Ce protocole présente la rupture de Rayleigh comme un processus léger d’aérosolisation de vecteurs d’ARNm non viraux. Le dépôt régional des vecteurs d’ARNm aérosolisés est évalué par le modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). L’expression de la protéine verte de fluorescence (GFP) dans les cellules pulmonaires humaines représente le maintien des fonctions physicochimiques et biologiques des vecteurs d’ARNm post-aérosolisés.
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Article de méthode
Délivrance intranasale de polyplexes d’ARNm via des aérosols de rupture de Rayleigh : une méthode in vitro pour le dépôt nasal et les tests fonctionnels
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’administration intranasale de traitements à ARNm est une stratégie prometteuse pour la vaccination et le traitement des maladies respiratoires, offrant une activation immunitaire directe au site d’entrée du pathogène. Cependant, les méthodes conventionnelles d’aérosolisation (par exemple, les ultrasons ou les nébuliseurs à haute pression) détériorent les vecteurs d’ARNm non viraux par des forces de cisaillement excessives, ce qui fait perdre aux ARNm leur intégrité structurelle et leurs activités biologiques. Un atomiseur nasal de rupture de Rayleigh a été utilisé pour aérosoliser doucement les vecteurs d’ARNm de polyéthyléneimine (PEI) en gouttelettes uniformes. L’ARNm codant la protéine fluorescente verte (GFP) a été formulé en polyplexes cationiques et caractérisé avant et après l’aérosolisation. Le processus de rupture de Rayleigh forme un micro-jet continu de gouttelettes avec un cisaillement minimal, préservant ainsi les propriétés physico-chimiques des nanoparticules. Une taille constante des particules, un faible indice de polydispersion et un potentiel zêta stable avant et après l’aérosolisation ont été observés, confirmant que les propriétés physico-chimiques des polyplexes d’ARNm étaient bien préservées grâce à la fragmentation de Rayleigh pour l’aérosolisation. En utilisant un modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) des voies respiratoires nasales, les aérosols PEI-ARNm ont été administrés. Les ARNm aérosolisés se sont principalement déposés dans les régions des cornets. Des fractions négligeables ont été trouvées dans le nasopharynx ou dans les sections équivalentes pulmonaires. De plus, les polyplexes d’ARNm post-aérosolisés ont été administrés avec succès aux cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 et ont produit une expression détectable de GFP. Ce protocole démontre une méthode de délivrance intranasale non destructive d’ARNm utilisant l’aérosolisation de rupture de Rayleigh. Il maintient efficacement les propriétés physicochimiques et les fonctions biologiques des vecteurs ARNm non viraux, atomisant la phase aqueuse en gouttelettes de taille appropriée pour un dépôt nasal ciblé. Ce protocole révèle une approche novatrice pour aérosoliser efficacement les ARNm et évaluer leur dépôt régional dans la cavité nasale.
Introduction
L’administration des vaccins dans la muqueuse nasale (le portail d’entrée de nombreux agents pathogènes respiratoires) peut provoquer une forte immunité locale et bloquer les infections à leur origine. Le succès des vaccins contre la grippe intranasale et l’approbation récente des vaccins intranasaux contre la COVID-19 soulignent l’efficacité de la voie nasale pour induire à la fois des réponses immunitaires muqueuses etsystémiques 1. L’administration intranasale des vaccins à ARNm suscite donc un grand intérêt en tant que stratégie pour prévenir les infections virales respiratoires. Un défi technique majeur es....
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Protocole
REMARQUE : Culture HEK293T et lignées cellulaires A549 dans un milieu complet composé du Médium Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 2 % de pénicilline-streptomycine avant la transfection d’ARNm PEI. Faites passer les deux lignées cellulaires environ toutes les 48 heures à la confluence. Cellules de graines à une densité de 40 000 cellules par cm² et cultivées pendant ~48 h. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) immédiatement avant la transfection pour éliminer le sérum résiduel et standardiser les conditions de transfection....
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Résultats
En tant que manuscrit axé sur les méthodes, les résultats détaillés ne sont pas l’objectif principal ; Cependant, des résultats représentatifs sont présentés pour illustrer les résultats attendus de chaque étape du protocole. Les figures mentionnées ci-dessous montrent des données d’exemple (par exemple, graphiques ou images) soutenant la validité de la méthode, mais aucune nouvelle analyse quantitative n’est incluse, au-delà de la démonstration.
Taill.......
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Discussion
Dans ce protocole, avant d’aérosoliser la formulation, l’ARNm est ramifié avec l’IPP pour améliorer l’absorption cellulaire. Cela sert de substitut pour la délivrance de LNP-ARNm lors de la validation in vitro 10,15. L’ARNm PEI conserve la plupart des fonctions des formulations LNP, y compris des caractéristiques biologiques et fonctionnelles importantes10. Les groupes amine chargés positivement d.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs ont reconnu le soutien financier de la bourse de recherche King’s Undergraduate Research Fellowship (KURF) et du Student Opportunity Fund fourni par le King’s College London.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tubes centrifugeuses de 50 mL | Sigma-Aldrich Company Limited | CLS430829-500EA | |
| 50&ndash ; 1000 & mu ; Pointes de pipette en L | Sigma-Aldrich Company Limited | Z740031-1000EA | |
| Lignée cellulaire A549 | Collection de la culture de type américain | ATCC CRM-CCL-185 | |
| Débitmètre d’air | N/A | N/A | Un débitmètre d’air générique peut être utilisé. |
| Modèle d’entrée nasale idéalisée de l’Alberta (AINI) | TSI Incorporated (via Copley Scientific, Royaume-Uni) | 0001-01-8540 | |
| Ruban indicateur d’autoclave | Sigma-Aldrich Company Limited | Z744090 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich Company Limited | D1306 | |
| DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbecco) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 11966025 | |
| Alcool éthylique pur | Sigma-Aldrich Company Limited | 32221-M | Acheté via Merck |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | A5256701 | |
| Formaldéhyde | Sigma-Aldrich Company Limited | F8775 | |
| HEK293T Ligne cellulaire | Collection de la culture de type américain | ATCC CRL-3216 | |
| Cabinet de biosécurité Heraeus HERAsafe HS 12 | Heraeus | N/A | |
| Impact de nouvelle génération | MSP, une division de TSI | 0170-01-1000 | Ce produit figure également dans le catalogue Copley, numéro de pièce 5201. |
| Appareil photo monochrome Nikon DS-Qi2 | Nikon | N/A | |
| Multiplats traités en culture cellulaire Nunc | Thermo Fisher Scientific | 142475 | |
| Fioles traitées en culture cellulaire Nunc EasYFlask | Thermo Fisher Scientific | 156340 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich Company Limited | P7793-1EA | |
| Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL) | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15140148 | |
| Comprimés de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 18912014 | |
| Polyéthylenimine chlorhydrate | Sigma-Aldrich Company Limited | 764965-1G | Acheté via SLS |
| Atomiseur nasal Rayleigh Jet | Resyca BV Enschede | Adaptateur de spray nasal souple | |
| Eau sans ARNase | Thermo Fisher Scientific | J60610. EQC | |
| Cuvette de taille | Malvern Panalytical | ZEN0040 | |
| La cellule capillaire repliée | Malvern Panalytical | DTS1070 | |
| Zetasizer Pro | Malvern Panalytical | Zetasizer Pro | |
| Logiciel Zetasizer Ultra-Pro ZS Xplorer | Malvern Panalytical | N/A |
Références
- Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
- Van Hoeve, W., et al.
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Réimpressions et autorisations
