MT ^1,2. L’assemblage de différents réseaux MT dépend de l’action combinée des centres organisateurs de microtubules (MTOC), à partir desquels les MT sont nucléés, et de l’activité de diverses protéines régulatrices MT qui contrôlent la stabilité, l’orientation et la dynamique des MT ^1,2,3. Le MTOC le mieux étudié est le centrosome, qui génère des réseaux radiaux de MT importants pour réguler la forme et la polarité cellulaires en interphase et pour l’assemblage du fuseau mitotique dans la^{mitose 4,5}. Cependant, lors de la sortie ou de la différenciation mitotique, comme chez les neurones et les cellules épithéliales, l’activité centrosomale du MTOC est souvent atténuée, et dans des cas extrêmes, comme dans les ovocytes, elle peut être^{éliminée 6,7}. Cela est fréquemment associé à un remodelage spécifique au type cellulaire du cytosquelette MT, avec l’attribution de la fonction MTOC à d’autres sites ^{cellulaires 2,3,8}, généralement appelés MTOCs non centrosomaux (ncMTOCs). Bien que des progrès substantiels aient été réalisés dans l’élucidation de l’organisation des MT dans les cellules mitotiques, on sait relativement peu de choses sur la façon dont les MT sont nucléées, stabilisées et disposées spatialement dans les cellules animales sortant de mitose ou en cours de^{différenciation 2}. Notamment, chez les organismes vivants, la plupart des cellules ne se divisent pas ; ils sont sortis du cycle cellulaire et/ou se sont différenciés. Il est donc crucial de comprendre comment le cytosquelette de la MT est assemblé et régulé dans ces contextes. Ces connaissances sont essentielles pour découvrir comment des architectures MT distinctes sont établies pour soutenir des fonctions cellulaires spécialisées.

L’ovocyte de Drosophila melanogaster fournit un système puissant pour étudier l’organisation et la fonction du MT acentrosomal. À des stades intermédiaires de l’oogenèse, l’activité des centrosomes est^{atténuée 9}, et les MT sont générés à partir de ncMTOCs localisés au cortex antéro-latéral des ovocytes (Figure 1B). Ce réseau MT est essentiel pour la localisation des ARNm, protéines et organites maternels, qui sont à leur tour essentiels pour l’établissement des futurs axes embryonnaires et son développement^10,11. Des travaux antérieurs ont montré que les ncMTOCs de l’ovocyte sont composés de la protéine MT à l’extrémité négative Patronine, qui forme un complexe avec la protéine spectraplakine Shot, ancrée au cytosquelette cortical. Il a été proposé que les MT se développent à partir de fragments courts de MT générés par la coupure d’enzymes telles que la katanine, qui peuvent servir de graines pour une polymérisation ultérieure^{de MT 12}. Des mécanismes similaires ont été proposés dans d’autres cellules différenciées, comme les^{neurones 13}, où l’activité centrosomale est réduite. Cependant, les mécanismes par lesquels la coupure génère des réseaux TM complexes, comme dans l’ovocyte, restent mal compris. Il n’est toujours pas clair si les MT dans ces contextes se forment principalement par réarrangement par coupure ou par une combinaison de séparation et de nucléation de MT de novo. La complexité du réseau de MT d’ovocytes en fait un système idéal pour étudier comment les MT sont générés et organisés en dehors du contexte centrosomal bien connu. Notamment, cela pose également un défi pour l’imagerie et l’analyse : le réseau dense de MT à l’intérieur de l’ovocyte rend difficile la résolution des MT individuelles en utilisant des approches conventionnelles d’immunocoloration ou d’imagerie^{statique 2,14}.

L’imagerie en temps réel a grandement amélioré la capacité d’étudier les réseaux MT, car elle permet de visualiser en temps réel les événements de polymérisation MT, offrant des informations clés sur la dynamique et l’orientation de la croissance MT. Des études antérieures ont réussi à analyser la dynamique de croissance du MT dans les ovocytes à l’aide d’imagerie en direct des marqueurs à l’extrémité^{positive 14, 15, 16}. Cependant, dans de nombreux cas, les procédures d’analyse d’image utilisées pour quantifier la dynamique de la MT ne sont décrites que brièvement, reposent sur des implémentations personnalisées ou spécifiques au laboratoire, ou ne sont pas rendues publiques, limitant ainsi la reproductibilité et l’adoption plus large. Notre méthode s’appuie sur ces approches précédentes en fournissant un pipeline d’analyse entièrement documenté, ouvertement accessible et convivial, permettant une quantification standardisée des paramètres de croissance du MT à travers les ensembles de données et les conditions expérimentales. Dans ce protocole, la dynamique de la MT est imagée en milieu de l’oogenèse, lorsque le cytosquelette de la MT est organisé par des réseaux MT acentrosomaux. Les MT en croissance sont visualisées à l’aide de l’EB1-GFP, une protéine de suivi plus-end^{de MT 17,18}, et sont obtenues à l’aide d’une microscopie confocale à balayage laser avec un détecteur à réseau en mode haute vitesse. La nouveauté de notre approche réside dans son analyse d’images : un pipeline entièrement documenté, convivial et étape par étape, qui exige que les utilisateurs ne sélectionnent que les régions d’intérêt. Le traitement et la quantification d’images sont facilités par des macros Fiji personnalisées et des scripts Python, permettant une détection efficace et reproductible des comètes EB1 ainsi que l’extraction de paramètres, notamment l’orientation de croissance, la vitesse et l’organisation spatiale. Ce cadre fournit un outil standardisé et accessible pour comparer la dynamique de la MT entre les conditions expérimentales.

Dans ce manuscrit, nous appliquons cette méthode pour comparer la croissance du MT dans les ovocytes témoins et dans les ovocytes dépolymérisés par traitement à froid. Cela sert à valider le protocole et à soutenir de futures études visant à disséquer le rôle des protéines candidates dans la régulation de la MT.

Protocol

1. Génétique des mouches

REMARQUE : Pour visualiser les MT dans l’ovocyte, ce protocole utilise un transgène public (Table of Materials) qui exprime la protéine de suivi plus-end MT EB1, marquée avec une balise GFP (protéine fluorescente verte^{) 19}. EB1-GFP se lie spécifiquement aux MT en croissance ainsi qu’aux extrémités, apparaissant comme des « comètes » fluorescentes se déplaçant dans la direction de la^{polymérisation 17,18}. Cela permet de visualiser et de quantifier la dynamique de croissance des MT, y compris l’orientation de croissance, la vitesse et la distribution spatiale au sein de^{l’ovocyte 14,20}.

1. Maintenir toutes les souches de mouches sur un milieu standard de semoule de maïs-agar à 25 °C en utilisant les techniques d’élevage standard de Drosophila .
2. Croisez 8 à 12 mouches femelles vierges portant un transgène UAS-ARNi ciblant l’expression d’une protéine d’intérêt, à 5 mâles du génotype matα4-Gal4-VP16 ; EB1-GFP.
   REMARQUE : Pour simplifier les croisements génétiques, générez un stock de mouches en croisant la lignée V32-Gal4 (insertion sur le deuxième chromosome) avec la lignée EB1-GFP (insertion sur le troisième chromosome). Parce que l’EB1-GFP est sous le contrôle d’un promoteur UASp, le pilote V32-Gal4 induit l’expression d’EB1-GFP ainsi que de tout transgène UAS-ARNi introduit dans des croisements ultérieurs si désiré.
3. Après l’éclosion de la progéniture F1, sélectionnez 10 à 15 femelles du génotype désiré (moins d’une semaine).
4. Transférez les femelles, ainsi que 2 à 3 mâles, dans un flacon frais contenant une petite quantité de pâte de levure à la surface de la nourriture. La pâte de levure stimule l’oogenèse et favorise la progression du développement de la chambre des œufs. La présence des mâles assure l’accouplement, ce qui favorise également la maturation des ovocytes et la ponte. Maintenez les mouches à 25 °C pendant 2 jours.
   REMARQUE : Pour étudier le rôle de gènes spécifiques dans la dynamique de la MT, le knockdown protéique peut être obtenu en utilisant le système UAS/^{GAL4 21}, avec le pilote maternel public matα4-Gal4-VP16 (également connu sous le nom de V32-Gal4 ; Tableau des matériaux), qui initie l’expression de Gal4 dans la lignée germinale à partir des états 3 à 4 de l’oogenèse. Comme décrit ci-dessus, ce moteur induit l’expression d’EB1-GFP ainsi que de constructions UAS-ARNi, permettant l’épuisement des protéines d’intérêt seulement après le stade du germarium. Cette stratégie contourne les fonctions précoces potentielles des protéines ciblées lors des divisions mitotiques initiales et de la spécification des ovocytes. Lors de ces expériences, les mouches doivent être préparées comme décrit précédemment.

2. Dissection des ovaires

1. Anesthésiez les femelles F1 à l’aide de CO₂ sur un tapis anti-mouche standard et sélectionnez une femelle pour la dissection.
2. Transférez la femelle sélectionnée directement dans une plaque à fond en verre de 35 mm (avec une épaisseur de verre de 0,13 à 0,15 mm) et placez une goutte d’huile d’imagerie sur le dessus de la mouche.
3. Positionnez la mouche face face au ventral vers le haut (ailes vers le bas). À l’aide d’une seule pince, tenez doucement le bas du thorax avec une pince, et avec une seconde pince, pincez un peu la cuticule abdominale à l’extrémité postérieure de l’abdomen.
4. Extraire doucement le tube reproducteur en le tirant délicatement par l’ouverture.
5. Isoler les ovaires puis les ovarioles individuels en les faisant doucement glisser à travers l’huile à l’aide d’une pince à épiler. Lors de la manipulation des ovaires, maintenez-les toujours près des anciennes chambres ovules (stades 13 à 14) afin d’éviter d’endommager les stades intermédiaires plus fragiles (stades 6 à 9), qui sont ceux d’intérêt pour l’imagerie (Figure 1A, B).
6. Saisir l’extrémité antérieure de l’ovaire, où se trouvent le germarium et les chambres ovocytaires à un stade précoce (Figure 1A,B). Appliquez une tension lente et régulière pour séparer les ovaires individuellement. En tirant, des chambres d’œufs à différents stades de développement émergent. Ce processus peut être répété plusieurs fois par ovaire pour isoler des ovaroles^{supplémentaires 22} (voir la vidéo pour la démonstration).
   REMARQUE : Pour les ovocytes soumis à un traitement à froid pour dépolymériser la MT, les dissections ont été réalisées comme décrit précédemment, mais en utilisant un tampon BRB-80 au lieu d’huile d’imagerie. Les ovaires disséqués ont ensuite été transférés dans des microtubes contenant du BRB-80 et incubés sur glace pendant 15^{minutes 23}. Après l’incubation, les ovaires ont été transférés dans une plaque à fond de verre contenant de l’huile d’imagerie, et le protocole a été repris à partir de l’étape 3.1.

3. Imagerie en direct

1. Placez le plat à fond en verre sur la scène du microscope à l’aide du porte-lames approprié.
2. Sélectionnez les chambres ovulaires de stade 7 ou 8 pour l’imagerie.
   REMARQUE : Les chambres d’œufs à ces stades peuvent être identifiées en fonction de la taille des ovocytes et de la position nucléaire. L’ovocyte est nettement plus grand que les cellules nourrices individuelles et occupe environ un tiers (stade 7) à la moitié (stade 8) de la chambre des œufs. Le noyau de l’ovocyte est positionné dans le cortex antérieur de l’ovocyte, adjacent aux cellules^{infirmières 24}.
3. Évitez les chambres ovules d’imagerie qui montrent une discontinuité dans la couche folliculaire externe ou d’autres signes de dommages, pouvant indiquer une perturbation mécanique causée par la pince. Pour une qualité d’image optimale, utilisez un système d’imagerie confocale rapide avec un rapport signal/bruit (SNR) élevé et un objectif de 63x (1,40 NA, immersion en huile). Assurez-vous de suivre les critères d’échantillonnage de Nyquist-Shannon.
4. Ajustez la mise au point et déterminez l’exposition appropriée, car elle peut varier selon la construction EB1 utilisée (par exemple, différents promoteurs ou balises fluorescentes) et le système de microscope. Le signal doit être suffisamment brillant pour suivre la dynamique des comètes, mais sans être saturé ni obscurci par la fluorescence de fond.
5. Réglez le laser à 488 nm pour exciter le fluorophore GFP (puissance laser de 10 % ; gain du détecteur = 750 V). Sélectionnez une fenêtre d’émission appropriée de 500–550 nm ou un ensemble de filtres équivalent pour le fluorophore GFP.
6. Acquérir des films en accéléré d’au moins 4 minutes de durée, en utilisant un intervalle d’images de 500 ms (2 images/s) pour obtenir suffisamment de données afin de suivre chaque MT et les fins. (Vidéo supplémentaire 1, illustre une acquisition en accéléré représentatif adaptée à une analyse ultérieure du suivi MT).
7. Traiter les images acquises à l’aide du traitement par détecteur à réseau dans le logiciel d’acquisition du microscope avec la force de filtre de traitement par défaut.
   REMARQUE : Une fois immergés dans de l’huile d’imagerie, les ovaires disséqués restent viables jusqu’à 90 minutes. Durant cette période, les chambres à œufs peuvent être imaginées sans signes significatifs de dégénérescence. Après cette période, une nouvelle femelle doit être disséquée et des chambres d’œufs fraîches préparées pour^{l’imagerie 20}.

4. Traitement d’image

Effectuez le flux de travail suivant pour générer des graphiques et des statistiques afin de quantifier divers paramètres associés à la dynamique de la MT. Exécutez chaque étape soit automatiquement via une macro/script, soit manuellement en suivant le protocole (Figure 2). Toutes les macros Fiji, scripts de suivi et code d’analyse Python utilisés dans ce flux de travail sont fournis sous forme de fichiers de codage supplémentaires 1 à 7.

1. Prétraitement d’image - ÉTAPE 1
   Les étapes suivantes préparent les images brutes en accéléré en corrigeant le photoblanchiment et en réduisant le bruit de fond, assurant ainsi la stabilité du signal pour le suivi. Premièrement, la visibilité EB1 est améliorée à l’aide d’un filtre à différence de gaussienne (DoG), qui fonctionne comme un filtre passe-bande spatial. En soustrayant une image très floue d’une image légèrement floue, ce procédé supprime la brume cytoplasmique basse fréquence et le bruit de pixels à haute fréquence tout en isolant le signal limité par la diffraction des comètes EB1. Deuxièmement, un filtre à gradient temporel est appliqué pour mettre en valeur spécifiquement les pointes MT en croissance. La pile d’images est découpée pour mapper la dimension temporelle à l’axe spatial Y. Une convolution 1D avec un noyau [-1 0 1] est ensuite appliquée pour calculer la dérivée temporelle de chaque pixel, en mettant en évidence le bord d’attaque des comètes en mouvement où l’intensité augmente le plus rapidement. La pile est ensuite remis à ses dimensions d’origine, fusionnée dans une image composite, puis exportée pour analyse.
   REMARQUE : Cette étape peut être exécutée en batch pour tous les fichiers d’un dossier en faisant glisser le fichier macro File1.Step1_MTs_macro.ijm (Fichier de codage supplémentaire 1) en Fidji et en exécutant la macro.
   1. Installation préalable de plugins (configuration unique)
      1. Lancez les Fidji. Naviguez dans Plugins > Installer dans la barre de menu.
      2. Dans le navigateur de fichiers, sélectionnez le fichier File_7_Kalman_Stack_Filter_Compiled.jar (Supplementary Coding File 7) fourni avec ce protocole.
      3. Lorsque vous êtes invité à enregistrer le plugin, assurez-vous que la destination est le dossier plugins par défaut dans votre dossier d’installation Fiji et cliquez sur Enregistrer.
      4. Redémarrer Fiji pour terminer l’installation.
         REMARQUE : Cette version compilée du plugin est identique à la version intégrée de Fiji, mais elle supprime la nécessité d’une installation séparée du Java Development Kit (JDK), simplifiant ainsi le processus d’installation.
   2. Correction de l’eau de Javel et réduction du bruit :
      1. Ouvrez Fiji, puis ouvrez chaque fichier via le plugin d’importation Bio-Formats
      2. Compensez la décroissance de la fluorescence au fil du temps en lançant le plugin Correction de Javilhage, en utilisant la correction de décoloration à rapport simple (fond = 0).
      3. Exécutez le filtre de pile de Kalman compilé (acquisition_noise = 0,1 ; polarisation = 0,7) pour supprimer le bruit aléatoire de photons tout en préservant la véritable dynamique du signal dans le temps
      4. Recadrez la dimension temporelle de l’image résultante pour réduire le temps de traitement, si désiré.
         REMARQUE : Ces étapes génèrent une image détachée, qui apparaît plus tard comme canal 1 à la fin de l’étape 1 (4.1.5) (Figure 3A). Il est recommandé d’exclure les 5 à 10 premières images (points temporels), car la fenêtre roulante du filtre de Kalman ne filtre que partiellement ces images initiales.
   3. Différence d’amélioration des caractéristiques des Gaussiennes (DoG) :
      1. Dupliquez l’image de la version 4.1.2.4 deux fois (Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Dupliquer).
      2. Appliquez le plugin Gaussian Blur à une copie en utilisant un low sigma (σ = 1).
      3. Appliquez le plugin Gaussian Blur à l’autre copie en utilisant un high sigma (σ = 8).
      4. Ouvrez le plugin Image Calculator et soustrayez l’image high sigma de l’image low sigma (= Low – High) pour isoler les détails fins.
      5. Supprimez l’arrière-plan en utilisant le > Math Soustraction et sélectionnez une valeur (seuil DoG = 100) pour ne conserver que le signal réel si nécessaire.
         REMARQUE : Ces étapes génèrent une image de différence de gaussienne, qui apparaît plus tard comme canal 2 à la fin de l’étape 1 (4.1.5) (Figure 3B).
   4. Amélioration du signal EB1-GFP :
      1. Sélectionnez l’image de 4.1.2.4 et utilisez le plugin Reslice avec les réglages : en haut, pas d’interpolation.
      2. Utilisez le plugin 2D Convolve avec noyau [–1 0 1] pour améliorer les pointes MT.
      3. Utilisez à nouveau le plugin Reslice avec les mêmes réglages pour restaurer les dimensions originales de l’image.
      4. REMARQUE : Ces étapes généreront une image avec un signal EB1-GFP amélioré. Cette image apparaîtra plus tard comme canal 3 à la fin de l’étape 1 (4.1.5) (Figure 3C).
      5. Fusionner les canaux et exporter l’image :
         1. Fusionnez l’image MT EB1-GFP (4.1.2.4) avec l’image Difference of Gaussians (4.1.3.5) et l’image d’amélioration du signal EB1-GFP (4.1.4.3) en utilisant le plugin Merge Channels. Assurez-vous que l’image à utiliser pour une analyse ultérieure est placée sur la chaîne 3 pendant le processus de fusion.
         2. Enregistrez le fichier résultant en .tif, en utilisant le format de nom : « filename »_processed.tif. Assurez-vous que l’image utilisée pour l’analyse en aval se termine par _processed.tif
2. Régions d’intérêt (ROI) - ÉTAPE 2
   À cette étape, trois ROI seront définis le long de l’axe antéropostérieur de l’ovocyte : antérieur (ROI1), moyen (ROI2) et postérieur (ROI3). Effectuer cette segmentation spatiale pour permettre l’analyse de la dynamique de la MT dans différentes régions de l’ovocyte.
   REMARQUE : Cette étape 2 peut être exécutée pour chaque « nom de fichier »_processed.tif en faisant glisser le fichier macro File_2_Step2_MTs_macro.ijm (Fichier de codage supplémentaire 2) jusqu’aux Fidji et en appuyant sur Exécuter. La macro invite l’utilisateur à dessiner manuellement un rectangle dans l’ovocyte. La région la plus proche du début du polygone (premier clic) correspond au premier ROI. La région rectangulaire sélectionnée sera automatiquement divisée en ROI rectangulaires égaux. Si aucun retour sur investissement n’est sauvé, les étapes suivantes s’exécuteront dans l’image complète.
   1. Définition du retour sur investissement :
      1. Ouvrez le fichier cible via les plugins → Bio-Formats → Bio-Formats Importer.
      2. Utilisez l’outil Polygone pour dessiner une région d’intérêt couvrant la région désirée.
      3. Ajoutez la région sélectionnée au gestionnaire de ROI (appuyez sur la touche T).
      4. Répétez l’étape 4.2.1 pour connaître le nombre de ROI dont vous avez besoin.
   2. Mesurer et exporter la zone :
      1. Sélectionnez le premier ROI
      2. Exécutez Analyze → Measure, et enregistrez la valeur Area comme fichier nommé : « filename »_processed_RoiArea.csv
         REMARQUE : Le nom de fichier doit correspondre au nom de l’image d’origine et se terminer par : _processed_RoiArea.csv
      3. Utilisez le gestionnaire de ROI pour économiser les ROI. Utilisez le même nom de fichier que le. Extension du ROI pour un ROI unique, ou l’extension .zip pour plusieurs ROI.
3. Détection et suivi des comètes EB1-GFP - ÉTAPE 3
   Utilisez le plugin^{TrackMate 25} pour détecter les comètes EB1-GFP et suivre leur déplacement dans le temps.
   REMARQUE : STEP 3 peut être appliqué à chaque « nom de fichier »_processed.tif en faisant glisser le fichier macro File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py (Supplementary Coding File 3) dans Fiji et en appuyant sur RUN. Ensuite, sélectionnez un dossier à traiter. Les ROI seront automatiquement chargés et l’analyse sera effectuée pour chaque fichier, générant les sorties spot et pistes correspondantes. Avant le traitement en lot, il est recommandé d’analyser 2 à 3 images représentatives afin de vérifier visuellement que les réglages par défaut du détecteur et du traceur sont adaptés à la taille et à la dynamique des comètes. Si les réglages sont adaptés, l’utilisateur peut ajuster les paramètres pertinents pour suivre avec précision les pointes EB1, minimisant ainsi les faux négatifs et les faux positifs.
   1. Ouvrez le fichier cible via les plugins → Bio-Formats → l’importateur Bio-Formats
   2. Ouvre le plugin TrackMate. Sélectionnez OUI si on vous demande d’échanger T et Z.
   3. Sélectionnez détecteur de journal. Régler le diamètre de la particule à 0,5 μm (ajuster si besoin)
   4. Fixez le seuil de qualité à 30 (ajustez si besoin). Activez à la fois la localisation sous-pixel et le pré-traitement avec un filtre médian.
   5. Supprimez tout filtrage ponctuel supplémentaire. Sélectionnez la méthode de suivi de Kalman
   6. Fixer un rayon de recherche initial à 0,5, un rayon de recherche de 0,7, et un écart maximal de trame à 2 (ajuster selon les besoins - Le rayon de recherche initial ensemence le suiveur, le rayon de recherche contrôle la distance qu’un point peut déplacer entre les images, et l’écart maximal permet de disparaître de courtes distances dans la trajectoire).
   7. Évitez le filtrage des pistes qui apparaîtra. Une fois la piste terminée, allez dans Spots → Export en CSV, et nommez le fichier : « filename »_ROI01_spots.csv
   8. REMARQUE : La nomination des fichiers doit refléter le nombre de ROI analysés. Si plusieurs ROI sont utilisés, sauvegardez chaque fichier de sortie avec un identifiant correspondant, tel que _ROI01, _ROI02, etc.
4. Visualisation des données et analyse quantitative - ÉTAPE 4
   Utilisez les scripts Python pour traiter les données de suivi et calculer des paramètres clés, notamment le nombre de comètes, la vitesse, la durée de vie, la cohérence angulaire et l’orientation. Ces scripts génèrent des tables résumées (fichiers CSV), des graphiques et des analyses statistiques pour soutenir l’analyse quantitative de la dynamique de la MT (Figure 4).
   1. Configuration de l’environnement logiciel :
      1. Installer la distribution Python (3.12). Assurez-vous que les bibliothèques Python externes suivantes sont installées (via pip install pandas numpy scipy matplotlib seaborn ipython statsmodels notebook) : Pandas et NumPy (pour la gestion des structures de données et le calcul numérique), SciPy et Statsmodels (spécifiquement scipy.stats, pour les statistiques circulaires et les tests d’hypothèses), Matplotlib et Seaborn (pour la génération de diagrammes de roses et de graphiques à barres statistiques), IPython (pour les outils d’affichage dans le carnet), Jupyter Notebook (pour l’utilisation du carnet).
      2. Placez les modules d’analyse personnalisés (File_5_MTModule1.py et File_6_MTModule2.py – Fichiers de codage supplémentaires 5 et 6) dans le répertoire racine à côté du carnet d’analyse (Fichier 4_Step4_MTs_results.ipynb – Fichier de codage supplémentaire 4).
      3. Ouvrez le carnet Jupyter en exécutant la commande « jupyter notebook » dans le terminal Python et chargez le fichier 4_Step4_MTs_results.ipynb – Fichier de codage supplémentaire 4.
   2. Données d’entrée et définition des paramètres :
      1. Remplissez la base de données pour associer les répliques biologiques à leurs métadonnées expérimentales.
      2. Fournir ce qui suit pour chaque expérience : Nom de base : La chaîne d’identifiants unique trouvée dans les noms de fichiers, Condition : Le groupe expérimental (par exemple, « Contrôle », « Traité »), Angle de correction : L’angle requis pour aligner le ROI avec l’axe biologique (par exemple, Antérieur = 0°).
      3. Ajustez les paramètres : exportez le format et le dpi de l’image, tracez les couleurs et la taille de la boîte par défaut pour les calculs angulaires
      4. Définir les paramètres de filtrage des données pour exclure les pistes courtes : Longueur minimale de piste : les pistes plus courtes que cette durée sont supprimées
   3. Exécution du pipeline d’analyse :
      1. Lisez et exécutez toutes les cellules de code pour traiter les données brutes de suivi. Le script parcourt la liste de la base de données pour effectuer les étapes procédurales suivantes :
         1. Identifiez tous les fichiers CSV spécifiques au ROI associés à chaque nom de base.
         2. Filtrez les pistes basées sur la longueur minimale (seules les trajectoires persistant plus de 3 images sont conservées), calculez les vitesses instantanées, calculez le déplacement total et appliquez la correction d’angle de référence à toutes les trajectoires.
         3. Normalisez le nombre de comètes par la zone de retour sur investissement (chargée à partir des métadonnées) pour calculer la densité de la comète.
      2. Agréger les données traitées dans un ensemble de données maître (df_all) et calculer des statistiques générales (vitesse moyenne, durée de piste et longueur du vecteur de cohérence angulaire) pour chaque ROI.
      3. Exécutez la fonction make_combined_rose_panel pour générer des parcelles de roses groupées. Cela crée une comparaison côte à côte des distributions angulaires pour tous les ROI dans chaque condition expérimentale. Exécutez create_comprehensive_analysis_plots_enhanced pour créer des graphiques à barres pour les métriques scalaires.
      4. Exécutez la fonction run_angle_analysis_pipeline pour effectuer une analyse d’orientation spécifique :
         1. Classez les pistes en bacs d’orientation en utilisant deux stratégies : le binning cardinal (4 bins de largeur 90° : Nord/Antérieur, Est/Droite, Sud/Postérieur, Ouest/Gauche) et Binning Antérieur/Postérieur (2 bins de 180° Antérieur vs. Postérieur).
         2. Calculez le pourcentage de traces se déplaçant dans chaque orientation définie par ovocyte.
   4. Analyse statistique et génération de résultats :
      1. Itérer à travers des métriques scalaires définies : nombre moyen de comètes par trame et par zone, durée moyenne de la trajectoire de comète, et vitesse moyenne de comète. Pour chaque métrique, elle effectue :
         1. Effectuer des tests de Kruskal-Wallis ou Mann-Whitney U pour des comparaisons indépendantes entre conditions expérimentales.
         2. Effectuez des tests de Friedman ou Wilcoxon pour évaluer la cohérence entre les ROI.
         3. Réalisez des tests Friedman et Wilcoxon Signed-Rank (en utilisant la méthode Pratt) pour évaluer les préférences d’orientation (par exemple, Nord vs. Sud) dans chaque ROI.
         4. Exportez les résultats suivants dans le répertoire Résultats : CSV résumés (metrics_table.csv, track_table.csv, roi_metrics.csv), Rapports statistiques (par exemple, Comète moyenne velocity_mwu.csv) et Graphiques (fichiers PNG haute résolution).
            REMARQUE : L’étape 4 ne peut être exécutée qu’en Python. Ouvrez le File_4_Step4_MTs_results.ipynb et lisez et exécutez toutes les cellules. Chaque cellule contient des instructions d’exécution ainsi que le résultat attendu respectif.

5. Analyse statistique :

REMARQUE : En raison de la distribution non gaussienne des données de suivi, des tests statistiques non paramétriques ont été utilisés pour toutes les comparaisons.

1. Évaluer les différences indépendantes entre les conditions expérimentales (par exemple, témoins vs. traitées) à l’aide du test U de Mann-Whitney (pour deux groupes) ou du test de Kruskal-Wallis, suivis de comparaisons Mann-Whitney par paires post-hoc (pour >2 groupes)).
2. Évaluer les préférences d’orientation au sein du même ROI en utilisant le test de Friedman (différence globale) suivi du test Wilcoxon Signed-Rank (par paires).
3. Gérer les liens à différence nulle en utilisant la méthode Pratt.
4. Rapportez les comparaisons par paires comme des valeurs p non corrigées afin de préserver la puissance statistique. Utilisez les scripts fournis pour rapporter à la fois les valeurs p brutes et ajustées, avec la signification fixée à 0,05. Déclarez toutes les statistiques résumées sous forme de Moyenne ± Erreur Standard de la Moyenne (SEM), sauf indication contraire).

Results

Ce protocole a été utilisé avec succès pour analyser la dynamique de croissance et la polarité de la MT dans les ovocytes de Drosophila melanogaster à des stades intermédiaires de l’oogenèse, en utilisant EB1-GFP, une protéine à suivi des extrémités qui marque les sites de polymérisation active de la MT^17,18. Lorsqu’elle est imagée par microscopie confocale à balayage laser, EB1-GFP apparaît sous forme de « comètes » brillantes et ponctuées qui se déplacent dans l’orientation de la croissance MT^17,18 (Figure 3A ; Vidéo complémentaire 1). Le suivi et la quantification de ces comètes permettent une évaluation précise de la nucléation, de l’allongement et de l’organisation du MT au sein de l’ovocyte. Grâce à ce protocole de workflow, la dynamique de la MT a été évaluée dans les ovocytes témoins et dans les ovocytes soumis à une perturbation expérimentale du réseau MT. Plus précisément, le comportement de la comète EB1 a été comparé à travers trois conditions : ovocytes témoins non traités, ovocytes témoins traités à froid et ovocytes mutantsp-atronine traités à^{froid 12,26}. Le traitement à froid induit la dépolymérisation de la MT, permettant d’évaluer la repousse de la MT pendant la récupération. Des ovocytes hétérozygotes mutants de patronine (+/patr⁰⁵²⁵²) ont été inclus comme témoin positif pour une dynamique MT altérée. La patronine est un stabilisateur conservé de la MT moins²⁷, et un composant central des ncMTOC dans les ovocytes¹² et autres^{tissus 2}. Des travaux antérieurs ont démontré que les mutants de la patronine soumis à la dépolymérisation MT présentent une diminution significative du nombre de comètes EB1 après la recroissance¹². Ainsi, l’inclusion de mutants patronines hétérozygotes permettait de valider la méthode contre un fond connu de défectueux de la régénération MT. Les ovocytes des stades 7 à 8 ont été imagés lorsque les centrosomes sont atténués et que les MT sont générés via les voies acentrosomales.

Conformément aux observations précédentes, la plus grande densité de comètes EB1 a été détectée dans la région antérieure de l’ovocyte, avec une diminution progressive vers les ^14,15 postérieurs (Figure 5B ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). Pour distinguer entre les véritables événements de polymérisation MT et les signaux stationnaires ou hors plan, ce protocole distingue le nombre total de foyers EB1-GFP détectés et le sous-ensemble des foyers mobiles. La fraction immobile représente probablement des comètes stationnaires ou des comètes se déplaçant principalement dans le plan axial (Figure 5A,B). Des analyses de la longueur de la trajectoire MT et de la vitesse de croissance ont été réalisées exclusivement sur les comètes mobiles EB1-GFP afin d’éviter l’inclusion de signaux stationnaires ou de mouvements axiaux pouvant interférer avec l’estimation de la longueur et de la vitesse de la piste. Les foyers totaux EB1-GFP et la fraction mobile sont présentés dans des graphiques séparés afin de permettre une comparaison directe entre la détection globale et le comportement dynamique (Figure 5A,B). Dans les ovocytes témoins, le protocole mesurait 0,189 ± 0,02 SEM de comètes mobiles EB1/^{μm 2} (18,9 comètes EB1/100^{μm 2}) dans la région antérieure, suivi respectivement de 0,064 ± 0,02 SEM et 0,043 ± 0,01 SEM EB1 comètes mobiles/μm² dans les régions centrale et postérieure (6,4 et 4,3 comètes EB1/100^{μm 2}) (Figure 5B ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). Une étude^{précédente 28} mesurant des comètes EB1 au même stade de développement a détecté 48,54 comètes EB1/100μm², ce qui est supérieur aux valeurs observées ici pour les comètes EB1-GFP mobiles. Cependant, les valeurs mesurées sont cohérentes en tenant compte du nombre total de comètes EB1-GFP détectées (Figure 5A ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). La section Matériaux et Méthodes de cette étude ne précise pas combien de z-stacks ont été utilisés pour imager les ovocytes. Il est donc possible que plus d’une pile z ait été incluse dans l’analyse, ce qui aurait pu contribuer au nombre plus élevé de comètes EB1-GFP détectées. Un autre facteur pouvant influencer les valeurs rapportées est la région de l’ovocyte sélectionnée pour la quantification de la comète. Si les régions d’intérêt avaient été choisies plus proches du pôle le plus antérieur, où la densité de comètes EB1 est la plus élevée, cela aurait pu augmenter la densité moyenne de comètes par rapport aux mesures présentées ici. Néanmoins, les résultats obtenus ici sont du même ordre de grandeur et reflètent constamment une diminution de la densité de comètes EB1 vers la région postérieure, comme précédemment^{rapporté 14,15}.

Après la repousse de la MT induite par le froid, les ovocytes témoins ont montré des nombres de comètes EB1 comparables à ceux des témoins non traités, indiquant une récupération robuste de la MT. En revanche, conformément aux rapports^{précédents 12}, les mutants patronines ont montré une réduction significative du nombre de comètes EB1 mobiles dans la région antérieure (ROI1) par rapport aux deux témoins (Figure 5B ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). Bien que le nombre de comètes dans les régions moyenne et postérieure (ROI 2 et 3) ait également tendance à baisser, ces différences n’étaient pas statistiquement significatives (Figure 5B). La réduction observée ici était moins marquée que celle rapportée dans les tests à base de^{nocodazole 12}. Cela reflète probablement l’utilisation de mutants patronines hétérozygotes dans lesquels un seul allèle est muté. De plus, le protocole de dépolymérisation induite par le froid peut ne pas dépolymériser complètement toutes les MT, et l’intervalle de 5 à 15 minutes entre le retrait de la glace et l’imagerie permet probablement une certaine nucléation et repousse des MT avant l’acquisition des données. En revanche, les tests à base de nocodazole sont réalisés immédiatement après l’inactivation du colcémide à l’aide d’un laser^{UV 12} au microscope. Néanmoins, ces résultats démontrent que ce protocole peut détecter des altérations biologiquement pertinentes et spécifiques à une région dans l’organisation de la MT. Ils s’alignent également avec l’enrichissement des ncMTOCs et de la Patronine, un composant central du ncMTOC, à l’avant de l’ovocyte. La réduction plus faible du nombre de comètes dans les régions moyenne et postérieure pourrait également refléter l’exclusion développementale des ncMTOC et de la Patronine du cortex postérieur à ces^{stades 12}.

L’analyse de la longueur de la piste EB1 dans les ovocytes témoins a révélé des trajectoires de comètes plus longues dans la région antérieure de l’ovocyte (0,613 μm ± 0,04 MEB) et des comètes plus courtes dans les régions centrale et postérieure (0,463 μm ± 0,04 MEB et 0,488 μm ± 0,05 MEB, respectivement) (Figure 5C ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). Cette constatation est cohérente avec les données antérieures montrant que les MT persistent moins longtemps au pôle postérieur qu’au pôle antérieur, ce qui suggère que les MT au pôle postérieur sont plus^{courts, 14}. Dans les ovocytes mutants patronines hétérozygotes traités à froid, la longueur de la comète EB1 a été significativement réduite par rapport aux témoins traités à froid dans les régions antérieure et postérieure. Une tendance similaire non statistiquement significative a été observée dans la région centrale (Figure 5C ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2), suggérant une réduction partielle de la stabilité du MT. Pris ensemble, ces résultats confirment le rôle connu de la Patronine comme stabilisateur de la MT à extrémité moins et sont cohérents avec les observations antérieures dans des cellules cultivées par Drosophila, où la perte de Patronine entraîne des fuseaux MT plus courts^12,27. Ces résultats soulignent également la sensibilité de ce protocole à détecter des perturbations subtiles mais biologiquement significatives dans la dynamique de la MT.

En mesurant la vitesse de la comète EB1 dans les ovocytes témoins, l’analyse a détecté des vitesses moyennes de 0,208 ± 0,01 μm/s, 0,207 ± 0,01 μm/s, et 0,202 ± 0,01 μm/s respectivement dans les régions antérieure, moyenne et postérieure (Figure 5D ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2), ce qui est cohérent avec les travaux^{précédents 14,15}. Les ovocytes témoins ont montré une légère diminution de la vitesse de croissance du MT de la région antérieure à la région postérieure. Cela pourrait refléter l’enrichissement des ncMTOC, ainsi que d’autres protéines potentiellement associées aux microtubules (MAPs) non identifiées, dans les régions antérolatérales, ce qui facilite la croissance et l’extension des MT, contribuant ainsi à la diminution postérieure observée. Chez les ovocytes traités à froid, les mutants hétérozygotes patronine ont montré une tendance non statistiquement significative à une légère réduction de la vitesse de croissance du MT par rapport aux témoins, bien que cette différence n’ait pas atteint de signification statistique (Figure 5D ; Tableau 1 ; Tableaux supplémentaires 1 et 2). Cette découverte est cohérente avec des observations antérieures chez des cellules souches neurales de Drosophila exprimant des mutants de^{patronine 29}.

La localisation des NCMTOC dans la région antéro-latérale de l’ovocyte, ainsi que leur exclusion de la postérieure, conduit à ce que la plupart des MT soient développées avec leurs extrémités négatives ancrées au cortex antéro-latéral. Par conséquent, un gradient antéro-postérieur des MT est établi à l’intérieur de l’ovocyte, avec un biais d’orientation modéré : 60 % des MT poussent vers le postérieur et 40 % vers le¹⁴ antérieur. Notre protocole a détecté avec succès ce biais dans les ovocytes témoins dans toutes les régions de l’ovocyte (Figure 5E). Le biais dans l’orientation de la MT était plus prononcé à la région postérieure, comme rapporté^{précédemment 14}. Notamment, cet enrichissement postérieur du biais d’orientation a disparu après un traitement à froid chez les ovocytes témoins et hétérozygotes mutants patronine (Figure 5E,F). Dans les ovocytes témoins traités à froid, l’orientation de la MT s’est orientée vers une croissance antérieure dans toutes les régions. Ce décalage est apparu comme une tendance dans les régions antérieure et médiane et est devenu statistiquement significatif dans la région postérieure (Figure 5F). Une explication possible à cette perte de biais vers le côté postérieur est que, dans des conditions traitées à froid, les MT nouvellement polymérisées peuvent avoir besoin de temps pour s’associer aux MAP, telles que les protéines motrices, qui favorisent la stabilisation et/ou la réticulation des MT. Un retard dans le recrutement de ces facteurs pourrait nuire au renforcement des MT orientés vers l’arrière. En résumé, ce protocole permet une analyse sensible et quantitative de la croissance, de la longueur, de la vitesse et de l’orientation des MT au sein des ovocytes. Il détecte de manière fiable des changements spécifiques à la région et biologiquement significatifs dans la dynamique de la MT, conformément aux études précédentes, et démontre une sensibilité à résoudre des différences subtiles dans le comportement de la MT, comme l’illustrent les observations faites chez des mutants hétérozygotes de lap-atronine.

Figure 1 : Oogenèse de Drosophila melanogaster (A) Aperçu de l’oogenèse dans l’ovaire de Drosophila. Chaque ovaire contient 12 à 16 ovaires, qui fonctionnent comme une chaîne de production d’ovules. L’oogenèse commence dans le germarium, où 2 à 3 cellules souches germinales se divisent de façon asymétrique, produisant une cellule souche et une cellule fille qui commence à se différencier. Ces cellules subissent 4 divisions mitotiques pour former un kyste de 16 cellules relié par des canaux annulaires. À partir de ces cellules, l’une devient l’ovocyte, tandis que les autres servent de cellules nourrices, soutenant la croissance et le développement des ovocytes jusqu’à un ovocyte de stade 14 à l’extrémité postérieure. (B) Schéma de la chambre d’œufs de Drosophila de stade 9. Les MT sont générés à partir de NCMTOCs localisés au cortex antéro-latéral, qui sont exclus du côté postérieur de^{l’ovocyte 12}. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Diagramme de flux de travail du protocole. Aperçu des principales étapes allant de la dissection des ovaires et l’imagerie en conditions réelles au suivi de comètes et à l’analyse quantitative. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Images représentatives générées par le traitement des ovocytes des stades 7–8. (A-E) Images représentatives illustrant le flux de traitement d’image à l’étape 1 appliquées aux ovocytes de stade 7 à 8 issus d’ovocytes témoins, témoin traités à froid et hétérozygotes patronine⁰⁵²⁵² traités à froid. Les chaînes sont une image représentative d’une projection maximale de 2 images d’un film en accéléré de 150 images acquis à 0,5 s par image. (A) Canal 1, qui correspond à la génération d’une image dénudée à partir de l’ovocyte imageri correspondant. (B) Canal 2, qui correspond à la génération d’une différence d’image gaussienne. (C) Canal 3, qui correspond à la génération d’une image où le signal des comètes EB1-GFP a été amélioré pour montrer les extrémités des comètes. (D) Fusion des canaux 2 et 3, qui aide à visualiser les extrémités des comètes résultantes issues du traitement du canal 2. (E) Trajectoires de comètes EB1-GFP générées à partir du time-lapse C dans FIJI en utilisant le plugin Temporal Color Code pour illustrer la dynamique de la MT. Le code couleur indique la projection temporelle de 20 images (0,50 s entre les images). Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : capture d’écran d’une section dans STEP 4 Jupyter Notebook. Le carnet est structuré avec des cellules Markdown qui fournissent des instructions explicites, suivies de cellules de code qui produisent des résultats et des journaux en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Analyse de la dynamique des comètes EB1-GFP dans les ovocytes de contrôle et traités à froid des stades 7-8. Les données représentent la moyenne ± SEM par ROI (ROI1–ROI3) pour les ovocytes traités à froid et à la^{patronine 05252} traités à froid. Des mesures de comètes EB1-GFP ont été obtenues à partir d’images en accéléré traitées à FIJI ; sauf indication contraire, des analyses étaient réalisées sur des images traitées sur la chaîne 3. Le nombre total de comètes EB1-GFP a été analysé à partir d’images du canal 2 (image DoG). La signification statistique a été évaluée à l’aide du test de Kruskal–Wallis suivi de comparaisons post-hoc de Mann–Whitney, ou du test de Friedman suivi des tests de paires appariées de Wilcoxon, selon le cas (p < 0,05 ; p < 0,001 ; p < 0,0001). (A) Diagramme de points de diffusion montrant le nombre moyen de comètes EB1-GFP totales. (B) Diagramme de points de dispersion montrant le nombre moyen de comètes EB1-GFP mobiles. (C) Diagramme de points de dispersion montrant la longueur moyenne de la trajectoire EB1-GFP. (D) Diagramme de points de dispersion montrant la vitesse moyenne de la comète EB1-GFP. (E) Graphiques de Rose montrant l’orientation des pistes EB1-GFP dans ROI1–ROI3 dans le contrôle (n = 14), le contrôle traité à froid (n = 12) et le^{patronine 05252} traité à froid (n = 11). Le pourcentage moyen de chaque trace par ovocyte, orienté vers l’antérieur (A) ou le postérieur (P), est indiqué pour chaque condition et ROI. (F) Graphique à barres montrant le pourcentage moyen des angles de suivi de comètes EB1-GFP orientés vers les côtés antérieur et postérieur de l’ovocyte. Les pourcentages ont été calculés par ovocyte et représentent la distribution relative de l’orientation des comètes au sein de chaque ROI. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Métrique	ROI	Contrôle (n=14)	Contrôle du traitement à froid (n=12)	Patronine05252 traité à froid (n=11)
Nombre total de comètes EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (antérieure)	0,667 ± 0,18	0,691 ± 0,20	0,570 ± 0,17
	ROI 2 (milieu)	0,394 ± 0,11	0,532 ± 0,15	0,400 ± 0,12
	ROI 3 (postérieur)	0,353 ± 0,09	0,561 ± 0,16	0,378 ± 0,11
Numéro de comète EB1-GFP (#/μm2)	ROI 1 (antérieure)	0,189 ± 0,02	0,175 ± 0,03	0,099 ± 0,03
	ROI 2 (milieu)	0,064 ± 0,02	0,091 ± 0,02	0,056 ± 0,02
	ROI 3 (postérieur)	0,043 ± 0,01	0,104 ± 0,03	0,047 ± 0,02
Longueur de piste de la comète EB1-GFP (μm)	ROI 1 (antérieure)	0,613 ± 0,04	0,621 ± 0,03	0,478 ± 0,07
	ROI 2 (milieu)	0,463 ± 0,04	0,535 ± 0,03	0,410 ± 0,05
	ROI 3 (postérieur)	0,488± 0,05	0,543 ± 0,04	0,393 ± 0,05
Vitesse de la comète EB1-GFP (μm/sec)	ROI 1 (antérieure)	0,208 ± 0,01	0,198 ± 0,01	0,188 ± 0,01
	ROI 2 (milieu)	0,207 ± 0,01	0,199 ± 0,01	0,186 ± 0,01
	ROI 3 (postérieur)	0,202 ± 0,01	0,194 ± 0,01	0,177 ± 0,01

Tableau 1. Résumé des mesures de comètes EB1-GFP dans les régions antérieur-postérieure dans les ovocytes analysés. Les mesures ont été obtenues à partir d’ovocytes témoins, témoins traités à froid et hétérozygotes patronine⁰⁵²⁵² traités à froid. Les régions d’intérêt étaient définies comme ROI1 (antérieure), ROI2 (centrale) et ROI3 (postérieure).

Tableau supplémentaire 1. Analyse statistique des mesures de comètes EB1-GFP entre conditions expérimentales. Les valeurs p indiquent des différences entre les ovocytes témoins, témoins traités à froid et hétérozygotes patronine⁰⁵²⁵² traités à froid pour chaque ROI (ROI1-ROI3). Des comparaisons globales entre les trois conditions ont été réalisées à l’aide du test de Kruskal–Wallis, suivies de comparaisons post-hoc par paires de Mann–Whitney.  Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Tableau supplémentaire 2. Comparaison statistique des mesures de comètes EB1-GFP entre les ROI au sein de chaque condition expérimentale. Les valeurs p indiquent des différences entre ROI1 (antérieure), ROI2 (centrale) et ROI3 (postérieur) au sein des ovocytes témoins, traités à froid et hétérozygotes patronine⁰⁵²⁵² traités à froid. Les différences globales entre les ROI au sein de chaque condition ont été évaluées à l’aide du test de Friedman. Des comparaisons par paires entre les ROI ont ensuite été réalisées à l’aide de tests de rang signé par paires de Wilcoxon. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Vidéo complémentaire 1. Imagerie en accéléré de la protéine EB1-GFP à suivi en accéléré dans un ovocyte de stade témoin 7–8, démontrant une acquisition représentative adaptée à une analyse ultérieure du suivi MT (relié à la Figure 3). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 1 : File_1_Step1_MTs_macro.ijm. Une macro Fiji/ImageJ pour le prétraitement d’image. Il automatise la correction par photoblanchiment, le filtrage de Kalman et la soustraction de fond à l’aide d’un filtre à différence de Gaussiens (DoG). Il applique également un dégradé temporel (retranche et convolution 1D) pour affiner les bords d’attaque des pointes MT afin d’améliorer la fidélité du suivi. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 2 : File_2_Step2_MTs_macro.ijm. Une macro Fiji/ImageJ pour la définition semi-automatisée de la région d’intérêt (ROI). Il invite l’utilisateur à définir la limite des ovocytes et segmente automatiquement la sélection en zones équidistantes (dans notre exemple 3 zones : antérieure, centrale et postérieure) afin de permettre la stratification régionale de l’analyse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 3 : File_3_Step3_MTs_macro_tracking.py. Un script Python (exécuté au sein de Fiji/ImageJ) qui effectue le suivi automatisé des comètes EB1 à l’aide de Trackmate. Il traite en lots des images pré-traitées, détecte les comètes en utilisant des paramètres de qualité définis, les relie dans des trajectoires et exporte les données brutes de coordonnées sous forme de fichiers CSV. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 4 : File_4_Step4_MTs_results.ipynb. Un Jupyter Notebook qui sert d’interface principale pour l’analyse quantitative. Il charge les données brutes de suivi, exécute la chaîne d’analyse et génère toutes les sorties finales, y compris les diagrammes de rose, les tableaux résumés statistiques et les graphiques comparatifs pour la densité, la vitesse et la durée de vie des comètes. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 5 : File_5_MTModule1.py. Un module Python personnalisé contenant des fonctions utilitaires fondamentales utilisées pour l’extraction de données et les calculs géométriques de base. Il inclut des fonctions pour trouver des fichiers ROI, calculer des vitesses instantanées et calculer les déplacements angulaires de base. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 6 : File_6_MTModule2.py. Un module Python personnalisé contenant des fonctions avancées d’analyse et de visualisation. Il abrite les algorithmes pour la chaîne d’analyse d’orientation (binning cardinal vs. axial), les tests statistiques robustes (méthode Friedman/Wilcoxon avec Pratt) et la génération de graphiques polaires (roses) de qualité publication. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Fichier de codage supplémentaire 7 : File_7_KalmanStackFilterCompiled.jar. Un plugin Java Kalman Filter compilé pour Fiji/ImageJ est nécessaire pour les étapes de réduction du bruit dans la macro de prétraitement. Cette version autonome élimine le besoin d’un kit de développement Java (JDK) séparé, simplifiant ainsi la configuration logicielle de l’utilisateur. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier

Discussion

L’imagerie en temps réel de la dynamique de la MT dans les ovocytes présente des défis uniques, car des ensembles de données de haute qualité et des analyses quantitatives sont nécessaires pour extraire des informations significatives. Bien que des études antérieures aient rapporté des approches d’imagerie en^{direct 14, 15, 16}, les étapes d’analyse d’image sont souvent très personnalisées, et les protocoles ne fournissent pas suffisamment de détails pour assurer la reproductibilité. Par conséquent, les chercheurs sans expertise approfondie en imagerie ou en informatique peuvent se heurter à des obstacles pour reproduire ces analyses. Pour relever ces défis, un flux de travail simplifié a été développé, combinant l’imagerie en direct haute résolution Airyscan avec des macros et scripts automatisés et conviviaux. Ce pipeline permet une détection et un suivi efficaces des comètes EB1, suivies d’une analyse quantitative de l’orientation, de la vitesse et de l’organisation spatiale de la MT. En minimisant l’intervention manuelle et en fournissant des instructions claires étape par étape, le flux de travail favorise l’accessibilité et la reproductibilité de l’analyse dynamique de la MT dans les ovocytes.

La dissection des ovaires et la préparation de l’échantillon sont des premières étapes cruciales. Les ovocytes doivent être soigneusement disséqués pour éviter des dommages mécaniques, et la durée de l’imagerie doit être limitée à 90 minutes pour maintenir la^{viabilité 20}. La sélection du stade est importante : après la moyenne de l’oogenèse, l’ovocyte prend de la taille et accumule du jaune dans le cytoplasme, ce qui rend la visualisation du signal EB1 de plus en plus difficile au-delà du stade 9. Par conséquent, l’imagerie au-delà du stade 9 n’est pas^{recommandée.} De plus, pour les quantifications reproductibles, lorsque cela est possible, des ovocytes de taille comparable sont préférables, car cela garantit que les régions définies d’intérêt correspondent à des positions antérieures-postérieures équivalentes entre les échantillons.

Le contrôle de la température est essentiel pour la reproductibilité. Les stocks de mouches doivent être maintenus à des conditions de culture standard (25 °C) pour soutenir un développement normal et une expression constante de l’EB1-GFP, en particulier lors de l’utilisation du système GAL4/UAS, qui est sensible aux fluctuations de température. La stabilité de la température lors de l’imagerie est tout aussi importante, car les variations peuvent affecter la dynamique du MT. Bien qu’une chambre à température contrôlée ne soit pas nécessaire, il est recommandé d’éviter les fluctuations de température lors de l’acquisition.

Pour l’acquisition d’image, l’imagerie confocale par détecteur à réseau a été choisie pour sa haute sensibilité et son SNR amélioré, minimisant ainsi le besoin de débruit post-acquisition. Des objectifs numériques d’ouverture élevés (aussi élevés que possible) combinés à une correspondance appropriée de l’indice de réfraction doivent être utilisés pour maximiser la résolution latérale et axiale, ce qui est crucial pour résoudre des comètes individuelles dans des réseaux denses. De plus, les critères d’échantillonnage^{Nyquist-Shannon 30} doivent être respectés en XYZ et en temps afin d’éviter une perte de précision dans le suivi de la comète. Tout aussi important est la sélection soigneuse du plan d’imagerie le long de l’axe z. Une imagerie trop profonde entraîne une perte de fluorescence due à la diffusion de la lumière, tandis que restreindre l’acquisition à la surface corticale ne permet pas de capturer la dynamique complète des comètes EB1. Les données les plus informatives sont obtenues à une position z intermédiaire. Les ovocytes dans lesquels le noyau se trouve dans le plan sélectionné doivent être évités, car le compartiment nucléaire déplace une grande partie du cytoplasme et ne possède pas de pistes EB1, réduisant ainsi le nombre de comètes détectables.

Bien qu’optimisé pour l’imagerie confocale basée sur détecteur à matrice, ce pipeline d’analyse est indépendant du matériel et compatible avec d’autres modalités, telles que la microscopie confocale à disque rotant. Cependant, les utilisateurs doivent être conscients que les systèmes avec un NA ou un SNR plus bas peuvent nécessiter des ajustements des paramètres de prétraitement du macro (par exemple, tolérance au bruit/sigmas DoG) et peuvent entraîner une réduction de la densité de détection de comètes par rapport aux valeurs présentées dans cette étude. Néanmoins, bien que les valeurs absolues puissent varier selon les systèmes, les tendances relatives observées entre les conditions expérimentales et les ROI devraient rester robustes.

Compte tenu de la grande structure 3D de l’ovocyte, l’imagerie 2D ne capture qu’une section optique du réseau MT. Par conséquent, les comètes se déplaçant fortement le long de l’axe z peuvent sortir du plan focal, ce qui peut entraîner une sous-estimation des durées de vie de la trajectoire et de la vitesse absolue (puisque seule la composante xy du vecteur vitesse est mesurée). Cependant, l’imagerie volumique 3D à haute vitesse de l’ensemble de l’ovocyte nécessiterait des champs de vision (FOV) plus petits, des temps d’exposition plus courts et des temps de réponse du détecteur plus rapides, réduisant ainsi la SNR et répartissant le temps d’acquisition sur plusieurs tranches z, ce qui compromet la résolution temporelle nécessaire pour suivre rapidement les comètes EB1. Pour atténuer les comètes immobiles et les artefacts flous, des filtres convolutifs et de durée minimale de piste ont été appliqués (à l’exclusion des pistes < 3 images) afin d’éliminer les taches transitoires traversant le plan focal. De plus, comme cette limitation géométrique s’applique uniformément dans les conditions expérimentales, les différences relatives observées en densité, vitesse et orientation des comètes restent robustes. Bien que les techniques émergentes comme la microscopie de champ lumineux devraient idéalement capturer simultanément la structure 3D complète, elles ne sont pas encore largement disponibles. Néanmoins, les valeurs mesurées pour tous les paramètres de la dynamique de la MT sont cohérentes avec les rapports précédents, indiquant que ce protocole convient à l’étude de la dynamique de la MT à travers différents ensembles expérimentaux.

Avant d’utiliser les macros de ce protocole, il est recommandé de traiter manuellement les premières images afin de s’assurer que les paramètres logiciels sont correctement optimisés. Des facteurs tels que la résolution d’image, le grossissement, le rapport signal/bruit, la fréquence d’images et le fait que les données soient à un seul plan ou à la pile z peuvent tous influencer la précision du suivi. Ajustant itérattivement les paramètres tout en inspectant visuellement les pistes résultantes pour minimiser les faux positifs et faux négatifs. Une fois optimisé, appliquez les paramètres de manière cohérente à travers les ensembles de données pour garantir la reproductibilité.

Enfin, certaines limites concernant l’interprétation biologique doivent être notées. EB1-GFP étiquete sélectivement la croissance de la MT plus les extrémités et rapporte donc les sites de polymérisation active de la MT plutôt que l’ensemble de la population de MT. Les MT stables, non polymérisantes, présents pendant la période d’imagerie ne sont pas détectés par cette méthode. Bien que cette limitation soit moins restrictive dans les ovocytes en milieu de l’oogenèse, où la majorité des MT sont très dynamiques, elle doit être prise en compte lors de l’application du protocole à d’autres types cellulaires présentant des populations de MT stables substantielles, comme les^{neurones 31}.

En conclusion, ce flux de travail permet une analyse quantitative à haute résolution de la dynamique de la MT chez les ovocytes de Drosophila . En intégrant la dissection optimisée, l’imagerie confocale confocale par détecteur en réseau et des outils d’analyse automatisée, elle offre une méthode rigoureuse mais accessible pour étudier les régulateurs MT dans un contexte acentrosomal. Bien que principalement validé dans les ovocytes, les principes de cette approche sont adaptables, une fois optimisés, à d’autres types cellulaires, y compris les cellules non divisantes telles que les neurones et les épithélius, offrant une plateforme évolutive pour des criblages génétiques et des études mécanistes de l’organisation de la MT.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-20
EB1::GFP	De Dr. Antoine Guichet, CNRS, Institut Jacques Monod, France		Génotype: w; +/CyO; UASp-EB1::GFP/TM3
Petri en verre	MatTek	P35G-1.0-14-C
Matα4-Gal4-VP16	Bloomington Drosophila Stock Center	7062	Génotype: w[*]; P{w[+mC]=matalpha4-GAL-VP16}V2H
Huile 10S, VOLTALEF	VWR Chemicals	24627.188
Mutant Patronin	Bloomington Drosophila Stock Center	16647	Génotype: y[1] w[67c23]; P{y[+mDint2] w[+mC]=EPgy2}Patronin[EY05252]/CyO
w1118	Bloomington Drosophila Stock Center	3605
Zeiss LSM 980 avec Airyscan 2	Zeiss