Expériences d’immunocoloration et de pénétration de colorants pour définir les protéines de jonction septate plissée du noyau dans les épithélios embryonnaires de Drosophila

Résumé

Ces protocoles décrivent comment caractériser l’organisation et la fonction d’occllusion des jonctions septates plissées dans l’épithélium embryonnaire de Drosophila et mutant.

Résumé

Le but de ces protocoles est d’évaluer l’organisation et la fonction barrière des jonctions septates plissées (pSJ) dans les tissus épithéliaux d’origine ectodermique des embryons de Drosophila. La pSJ forme une barrière occlludante sur la membrane latérale des tissus ectodermiques, y compris l’épiderme, les glandes salivaires, la trachée et l’intestin postérieur, fonctionnellement similaire à la jonction étroite des tissus vertébrés. Chez Drosophila, 30 protéines ont été identifiées nécessaires à la formation des pSJ. Les protéines pSJ centrales sont initialement localisées le long de la membrane latérale mais deviennent fortement enrichies à la région latérale apicale de la jonction, juste à la base de la jonction adhérente, au stade 16 de l’embryogenèse. À la fin du 15e stade de l’embryogenèse, ces tissus possèdent une jonction d’occllusion pleinement fonctionnelle. Cet article décritra les protocoles d’immunocoloration et de perméabilité aux colorants pouvant être utilisés pour examiner l’organisation et la fonction des pSJ chez les embryons témoins et mutants. L’utilisation réussie de ces protocoles peut être utilisée pour démontrer la fonction d’occllusion des pSJ, et pour tester si un gène inconnu code un composant central de la jonction.

Introduction

Une fonction essentielle des tissus épithéliaux est de compartimenter des régions distinctes au sein d’un organisme. La création de ces environnements distincts est essentielle au fonctionnement des organes et à la protection de l’organisme contre les menaces extérieures. La jonction d’occllusion formée entre les cellules d’un épithélium est responsable de l’établissement et du maintien de ces environnements en empêchant le flux paracellulaire de solutés entre les côtés apical et basal de cet^{épithélium 1,2}. Chez les organismes vertébrés, la jonction occludante est appelée jonction serrée, tandis qu’elle est appelée jonction septate (SJ) chez les invertébrés tels que Drosophila melanogaster ^1,3. Il existe deux types de SJ chez les arthropodes, distingués par leur distribution tissulaire et leur ultrastructure⁴. Les jonctions septates plissées (pSJ) se trouvent dans les tissus d’origine ectodermique tels que l’épiderme, les glandes salivaires, la trachée et l’intestin postérieur. Ils sont caractérisés de façon ultrastructurelle par un réseau en forme d’échelle de matière dense en électrons dans l’espace extracellulaire entre les cellules, situé juste à la base de la jonction^{adhésive 3,5}. En revanche, les jonctions septates lisses (sSJ) se trouvent dans les tissus dérivés de l’endoderme tels que les tubules de l’intestin moyen et de Malpighi, et ne présentent pas de septaes denses en électrons entre les cellules⁶.

Des études génétiques chez Drosophila ont identifié 30 protéines nécessaires à la structure et à la fonction de la pSJ, et ont identifié d’autres protéines qui résident dans la jonction mais ne semblent pas avoir de fonction dans leur établissement ou leur maintien (revue dans^{la section 7}). À partir de ces analyses, les scientifiques ont classé les protéines SJ en trois classes. Les protéines SJ du noyau résident dans la jonction et sont nécessaires à l’établissement et au maintien de celle-ci. Dix-sept protéines ont été identifiées comme des protéines Core pSJ, dont Coracle (Cora), Neurexin IV, Macroglobuline complémentaire (Mcr), Kune-kune et ATPase alpha 8,9,10,11,12. Neuf protéines ont été identifiées comme des protéines pSJ accessoires, nécessaires à l’établissement et/ou au maintien de la jonction, mais qui ne résident pas nécessairement dans la jonction. Cette classe inclut des protéines telles que Rab5, Rab11 et^{Coiled 13,14}. Enfin, les protéines résidentes du pSJ se localisent dans le pSJ mais sont dispensables pour l’établissement et le maintien de la jonction. Parmi les quatre membres de ce groupe, on trouve Discs Large et Fasciclin^{III 15,16}.

L’établissement d’une pSJ fonctionnellement intacte est un processus en plusieurs étapes qui commence à mi-chemin de l’embryogenèse, lorsque toutes les protéines pSJ de base sont pleinement exprimées. Certains gènes pSJ de base sont exprimés par la mère, mais tous présentent une forte expression zygotique aux stades^12-17. Au stade 12, les protéines pSJ centrales se localisent tout le long de la membrane latérale. Durant les étapes 13 à 16, les protéines pSJ principales sont endocytosées puis recyclées vers la membrane latérale dans la région du pSJ. Ce processus nécessite des protéines accessoires pSJ, notamment Rab5 et^Rab11-14. Au stade 16, les protéines pSJ principales sont étroitement localisées dans la région de la pSJ le long de la membrane latérale. Conformément à ces observations, la fonction d’occllusion complète de la jonction se situe à la fin du stade 15 de l’embryogenèse¹². Cela se démontre au mieux à l’aide d’un test de perméabilité aux colorants. Avant la formation de la jonction, une bille de dextrane de 10 kDa marquée par un marqueur fluorescent tel que la rhodamine peut traverser l’espace paracellulaire entre les cellules. Si le dextrane marqué est injecté dans l’hémocoel, il s’accumule rapidement dans la lumière des épithélios tubulaires tels que la trachée, la glande salivaire et l’intestin postérieur. Après que le pSJ est physiologiquement tendu à la fin du stade 15, le dextrane injecté est restreint au côté basal de l’épithélium et ne peut pas s’accumuler dans la lumière (domaine apical) de ces organes.

Les protéines pSJ de noyau partagent une caractéristique selon laquelle chaque protéine pSJ de noyau nécessite la présence de toutes les autres protéines pSJ de noyau pour une localisation subcellulaire^{correcte 18,19}. Cette interdépendance dans la formation des pSJ est une caractéristique déterminante des protéines pSJ de base et sous-tend les protocoles présentés dans cet article. Les mutations des gènes pSJ centraux ou accessoires entraînent une létalité embryonnaire et se caractérisent par la mauvaise localisation d’autres protéines pSJ centrales le long de la membrane latérale dans les embryons de stade 16, plutôt que d’être fortement localisées dans leur région apicale latérale normale. En revanche, les mutations des gènes résidents dans le pSJ ne conduisent pas à une mauvaise localisation des protéines pSJ^{principales 15}. La perturbation fonctionnelle du pSJ dans les mutations du gène pSJ au cœur et accessoires est révélée par l’accumulation de dextran marqué à 10 kDa dans la lumière de la trachée, des glandes salivaires ou des intestins postérieurs chez les embryons mutants de stade 16 ou 17. Enfin, la caractéristique distinctive entre une protéine pSJ centrale et accessoire est leur localisation subcellulaire. Les protéines pSJ de base sont étroitement associées au pSJ une fois formées, tandis que les protéines pSJ accessoires sont essentielles à l’assemblage de la jonction mais ne résident pas nécessairement dans cette jonction. Les meilleurs exemples de protéines pSJ accessoires sont Rab5 et Rab11. Les deux sont des protéines cytoplasmiques qui aident à transporter la cargaison de la membrane plasmique vers les premiers résultats, puis à recycler les endosomes puis à revenir à la membrane^{plasmique 14}. Pour distinguer si une nouvelle protéine potentielle de la pSJ est un composant central ou une protéine accessoire, il est généralement utile de créer un anticorps spécifique ou d’exprimer une protéine recombinante marquée fluorescentement afin de déterminer où ces protéines se localisent à différents moments du processus de maturation du pSJ.

Le but de ces protocoles est de distinguer sans ambiguïté les protéines pSJ potentielles de cœur et accessoires des protéines résidentes en pSJ. Plusieurs études ont révélé des rôles supplémentaires, non occultants, des protéines pSJ lors du développement, notamment des rôles dans la morphogenèse et la polarité^{apical-basale} 17,20,21,22^. À mesure que l’intérêt pour la biologie du pSJ augmente et que davantage de protéines potentielles du pSJ sont identifiées, les protocoles simples et facilement interprétables présentés ici aideront les chercheurs à caractériser correctement l’organisation du pSJ et les fonctions d’occultation de ces protéines. Dans la littérature, de nombreuses approches expérimentales supplémentaires pour caractériser les protéines pSJ ont été décrites, notamment le Récupération de Fluorescence Après Photoblanchiment (FRAP) et la microscopie électronique^{en transmission 6,23}. Bien que ces approches soient souvent très utiles, le test d’immunocoloration présenté ici permet une visualisation rapide de la localisation de la protéine pSJ sans méthodes ultrastructurales coûteuses et chronophages, tandis que le test de perméabilité au colorant offre une lecture fonctionnelle de l’intégrité du pSJ qui n’est pas possible par imagerie seule. De plus, ces tests peuvent être réalisés avec du matériel de laboratoire standard tel qu’un microscope à fluorescence de bonne qualité et un système de microinjection rudimentaire. Il convient de noter que ces tests sont optimisés pour l’analyse des embryons de stade 16 de Drosophila et ne sont pas appropriés pour évaluer l’organisation ou la fonction des SJ.

Protocole

1. Stadressage des embryons

1. Croisez des mouches mâles et femelles en bonne santé des génotypes appropriés (voir le tableau des matériaux pour des exemples) et placez-les dans des cages de collecte d’embryons avec des assiettes de jus de pomme fraîche enduites de pâte de levure. Laissez les mouches s’acclimater aux cages de collecte d’œufs pendant un jour ou deux avant de commencer les prélèvements embryonnaires.
2. Collectez les embryons sur des assiettes de jus de pomme et laissez-les se développer jusqu’au stade 16 (~13 h après la ponte (AEL) à 16 h AEL à 25 °C). Laissez les adultes pondre des œufs fécondés pendant 1 à 2 heures sur des assiettes de jus de pomme, retirez l’assiette de la cage de collecte des œufs, puis faites les vieillir à 13-16 AEL à 25 °C. Sinon, prélever les embryons toute la nuit à 25 °C puis sélectionner les embryons de stade 16 avant la fixation ou pendant l’imagerie après fixation et immunocoloration.
   REMARQUE : Le stadification embryonnaire peut être évaluée par la morphologie intestinale, qui est le plus facilement visualisée par l’autofluorescence dans le spectre UV (c’est-à-dire le canal DAPI). Au stade 16, l’intestin apparaît sous la forme de trois ovales longs parallèles perpendiculaires à l’axe long du corps (Figure 1H).

2. Fixation et immunocoloration des embryons

1. Assemblez un panier de collecte d’embryons avec un maillage en nylon (maille de 120 mm). Couvrez l’ouverture et le filetage du panier avec du maillage en nylon, puis vissez le bouchon.
2. Délogez doucement les embryons de l’assiette de jus de pomme avec un pinceau et une solution de lavage pour embryons. Versez le mélange d’embryons dans le panier de collecte et rincez les embryons à l’eau distillée.
   REMARQUE : Faites attention à faire descendre l’eau à l’intérieur du panier de collecte d’embryons et évitez de les éclabousser sur les côtés du panier, ce qui pourrait entraîner une perte d’embryon due à l’adhérence.
3. Déchorionez les embryons en immergeant le panier de collecte et les embryons dans un plateau contenant 50 % d’eau de Javel commerciale (concentration finale de 3,75 % d’hypochlorite de sodium). Faites tourner les embryons dans l’eau de Javel et laissez-les immerger pendant 3 à 5 minutes à température ambiante. Retirez le panier de l’eau de Javel et rincez les embryons à l’eau distillée, en dirigeant à nouveau le flux d’eau à l’intérieur du panier.
4. Préparez un flacon de fixation en ajoutant des volumes égaux de solution fraîche de paraformodéhyde à 4 % et d’heptane à un flacon de scintillation de 20 mL. Préparez une solution de paraformaldéhyde en dissolvant la quantité appropriée de paraformaldéhyde dans une solution de sérum chaud (~90 °C) tamponné phosphate (PBS) dans une hotte chimique. Pour accélérer le processus de dissolution, ajoutez 10 μL d’hydroxyde de sodium à 14 N (pour 10 mL de PBS) au fixant jusqu’à ce que le formaldéhyde soit en solution, puis ajoutez 10 μL d’acide chlorhydrique à 14 N pour revenir au neutre.
   ATTENTION : Portez toujours une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation du paraformaldéhyde et de l’heptane, et n’utilisez que sous une hotte chimique. Le paraformoldéhyde est un cancérogène et est corrosif, tandis que l’heptane est très inflammable et irritant la peau et les yeux.
5. Démontez le panier de collecte des embryons et immergez le maillage en nylon avec les embryons déchorionés dans l’heptane. Les embryons se détachent du nylon et se déposent à l’interface entre l’heptane (couche supérieure) et le fixe (couche inférieure). Fixez les embryons en secouant le flacon de fixation sur un vibreur de plateforme à 240 tours par minute (RPM) pendant 20 minutes.
6. Retirez le fixateur du flacon de fixation avec une pipette Pasteur dans une hotte chimique. Jetez le produit dans un contenant homologué pour déchets chimiques dangereux. Ajoutez un volume égal de méthanol, fermez la chambre de fixation et secouez vigoureusement la chambre pendant 5 à 10 secondes. Les embryons fixés se détachent de l’enveloppe vitelline et s’enfoncent au fond du méthanol (couche inférieure). Les enveloppes vitellines et tout embryon qui n’a pas réussi à se détacher de l’enveloppe vitelline resteront à l’interface et seront retirés à l’étape 2.7.
   ATTENTION : Portez toujours une blouse de laboratoire, des lunettes de protection et des gants lors de la manipulation du méthanol, car il est toxique et inflammable.
7. Retirez l’heptane avec une pipette Pasteur et jetez-la dans un contenant approuvé pour déchets chimiques dangereux. Ensuite, retirez la majeure partie du méthanol, laissant les embryons dans une petite réserve de méthanol, et jetez le méthanol dans des déchets chimiques dangereux. Ajoutez 5 mL de méthanol, faites tourner les embryons, et laissez-les se stabiliser. Retirez à nouveau la majeure partie du méthanol et répétez ce processus deux fois de plus.
8. Transférez les embryons dans le méthanol dans un tube de culture en verre de 0,8 mL. Retirez le méthanol et ajoutez 750 mL de solution en bloc (PBS plus 1 % de sérum d’âne normal et 0,1 % de Triton X-100). Lavez les embryons 3 fois dans du PBS, puis éclovez-les en solution en bloc pendant 30 minutes à température ambiante avec un mélange doux sur un bascule à plateforme.
9. Rincez les embryons une dernière fois avec PBS puis ajoutez le bloc plus anticorps primaires. Utilisez des anticorps contre une protéine pSJ centrale (par exemple, Coracle) et une protéine de jonction adhérente (par exemple, E. cadherine). Incubez les embryons dans un anticorps primaire toute la nuit à 4 °C ou pendant 3 à 4 heures à température ambiante, en mélangeant doucement sur un basculement plateforme.
10. Retirez le bloc avec des anticorps primaires et rincez les embryons trois fois dans le PBS. Ajoutez le bloc et lavez les embryons pendant 30 minutes à température ambiante sur un bascule à plateforme.
11. Rincez les embryons une dernière fois dans le PBS, puis ajoutez la solution bloqueante et les anticorps secondaires marqués par fluorescence spécifiques aux anticorps primaires utilisés à l’étape 2.9. Incubez les embryons à température ambiante pendant 3 à 4 heures ou toute la nuit à 4 °C.
12. Retirez le bloc avec des anticorps secondaires et rincez les embryons trois fois en PBS. Ajoutez le bloc et lavez les embryons pendant 30 minutes à température ambiante sur un bascule à plateforme.
13. Rincez à nouveau les embryons dans le PBS, puis transférez-les sur une lame de microscope à l’aide d’une pipette Pasteur. Évacuez l’excès de PBS avec de petites bandes de papier Whatman, en veillant à ne pas toucher aux embryons. Couvrir les embryons d’un substrat de montage (disponible dans le commerce ou fabriqué à 90 % de glycérol, 10 % de 1 M Tris, pH 8,0, avec 0,5 % de n-propyl gallate comme agent antidécolorant). Couvrir avec un verre de couverture de taille appropriée pour le numéro 1,5, puis sceller les bords avec du vernis à ongles.

3. Imagerie et analyse des données d’embryons immunocolorés

1. Pour de meilleurs résultats, imagez les embryons au microscope confocal avec un objectif d’immersion à l’huile de 40x. Utilisez des embryons témoins pour régler l’intensité et le gain du laser sur le confocal afin d’obtenir un signal fluorescent fort sans saturer les pixels. Identifier les embryons de choix de stade 16 (c’est-à-dire ceux qui n’expriment pas de GFP codée par équilibreur pour identifier les embryons mutants) en utilisant la morphologie de l’intestin moyen. Concentrez le scan sur la glande salivaire ou l’intestin postérieur, car ces organes sont polarisés et possèdent de longues membranes latérales idéales pour distinguer la jonction adhérente, la pSJ, et la surface latérale restante. Image en position en z qui inclura le plus grand diamètre possible de la lumière de la glande salivaire ou de l’intestin postérieur pour observer la membrane latérale complète de la cellule épithéliale.
   REMARQUE : L’exemple montré à la Figure 1C a été pris avec un microscope confocal avec une lentille d’immersion à l’huile HC PL APO 40x/1.3 CS2 avec une intensité laser de 1,59 et un gain de 3,3 pour le laser à 561 nm, une intensité laser de 2,0 et un gain de 21,7 pour le laser à 638 nm ( voir Tableau des matériaux).
2. Imagez un tissu polarisé dans au moins 20 embryons témoins et mutants de stade 16. Ne consignez que des données d’embryons où le marqueur de jonction de l’adhérence est fortement localisé dans la région latérale apicale de la membrane afin de garantir que l’embryon était fixé et coloré correctement. Ensuite, notez la distribution du marqueur pSJ le long de la membrane latérale. Chez les embryons de type sauvage de stade 16, on observe un enrichissement fort des protéines pSJ le long de ~10-15 % de la membrane latérale, juste à la base de la jonction de l’adhésion.
   REMARQUE : La mauvaise localisation même de 10 à 20 % de la protéine pSJ le long de la membrane latérale est diagnostique d’un défaut d’organisation du pSJ. Les défauts d’organisation pSJ sont fortement pénétrés dans tous les embryons mutants pSJ au cœur et accessoires, donc vous devez vous attendre à voir 75 à 100 % des embryons mutants présenter une protéine pSJ clairement mal localisée.

4. Préparation à l’injection de colorant

1. Préparez une solution de colorant fraîche en dissolvant du Dextran 10 kDa marqué à la rhodamine à 1 mg/mL dans 0,5 M de phosphate de sodium, pH 7,5 et 5 mM de chlorure de potassium.
2. Tirez un tube capillaire (1,0 mm de diamètre extérieur x 0,5 mm de diamètre intérieur avec fibre) dans une aiguille en verre à l’aide d’un extracteur d’aiguille.
   REMARQUE : Les extracteurs d’aiguilles sont particuliers et les réglages pour les aiguilles idéales varient souvent d’un jour à l’autre. Les bonnes aiguilles ont un affinage progressif vers une pointe acérée et doivent se situer entre les formes montrées à la Figure 2A. L’aiguille à gauche est plus longue et peut se plier en la poussant dans l’embryon. Cela peut être corrigé en recassant l’aiguille plus loin de la pointe. L’aiguille de droite est bonne mais aura un alésage plus grand lorsqu’elle est initialement cassée et peut pousser trop de liquide dans l’embryon. Si cela arrive, changez pour une nouvelle aiguille à pointe plus fine. Il est préférable de retirer plusieurs aiguilles en même temps lorsque les conditions du tireur créent des aiguilles de la bonne forme. Les aiguilles en excès peuvent être stockées dans un récipient fermé avec un morceau de mousse ou de ruban adhésif pour fixer les aiguilles indépendamment.
3. Chargez l’aiguille dans le porte-aiguille d’un micromanipulateur. Placez le micromanipulateur à côté d’un microscope inversé (Figure 2F). Orientez l’aiguille aussi près que possible de la lame du microscope parallèle et abaissez-la de façon à ce qu’elle soit dans le même plan z que le côté de la lames.
4. Cassez la pointe de l’aiguille en frappant le côté de la lame du microscope. Faites monter l’aiguille au-dessus du niveau de la culasse et retirez-la pour la charger.
5. Remplissez le tube capillaire avec un colorant à l’aide de la plus petite pointe de pipette disponible (pointe P2 ou P10) ou par action capillaire en plaçant l’extrémité arrière de l’aiguille dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL avec le colorant.
6. Rechargez l’aiguille remplie dans le porte-aiguille et testez le flux du dextran en injectant un bit dans une goutte d’huile d’halocarbure à la surface d’une lame de microscope.
   REMARQUE : Une aiguille bien cassée ne fuira pas sans ajouter de pression, et le débit peut être ajusté selon la pression appliquée au plongeur de la seringue.

5. Montage des embryons et injection de colorant

1. Sélectionnez les embryons de stade 16 ou 17 (témoins et mutants) en utilisant la morphologie de l’intestin moyen comme marqueur de stade.
2. Créez une ligne en creux sur une plaque de jus de pomme en utilisant un cache-couvercle de 22 x 22 # # 2 épaisseur. Alignez environ 25 embryons en phase sur l’assiette de jus de pomme, leurs extrémités postérieures touchant la ligne et la surface ventrale orientée vers le haut.
3. Appliquez un morceau de ruban adhésif double face sur une housse #2 de 22 x 22. Touchez le ruban à la ligne de l’embryon et frottez légèrement la gaine de couverture pour déplacer les embryons de la plaque vers le ruban double face sur la gaine (Figure 2B).
4. Fixez la gaine de couverture à une lame de microscope en ajoutant une goutte d’huile d’halocarbonate à la lame et en utilisant une action capillaire pour créer une liaison. Orientez la gaine de couverture plus près du côté du toboggan, en opposition à toute partie givrée. Sécher les embryons pendant 3 à 5 minutes dans un récipient de dessiccant ou en l’air sur un établi de laboratoire pendant 10 à 15 minutes (Figure 2C-E). Couvrez complètement les embryons d’huile d’halocarbone.
   REMARQUE : Les embryons seront légèrement moins turgides après la dessiccation mais ne seront pas fortement flasques. Les embryons représentés à la Figure 2E ont été laissés à sécher à l’air pendant 15 minutes dans une pièce avec une humidité relative de 42 % à 21,2 °C.
5. Montez la lame avec les embryons sur le microscope inversé, les embryons orientés vers le haut (loin de l’objectif). Alignez le micromanipulateur de façon à ce que l’aiguille soit orientée vers l’extrémité postérieure des embryons à un angle aussi proche que possible de la parallèle aux embryons (Figure 2G). Ajustez l’axe z du micromanipulateur de sorte que la pointe de l’aiguille soit alignée au milieu de l’embryon (le long de l’axe dorsal-ventral).
6. Injectez les embryons en déplaçant rapidement la phase vers l’aiguille afin que la pointe pénètre dans l’hémocoël de l’embryon. Injectez une petite quantité de colorant (~0,2-0,5 nL) à l’aide d’une seringue de 10, 25 ou 50 mL. Retirez rapidement l’aiguille, déplacez le stade vers l’embryon suivant, et répétez le processus. Injectez autant d’embryons que possible en 10 minutes.
   REMARQUE : Il est important que l’aiguille soit insérée à environ 25 % de l’entrée de l’embryon afin que le colorant ne soit pas injecté directement dans l’espace périvitelline, qui est continu avec la lumière de l’intestin antérieur et postérieur. Le colorant injecté doit sembler « gonfler » l’embryon, le rendant plus turgire. Une surinjection entraînera une bulle de colorant et d’hémolymphe sortant du site d’injection et doit être évitée.
7. Ajoutez de l’huile d’halocarbone supplémentaire et couvrez les embryons d’une couche de couverture 22 x 22 #2. L’huile supplémentaire d’halocarbone forme une couche plus uniforme entre les deux couches de recouvrement, empêchant les embryons d’être écrasés.

6. Imagerie et analyse des données

1. Réalisez des images soit avec un microscope composé fluorescent, soit avec un microscope confocal (10x ou 20x objectifs d’air suffisent pour obtenir des résultats sans ambiguïté). Sur la pile confocale en Z, l’imagerie à environ un quart de la profondeur (le long de l’axe ventral dorsal) de l’embryon révélera si le dextrane marqué est entré dans la lumière de la trachée et de l’intestin postérieur (des sections plus profondes ou un réorientation des embryons avec la surface ventrale en haut est nécessaire pour voir les glandes salivaires).
   REMARQUE : Les exemples présentés à la Figure 3 ont été pris au microscope confocal avec une lentille sèche HC PL APO 10x/0,4 CS2 avec une intensité laser de 2,0 et un gain de 13,6 pour le laser à 561 nm. Des tranches de 24 z ont été obtenues avec une taille de pas z de 2,4 nm (voir le tableau des matériaux).
2. Laissez l’embryon injecté vieillir pendant 10 minutes, puis examinez la lumière de la trachée, de la glande salivaire ou de l’intestin postérieur pour détecter l’accumulation du dextran marqué. Enregistrer le génotype et le stade de chaque embryon et vérifier s’il y a accumulation de dextran marqué dans un organe tubulaire. Notez les embryons dont l’espace périvitelline est également fortement coloré par un colorant, car ils peuvent représenter des embryons injectés par inadvertance dans cet espace.

Résultats

Les protocoles présentés ici sont utilisés pour étudier l’organisation et la fonction des PSJ dans les tissus ectodermiques chez les embryons de Drosophila de stade 16. Ces protocoles ne s’appliquent qu’aux pSJ et ne peuvent pas être utilisés pour interroger les sSJ. Une mutation d’un gène qui empêche de localiser d’autres protéines pSJ dans la région pSJ dans les embryons de stade 16 et de créer une jonction d’occllusion au stade 16 se trouve soit dans un gène pSJ central, soit dans un ...

Discussion

Nous présentons ici un protocole pour identifier les protéines pSJ de cœur et accessoires à l’aide de deux tests relativement simples, réalisables dans des laboratoires modestement dotés de capacités de microscopie à fluorescence. Le premier test examine l’organisation moléculaire du pSJ dans les épithélios polarisés matures à l’aide d’imagerie confocale d’embryons mutants fixés. Le second test teste l’intégrité de la fonction d’occultation du pSJ en injectant des molécules de dextran de...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube capillaire pour aiguilles (Boro 1 X 0,5/fibre)	FHC	30-30-1
Microscope confocal	Leica	Stellaris 5  ;
Couvrir le verre d’épaisseur 22 x 22 2 pour les injections	Fisher Scientific	12-540-B
Verre de couverture 22 x 30 épaisseur 1,5 pour l’imagerie	Corning	2980-233
Tube de culture pour immunocoloration (6 x 50 mm) & nbsp ;	Fisher Scientific	14-958-A
Cage de collecte d’embryons	Genesee Scientific	59-100
Stéréomicroscope à fluorescence	Leica	MZ10 F
Huile d’halocarbone (700)	Genesee Scientific	59-131
Heptane	Fisher Scientific	H350-4
Microscope à fluorescence inversée	Leica	DMi8
Paniers en maille pour les embryons en déchorionation	Genesee Scientific	46-101
Méthanol	Fisher Scientific	A412-4
Micromanipulateur	Narishige	MN151
Lames de microscope	Fisher Scientific	12-544-2
Extracteur d’aiguille	Instruments David Kopf	Modèle 720
Sérum d’âne normal	Jackson ImmunoRecherch	017-000-121
Nylon en maille (120 um)	Genesee Scientific	57-102
Objectif HC PL FLUOTR 10X/0.32 PH 1	Leica	11506537
Objectif HC PL APO 10x/0.40 CS2	Leica	15506407
Objectif HC PL APO 40x/1.30 CS2	Leica	15506358
Plaques de Petri 60 x 15 mm	Corning	351007
Oscillateur à plateforme	Globe Scientific	GTR-FS
Anticorps primaire (Coracle)	DSHB	C566.9
Anticorps primaire (Coracle)	DSHB	C615.16
Anticorps primaire (E. cadherine)	DSHB	DCAD2
Anticorps primaire (Mcr)	Laboratoire de service, CWRU	Polyclonal cochon d’Inde
Rhodamine marqué 10 kDa dextran	Sondes moléculaires	D1824
Anticorps secondaire (anti-cochon d’Inde Cy3)	Jackson ImmunoRecherch	706-165-148
Anticorps secondaire (anti-souris Cy2 de l’âne)	Jackson ImmunoRecherch	715-225-151
Anticorps secondaire (anti-rat Cy5 pour l’âne)	Jackson ImmunoRecherch	712-175-150
Vibrateur de table	École scientifique du Nouveau-Brunswick	Vibrateur de plateforme C2
Tegosept (méthyle 4-hydroxybenzoate)	TCI	H0216
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151500
Fioles pour fixation (fioles de scintillation liquide WHEATON de 20 ml)	Fisher Scientific	03-341-73C
Whatman 3MM  ; Article de chromatographie	Fisher Scientific	05-716-6H
Mouche avec des actions	génotype complet	nombre d’actions	Source
Cor4	w*; P{neoFRT}43D cora4/CyO	52232	BDSC
W1118	w[1118]	5905	BDSC
Solution	Recette
10x PBS	Mélangez 90 g de NaCl, 20 g de Na2HPO4 et 8,3 g de NaH2PO4.H2O et dH20 à 1L. Filtrez la stérilisation. Diluez à 1X avec du dH2O pour les étapes de lavage de l’immunocoloration.
Solution Triton X-100 à 10 %	Mélangez 1 ml de Triton X-100 à 9 ml de dH2O sur un bascule à plateforme jusqu’à ce que la dissolution soit dissipée. Conserver à température ambiante.
50 % d’eau de Javel	Mélangez 10 ml d’eau de Javel commerciale (hypochlorite de sodium à 7,5 %) à 10 ml d’eau avant de déchorioner les embryons.
Assiettes de jus de pomme	Faites bouillir 15 g d’agar Drosophila dans 725 ml dH2O. Ajoutez 25 g de sucre et 250 ml de jus de pomme, puis mélangez jusqu’au mixage. Laissez refroidir la solution à 55°C, puis ajoutez 1,3 g de tegosept et mélangez doucement. Versez dans des plaques de Petri de 60 x 15 et laissez refroidir. À conserver à 4°C.
Solution de blocage	Mélangez 9,8 ml de 1X PBS avec 100 uls de Triton X-100 à 10 % et 100 ul de sérum Normal Donkey dans un tube conique de 15 ans.
Solution de lavage d’embryons	Préparez 10 fois la solution de lavage d’embryons en mélangeant 70 g de NaCl et 2 ml de Triton X-100 à 1 L de dH2O. Diluez à 1X avec du dH2O pour la solution fonctionnelle.
Correction	Préchauffez 10 ml de 1X PBS au micro-ondes. Ajouter 0,4 g  ; de paraformoldéhyde et de pipette à mélanger. Ajoutez 10 uls de NaOH 14N pour la dissolution rapide. Placez sur un bloc chauffant à 90°C jusqu’à ce que ce soit dissous. Une fois qu’il ne reste plus de paraformaldéhyde solide, ajoutez 10 ul de 14N HCL pour ajuster le pH au neutre. Portez toujours une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes lorsque vous utilisez du paraformaldéhyde.
Supports de montage	Mélangez 9 ml de glycérol et 1 ml de base Tris 1M pH 8,0. Ajoutez 0,05 g de n-propyl-gallate,   ; Mélangez et chauffez pour dissoudre. Aliquot 0,5 ml dans des tubes d’Eppendorf.   ;
Solution de dextran de rholamine	Préparez une nouvelle solution de colorant en dissolvant du Dextran de 10 kDa marqué à la Rhodamine à 1 mg/ml dans 0,5M phosphate de sodium, pH 7,5 et 5 mM de chlorure de potassium.
Pâte de levure	Mélangez 50 g de levure commerciale (Red Star) avec une pincée de saccharose et assez d’eau pour obtenir une pâte épaisse. À conserver à 4°C.