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Article de méthode

Délivrance intranasale de polyplexes d’ARNm via des aérosols de rupture de Rayleigh : une méthode in vitro pour le dépôt nasal et les tests fonctionnels

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DOI :

10.3791/70000

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20 janvier 2026

 ,  , 
1GKT School of Medical Education, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 2Genetics, Faculty of Life Sciences and Medicine, King's College London, 3Institute of Pharmaceutical Science, King's College London

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente la rupture de Rayleigh comme un processus léger d’aérosolisation de vecteurs d’ARNm non viraux. Le dépôt régional des vecteurs d’ARNm aérosolisés est évalué par le modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI). L’expression de la protéine verte de fluorescence (GFP) dans les cellules pulmonaires humaines représente le maintien des fonctions physicochimiques et biologiques des vecteurs d’ARNm post-aérosolisés.

Résumé

L’administration intranasale de traitements à ARNm est une stratégie prometteuse pour la vaccination et le traitement des maladies respiratoires, offrant une activation immunitaire directe au site d’entrée du pathogène. Cependant, les méthodes conventionnelles d’aérosolisation (par exemple, les ultrasons ou les nébuliseurs à haute pression) détériorent les vecteurs d’ARNm non viraux par des forces de cisaillement excessives, ce qui fait perdre aux ARNm leur intégrité structurelle et leurs activités biologiques. Un atomiseur nasal de rupture de Rayleigh a été utilisé pour aérosoliser doucement les vecteurs d’ARNm de polyéthyléneimine (PEI) en gouttelettes uniformes. L’ARNm codant la protéine fluorescente verte (GFP) a été formulé en polyplexes cationiques et caractérisé avant et après l’aérosolisation. Le processus de rupture de Rayleigh forme un micro-jet continu de gouttelettes avec un cisaillement minimal, préservant ainsi les propriétés physico-chimiques des nanoparticules. Une taille constante des particules, un faible indice de polydispersion et un potentiel zêta stable avant et après l’aérosolisation ont été observés, confirmant que les propriétés physico-chimiques des polyplexes d’ARNm étaient bien préservées grâce à la fragmentation de Rayleigh pour l’aérosolisation. En utilisant un modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) des voies respiratoires nasales, les aérosols PEI-ARNm ont été administrés. Les ARNm aérosolisés se sont principalement déposés dans les régions des cornets. Des fractions négligeables ont été trouvées dans le nasopharynx ou dans les sections équivalentes pulmonaires. De plus, les polyplexes d’ARNm post-aérosolisés ont été administrés avec succès aux cellules épithéliales pulmonaires humaines A549 et ont produit une expression détectable de GFP. Ce protocole démontre une méthode de délivrance intranasale non destructive d’ARNm utilisant l’aérosolisation de rupture de Rayleigh. Il maintient efficacement les propriétés physicochimiques et les fonctions biologiques des vecteurs ARNm non viraux, atomisant la phase aqueuse en gouttelettes de taille appropriée pour un dépôt nasal ciblé. Ce protocole révèle une approche novatrice pour aérosoliser efficacement les ARNm et évaluer leur dépôt régional dans la cavité nasale.

Introduction

L’administration des vaccins dans la muqueuse nasale (le portail d’entrée de nombreux agents pathogènes respiratoires) peut provoquer une forte immunité locale et bloquer les infections à leur origine. Le succès des vaccins contre la grippe intranasale et l’approbation récente des vaccins intranasaux contre la COVID-19 soulignent l’efficacité de la voie nasale pour induire à la fois des réponses immunitaires muqueuses etsystémiques 1. L’administration intranasale des vaccins à ARNm suscite donc un grand intérêt en tant que stratégie pour prévenir les infections virales respiratoires. Un défi technique majeur est cependant de convertir des polyplexes fragiles d’ARNm en aérosol inhalable sans compromettre leur stabilité.

L’aérosolisation par fragmentation de Rayleigh offre une alternative douce en fonctionnant selon un principe physique différent. Dans un dispositif de rupture de Rayleigh, un flux liquide pressurisé est forcé à travers un orifice à l’échelle microscopique pour former un micro-jet continu. Le jet se fragmente naturellement en gouttelettes de taille uniforme en raison de l’instabilitéPlateau-Rayleigh 2. La tension superficielle provoque la fragmentation de la colonne liquide à une longueur d’onde caractéristique environ deux fois le diamètre de la buse. Contrairement à la nébulisation ultrasonique, ce processus n’introduit pratiquement aucun cisaillement turbulent ; Les gouttelettes se forment naturellement à partir de l’instabilité du jet, et non des forces de brisement externes. En conséquence, les formulations de nanoparticules subissent un stress minimal. Il a été démontré que l’utilisation de la rupture de Rayleigh peut aérosoliser les ARNm de nanoparticules lipidiques (LNP) sans changement significatif de taille, de charge de surface ou d’efficacité d’encapsulation avant ou aprèsla pulvérisation 3,4,5. Dans cette méthode, l’ARNm du PEI reste intact et fonctionnel après aérosolisation, contrairement à la détérioration observée avec des techniques de nébulisation plus agressives.

Un autre avantage de la décomposition de Rayleigh est le contrôle de la taille des gouttelettes. Les gouttelettes générées sont relativement grandes (de l’ordre de 20 à 30 μm). Cette taille de gouttelette est idéale pour la délivrance nasale : des particules de diamètre aérodynamique de >10 μm tendent à se déposer dans le nez et les voies respiratoires supérieures plutôt que de dériver vers lespoumons 3. En produisant des gouttelettes principalement au-dessus de ce seuil, l’atomiseur de Rayleigh cible naturellement le dépôt dans la cavité nasale. Le ciblage est encore renforcé par l’utilisation du modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI) pour optimiser les techniques d’administration. L’AINI est une réplique des voies respiratoires nasales imprimée en 3D qui prédit avec précision les schémas de dépôt de pulvérisation in vivo 6. En utilisant ce modèle, il a été constaté que pulvériser à un angle de 45° dans la narine augmente largement le dépôt auxcornets 7. L’aspect administratif influence significativement le schémade dépôt 7. Le dépôt dans des zones non ciblées comme le nasopharynx ou les poumons est indésirable, car il peut provoquer une irritation de la gorge, un mauvais goût ou des effets secondairessystémiques. Dans ce protocole, ces conditions ont été reproduites (un angle de pulvérisation de 45° et un flux d’air inhalé contrôlé) pour maximiser le dépôt de turbinets de l’aérosolARNm 3. Les données précédentes montrent que plus de la moitié de la masse d’ARNm délivrée peut être concentrée dans la région des cornets dans des conditions optimales, tandis que <10 % atteint le nasopharynx ouau-delà de 3. Cette administration ciblée devrait améliorer l’efficacité du vaccin en concentrant la dose sur les sites inductifs de l’immunité (qui sont bien vascularisés et riches en cellules immunitaires) tout en minimisant simultanément les dépôts hors cible susceptibles de conduire à des déchets ou des effets indésirables.

Dans cet article de méthodologie, la procédure expérimentale d’aérosolisation de l’ARNm via la rupture de Rayleigh est décrite en détail, évaluant les dépôts régionaux dans le modèle AINI et évaluant l’activité biologique de l’ARNm déposé in vitro. Un ARNm rapporteur codant pour la GFP est utilisé pour visualiser les résultats de la transfection dans les cellules humaines. HEK293T cellules sont choisies pour tester la fonctionnalité des complexes aérosolisés. Pour renforcer l’absorption cellulaire de l’ARNm aérosolisé in vitro, celui-ci est ramifié avec le PEI pour former des polyplexes d’ARNm PEI avant leur ajout aux cellules. Le PEI est un agent transfecteur polymère cationique qui peut améliorer l’efficacité de la délivrance de l’ARNm, et un rapport molaire N :P (azote : phosphate) de 24:1 a été utilisé ici, basé sur une optimisation antérieure pour la délivrance des gènes. L’EPI est utilisé uniquement pour l’étape de validation de la culture cellulaire dans cette étude et ne fait pas partie de la délivrance en aérosol vers un nez réel (en vivo , on se fierait uniquement à l’ARNm LNP, mais en culture cellulaire, cela aide à maximiser l’expression génique pour la détection).

Ce protocole met en lumière une nouvelle approche pour la délivrance intranasale d’un vaccin à ARNm, qui répond au problème de stabilité de l’ARNm en aérosol. La rupture de Rayleigh n’a été appliquée que récemment à la délivrance d’acides nucléiques dans quelques études 3,4,5,9, et ce travail fournit un guide méthodologique détaillé pour mettre en œuvre cette technique. En suivant cette procédure étape par étape, les chercheurs peuvent reproduire l’aérosolisation douce des nanoporteurs d’ARNm et évaluer leurs caractéristiques de dépôt et de transfection. La section Protocole ci-dessous est organisée en parties séquentielles : (1) formulation PEI-ARNm ; (2) Caractérisation des nanoparticules (taille et potentiel zêta) avant et après l’aérosolisation ; (3) Fonctionnement de l’atomiseur de rupture de Rayleigh et de la procédure de dépôt nasal AINI. Des considérations clés pour réussir, telles que le maintien de conditions sans RNase et un alignement correct des dispositifs, sont notées. Les résultats et la discussion incluent des résultats représentatifs, des avantages de la méthode par rapport aux approches conventionnelles, des applications potentielles (par exemple, vaccins nasaux contre la grippe ou laCOVID-19 10,11,12), ainsi que des limites et des conseils de dépannage. Cette méthodologie globale vise à permettre des expériences de délivrance d’ARNm intranasal reproductible et à accélérer le développement de vaccins à ARN muqueusel sans aiguilles.

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Protocole

REMARQUE : Culture HEK293T et lignées cellulaires A549 dans un milieu complet composé du Médium Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complété avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 2 % de pénicilline-streptomycine avant la transfection d’ARNm PEI. Faites passer les deux lignées cellulaires environ toutes les 48 heures à la confluence. Cellules de graines à une densité de 40 000 cellules par cm² et cultivées pendant ~48 h. Retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) immédiatement avant la transfection pour éliminer le sérum résiduel et standardiser les conditions de transfection. Autoclave tous les flasques de culture cellulaire, plaques à 24 puits, PBS, pipettes et embouts de pipette avant utilisation.

1. Formulation PEI-ARNm

  1. Formation de complexes PEI-ARNm (pour la transfection in vitro )
    REMARQUE : Cette étape n’est requise que si l’EPI est utilisée pour stimuler la transfection en culture cellulaire.
    1. Calculez la quantité d’IEP requise pour le rapport molaire N :P souhaité.
      REMARQUE : N :P = 24 (c’est-à-dire 24 moles d’amines chargées positivement par mole de phosphates chargés négativement sur l’ARNm) est utilisé ; et une quantité de 10 μg d’ARNm nécessiterait ~31 μg PEI pour former des ARNm PEI à ce rapport N/P.
    2. Préparez une solution diluée pour l’IPE (par exemple, 1 mg/mL de bouillon dans de l’eau) et autoclave.
    3. Diluez l’ARNm à une concentration appropriée (par exemple, 0,2 μg/μL).
    4. Ajoutez la solution PEI à la solution d’ARNm tout en mélangeant doucement (ne pas faire de vortex).
      REMARQUE : Le mélange peut être dans un petit tube ; Faites une pipette de haut en bas avec précaution ou faites tourner le tube pour mélanger.
    5. Incubez à température ambiante pendant ~20 minutes pour permettre la liaison électrostatique de l’IEP à l’ARNm.
      REMARQUE : Si vous n’utilisez pas l’IPP, l’ARNm nu peut être aérosolisé directement. L’IEP supplémentaire a grandement amélioré l’expression génique des cellules A549, mais elle est optionnelle et pourrait ne pas être utilisée pour une livraison in vivo réelle en raison de considérations de toxicité.

2. Caractérisation des nanoparticules (taille et potentiel zêta)

REMARQUE : Configurez les paramètres de mesure dans le logiciel et enregistrez en méthode avant d’utiliser l’analyseur pour mesurer la taille ou le potentiel zeta. La configuration de la méthode est nécessaire pour faire fonctionner l’instrument, et les paramètres dépendent de l’environnement de mesure, de la cuvette utilisée et des propriétés de l’échantillon.

  1. Pré-aérosolisation de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. À l’aide d’un analyseur de taille de particules, chargez un échantillon dilué de la formulation dans une cuvette de taille jetable (par exemple, 500 μL à 0,2 μg/μL).
    2. Allumez l’analyseur et ouvrez le logiciel13 sur l’ordinateur connecté.
    3. Cliquez sur le bouton Mesurer en haut de la fenêtre.
    4. Cliquez sur l’icône bleue de fichier en haut de la fenêtre pour sélectionner la méthode de taille prédéfinie.
    5. Renommer le protocole pour qu’il corresponde au nom de l’échantillon.
    6. Appuyez sur le bouton du couvercle de l’analyseur pour ouvrir la chambre.
    7. Insérez la cuvette dans la chambre.
    8. Cliquez sur le bouton vert Exécuter en haut de la fenêtre logicielle. Attendez que la mesure soitterminée 13.
    9. Cliquez sur le bouton Analyser en haut de la fenêtre logicielle, puis cliquez sur le bouton Taille à la page13 des résultats.
    10. Obtenez le diamètre hydrodynamique moyen (moyenne Z) et l’indice de polydispersion (PDI) à partir du tableau des statistiques.
    11. Appuyez sur le bouton du couvercle de l’analyseur pour ouvrir la chambre, retirer la cuvette et fermer le couvercle.
    12. Jetez la cuvette et rincez l’atomiseur avec de l’eau sans RNAase et avec 70 % d’éthanol v/v pour désinfecter et faciliter le séchage entre deux mesures de taille.
      REMARQUE : Pour l’atomiseur Rayleigh, veillez à ne pas laisser de dépôts de sel ni de résidus dans la buse, car cela peut modifier la performance de la pulvérisation.
  2. Pré-aérosolisation du potentiel zêta
    1. Utilisez le même instrument (ou un analyseur de potentiel Zeta), chargez un échantillon dilué de la formulation dans une cellule capillaire repliée (par exemple, 700 μL à 0,2 μg/μL).
    2. Allumez l’analyseur et ouvrez le logiciel13 sur l’ordinateur connecté.
    3. Cliquez sur le bouton Mesurer en haut de la fenêtre.
    4. Cliquez sur l’icône Fichier bleue en haut de la fenêtre pour sélectionner la méthode zeta prédéfinie.
    5. Renommer le protocole pour qu’il corresponde au nom de l’échantillon.
    6. Appuyez sur le bouton du couvercle de l’analyseur pour ouvrir la chambre.
    7. Insérez la cuvette dans la chambre.
    8. Cliquez sur le bouton vert Exécuter en haut de la fenêtre logicielle. Attends que la machine tourneà 13.
    9. Cliquez sur le bouton Analyser en haut de la fenêtre logicielle, puis sur le bouton Zeta à la page13 des résultats.
    10. Obtenez le potentiel zêta (charge de surface) en consultant le tableau des statistiques.
    11. Appuyez sur le bouton du couvercle de l’analyseur pour ouvrir la chambre, retirer l’échantillon et fermer le couvercle.
    12. Rincez la cuvette et l’atomiseur avec de l’eau sans RNAase et avec 70 % d’éthanol v/v pour désinfecter et faciliter le séchage entre les mesures du potentiel zéta.
      REMARQUE : Pour l’atomiseur Rayleigh, veillez à ne pas laisser de dépôts de sel ni de résidus dans la buse, car cela peut modifier la performance de la pulvérisation.

3. Aérosolisation de la rupture de Rayleigh et dépôt nasal

  1. Installation atomiseur et AINI
    1. Assemblez le dispositif atomiseur nasal de rupture de Rayleigh et le modèle Alberta Idealized Nasal Inlet (AINI).
      REMARQUE : Le modèle AINI se compose de sections creuses anatomiquement représentatives correspondant à différentes régions de la cavité nasale humaine (par exemple, vestibule narinal, région des cornets, région olfactive, nasopharynx).
    2. Assurez-vous que tous les composants de l’AINI sont propres et secs avant utilisation (les résidus peuvent modifier les résultats de dépôt). Nettoyez en lavant avec de l’eaudéionisée 9 puis avec de l’éthanol ou un solvant organique.
    3. Reliez l’AINI à un Impacteur de Nouvelle Génération (NGI) qui est relié à une pompe à vide à sa sortie pour aspirer l’air à travers les voies nasales.
    4. Réglez le débit à 7,5 L/min – un débit représentant une inhalation nasale lente et profonde chez unadulte 6. Utilisez un débitmètre calibré (ou un rotamètre) relié à l’orifice d’induction du NGI. Ajustez la pompe jusqu’à ce que le débitmètre affiche 7,5 L/min.
      REMARQUE : Utilisez un débitmètre pour mesurer le débit d’air au débit requis pour les tests.
    5. Maintenez ce flux d’air pendant toute la durée de la pulvérisation. Utilisez du Parafilm pour sceller correctement l’appareil à l’AINI.
  2. Positionnement de l’atomiseur
    1. Insérez la buse de l’atomiseur de rupture de Rayleigh à l’entrée de la narine AINI (section du vestibule) à un angle de 45°.
    2. Fixez l’atomiseur de façon à ce qu’il ne se déplace pas pendant le fonctionnement (toutes les connexions, sections de modèle, tubes à pompe) sont hermétiques.
  3. Chargement de l’échantillon
    1. Mélangez délicatement la suspension d’ARNm PEI préparée pour assurer l’homogénéité (éviter de créer des bulles).
    2. Aspirez l’échantillon dans le réservoir de l’atomiseur.
      REMARQUE : Selon la conception de l’appareil, cela peut impliquer de remplir une embout de seringue ou de pipette qui se fixe à l’atomiseur.
    3. Chargez l’échantillon dans l’appareil.
      REMARQUE : Par exemple, retirez un capuchon ou une chambre centrale dans l’atomiseur, pipettez l’échantillon, puis réassemblez l’appareil solidement. Assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites et que l’appareil est correctement apprêté si nécessaire.
  4. Production de l’aérosol
    1. Activez le débit d’air (7,5 L/min via l’AINI) de la pompe avant ou en même temps que le démarrage de la pulvérisation, conformément aux instructions de l’appareil.
    2. Activez l’atomiseur de rupture de Rayleigh pour commencer l’aérosolisation.
      REMARQUE : Pour un atomiseur manuel actionné par seringue, appuyez progressivement sur le ventoir de la seringue pour forcer le liquide à travers l’orifice. Vaporisez tout le volume de l’échantillon d’un coup continu si possible. Le plongeur doit être enfoncé de manière fluide pour générer une pression de fonctionnement stable, car la formulation n’est aérosolisée qu’après avoir été pressurisée à une pression élevée et exposée à un taux de cisaillement de paroi à l’intérieur du micro-orifice14. Les mouvements rapides des plongeurs modifient la pression et modifient donc à la fois la vitesse de cisaillement et le temps d’expositionau cisaillement 14.
    3. Assurez-vous que le débit reste de 7,5 L/min tout au long de l’appareil. Les gouttelettes d’aérosol doivent traverser le modèle des voies nasales et être déposées à différentes régions selon leur taille aérodynamique.
    4. Coupez rapidement la pompe à air pour éviter que les gouttelettes déjà déposées ne soient aspirées plus bas ou ne sèchent de façon inégale.
  5. Collecte d’échantillons auprès de l’AINI
    1. Démontez soigneusement le modèle AINI en ses segments anatomiques individuels pour collecter les nanoparticules déposées de chaque région.
      REMARQUE : Avant de démonter, notez ou marquez l’orientation pour suivre les sections.
    2. Collecter les dépôts de six compartiments : (i) le dispositif atomiseur, (ii) la section du vestibule nasal, (iii) la section des cornets, (iv) la région olfactive, (v) la section nasopharynx, et (vi) toute capture en aval (par exemple, les étapes d’un NGI attaché ou un filtre final représentant la fraction pénétrante dans les poumons)
    3. Pour chaque compartiment, utilisez un volume mesuré de milieu de culture cellulaire pour laver le matériau déposé.
      REMARQUE : Par exemple, pour collecter le dépôt de cornet, détachez la section du cornet et rincez soigneusement ses surfaces internes avec 5 mL de médium Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, à l’aide d’une pipette jetable. Lavez doucement toutes les surfaces, puis versez le rinçage dans un tube centrifuge de 15 mL identifié (utilisez un entonnoir pour faciliter le transfert). Lors du rinçage, le segment était maintenu horizontalement ou légèrement incliné pour assurer un contact complet de surface interne tout en empêchant la fuite de liquide. Répétez de la même façon pour le vestibule, l’olfactivité, le nasopharynx et toutes autres sections, en utilisant 5 mL de DMEM frais pour chaque section et en collectant dans des tubes étiquetés séparés.
    4. Récupérez tout échantillon résiduel de l’atomiseur.
      REMARQUE : Pour un type seringue, rince la seringue et la buse dans un tube.
    5. Récupérer le liquide des étages NGI (cascade impacteur) si l’AINI était connecté à un NGI pour piéger les particules fines (par exemple, en rinçant les étages avec du DMEM).
    6. Bouchez le tube avec le liquide collecté.
      REMARQUE : Évitez de perdre des gouttelettes sur les surfaces de laboratoire ou par évaporation.
  6. Gestion après la collecte
    1. Immédiatement après la collecte, les échantillons d’ARNm PEI-étaient placés séparément sur les cellules pour transfection.
      REMARQUE : On peut laisser les échantillons d’ARNm PEI au réfrigérateur pendant ~1 à 2 heures (jusqu’à 6 heures maximum) avant de les utiliser pour la transfection. Un certain volume (maximum 1 mL) est prélevé à partir de chaque échantillon collecté d’ARNm PEI pour caractériser les vecteurs post-aérosolisés (c’est-à-dire les mesures DLS et zêta).
  7. Nettoyage de l’appareil
    1. Nettoyez soigneusement l’atomiseur et le modèle AINI après chaque essai pour éviter la contamination croisée des expériences ultérieures.
    2. Rincez toutes les sections AINI et les parties atomiseurs avec de l’eau déionisée pour éliminer le substrat et les nanoparticules, puis avec 70 % d’éthanol pour désinfecter et faciliter le séchage.
      REMARQUE : Si l’appareil ou le modèle possède de petits orifices, rincez-les avec une seringue.
    3. Séchez toutes les pièces pour l’aérer complètement (ou placez-les dans un meuble à séchage à basse température) avant de les remonter. Pour l’atomiseur Rayleigh, veillez à ne pas laisser de dépôts de sel ni de résidus dans la buse, car cela peut modifier la performance de la pulvérisation.

4. Imagerie cellulaire

REMARQUE : Après la transfection, retirez le milieu de transfection et remplacez-le par un nouveau substrat complet pour mettre fin à l’exposition. Cultivez les cellules pendant 48 heures pour permettre l’expression des rapporteurs et la récupération cellulaire. À ~80 % de confluence, fixez les cellules avec 4 % de formaldéhyde pendant 8 minutes, puis colorez les noyaux avec 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ; 300 nM) pendant 5 minutes, suivi d’un lavage PBS 2 fois avant l’imagerie.

  1. Imagerie par fluorescence
    1. Utilisez un microscope à fluorescence avec des ensembles de filtres pour DAPI et GFP.
    2. Commencez par le canal bleu (longueur d’onde d’excitation = 385 nm, longueur d’onde d’émission = 477,5 nm) pour visualiser les noyaux colorés en DAPI.
    3. Passez au canal Green (longueur d’onde d’excitation = 488 nm, longueur d’onde d’émission = 525 nm) pour visualiser les cellules positives à la GFP.

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Résultats

En tant que manuscrit axé sur les méthodes, les résultats détaillés ne sont pas l’objectif principal ; Cependant, des résultats représentatifs sont présentés pour illustrer les résultats attendus de chaque étape du protocole. Les figures mentionnées ci-dessous montrent des données d’exemple (par exemple, graphiques ou images) soutenant la validité de la méthode, mais aucune nouvelle analyse quantitative n’est incluse, au-delà de la démonstration.

Taill...

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Discussion

Dans ce protocole, avant d’aérosoliser la formulation, l’ARNm est ramifié avec l’IPP pour améliorer l’absorption cellulaire. Cela sert de substitut pour la délivrance de LNP-ARNm lors de la validation in vitro 10,15. L’ARNm PEI conserve la plupart des fonctions des formulations LNP, y compris des caractéristiques biologiques et fonctionnelles importantes10. Les groupes amine chargés positivement d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs ont reconnu le soutien financier de la bourse de recherche King’s Undergraduate Research Fellowship (KURF) et du Student Opportunity Fund fourni par le King’s College London.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes centrifugeuses de 50 mLSigma-Aldrich Company LimitedCLS430829-500EA
50&ndash ; 1000 & mu ; Pointes de pipette en LSigma-Aldrich Company LimitedZ740031-1000EA
Lignée cellulaire A549Collection de la culture de type américainATCC CRM-CCL-185
Débitmètre d’airN/AN/AUn débitmètre d’air générique peut être utilisé.
Modèle d’entrée nasale idéalisée de l’Alberta (AINI)TSI Incorporated (via Copley Scientific, Royaume-Uni)0001-01-8540
Ruban indicateur d’autoclaveSigma-Aldrich Company LimitedZ744090
DAPISigma-Aldrich Company LimitedD1306
DMEM (Eagle Medium modifié de Dulbecco)Gibco, Thermo Fisher Scientific11966025
Alcool éthylique purSigma-Aldrich Company Limited32221-MAcheté via Merck
Sérum fœtal bovin (FBS)Gibco, Thermo Fisher ScientificA5256701
FormaldéhydeSigma-Aldrich Company LimitedF8775
HEK293T Ligne cellulaireCollection de la culture de type américainATCC CRL-3216
Cabinet de biosécurité Heraeus HERAsafe HS 12HeraeusN/A
Impact de nouvelle générationMSP, une division de TSI0170-01-1000Ce produit figure également dans le catalogue Copley, numéro de pièce 5201.
Appareil photo monochrome Nikon DS-Qi2NikonN/A
Multiplats traités en culture cellulaire NuncThermo Fisher Scientific142475
Fioles traitées en culture cellulaire Nunc EasYFlaskThermo Fisher Scientific156340
ParafilmSigma-Aldrich Company LimitedP7793-1EA
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Gibco, Thermo Fisher Scientific15140148
Comprimés de solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific18912014
Polyéthylenimine chlorhydrateSigma-Aldrich Company Limited764965-1GAcheté via SLS
Atomiseur nasal Rayleigh JetResyca BV EnschedeAdaptateur de spray nasal souple
Eau sans ARNaseThermo Fisher ScientificJ60610. EQC
Cuvette de tailleMalvern PanalyticalZEN0040
La cellule capillaire repliéeMalvern PanalyticalDTS1070
Zetasizer ProMalvern PanalyticalZetasizer Pro
Logiciel Zetasizer Ultra-Pro ZS XplorerMalvern PanalyticalN/A

Références

  1. Akula, V. R., et al. Effect of heterologous intranasal incovacc(r) vaccination as a booster to two-dose intramuscular COVID-19 vaccination series: a randomized phase 3 clinical trial. Commun Med (Lond). 5 (1), 133(2025).
  2. Van Hoeve, W., et al. Breakup of diminutive Rayleigh jets. Phys Fluids. 22 (12), (2010).
  3. Li, H. Y., et al. Targeted nasal delivery of LNP-mRNAs aerosolised by Rayleigh breakup technology. Int J Pharm. 672, 125335(2025).
  4. He, P., et al. Rayleigh-based soft mist inhalers preserve mRNA-LNP integrity for pulmonary delivery. J Drug Deliv Sci Technol. 115, 107651(2026).
  5. Biesel, A., et al. Soft mist inhaler nebulization by Rayleigh-breakup largely preserves functional integrity of liposomal mRNA in respirable aerosols. Eur J Pharm Sci. 214, 107300(2025).
  6. Chen, J. Z., Finlay, W. H., Martin, A. In vitro regional deposition of nasal sprays in an idealized nasal inlet: comparison with in vivo gamma scintigraphy. Pharm Res. 39 (11), 3021-3028 (2022).
  7. Chen, J. Z., Kiaee, M., Martin, A. R., Finlay, W. H. In vitro assessment of an idealized nose for nasal spray testing: comparison with regional deposition in realistic nasal replicas. Int J Pharm. 582, 119341(2020).
  8. Hopke, P. K., Wang, Z. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. Fine Particles in Medicine and Pharmacy. , Springer. US, Boston, MA. (2012).
  9. Wang, H., et al. Evaluation of Rayleigh jet atomizer for intranasal delivery of lipid nanoparticle-siRNA formulations: stability, deposition, and device performance. Int J Pharm. 683, 126084(2025).
  10. Moreno Herrero, J., et al. Compact polyethylenimine-complexed mRNA vaccines. Nat Nanotechnol. 20 (9), 1323-1331 (2025).
  11. Geall, A. J., et al. Non-viral delivery of self-amplifying RNA vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (36), 14604-14609 (2012).
  12. Xi, J., Lei, L. R., Zouzas, W., Si, X. A. Nasally inhaled therapeutics and vaccination for COVID-19: developments and challenges. MedComm. 2 (4), 569-586 (2021).
  13. Zetasizer Advance Series User Guide. , MAN0592-15-EN edn, Malvern Panalytical. (2023).
  14. Method of aerosolizing nanoparticle formulations. China patent. , CN116723892A (2023).
  15. Casper, J., et al. Polyethylenimine (PEI) in gene therapy: current status and clinical applications. J Control Release. 362, 667-691 (2023).
  16. Jin, Y., et al. A novel experimental approach to measure nebulized droplet deposition pattern and deposition fraction in an idealized mouth-to-throat model. Phys Fluids. 35 (8), (2023).
  17. Darquenne, C. Aerosol deposition in health and disease. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).
  18. Liu, J., et al. Turbinate-homing IgA-secreting cells originate in the nasal lymphoid tissues. Nature. 632 (8025), 637-646 (2024).
  19. Debus, H., Baumhof, P., Probst, J., Kissel, T. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: biophysical characterization and in vitro transfection properties. J Control Release. 148 (3), 334-343 (2010).
  20. Brandtzaeg, P. Potential of nasopharynx-associated lymphoid tissue for vaccine responses in the airways. Am J Respir Crit Care Med. 183 (12), 1595-1604 (2011).
  21. Foley, R. A., et al. Lipid nanoparticles for the delivery of CRISPR/Cas9 machinery to enable site-specific integration of CFTR and mutation-agnostic disease rescue. bioRxiv. , (2025).
  22. Hou, X., Zaks, T., Langer, R., Dong, Y. Lipid nanoparticles for mRNA delivery. Nat Rev Mater. 6 (12), 1078-1094 (2021).
  23. D'Angelo, I., et al. Hybrid lipid/polymer nanoparticles for pulmonary delivery of siRNA: development and fate upon in vitro deposition on the human epithelial airway barrier. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 31 (3), 170-181 (2018).
  24. Movia, D., Bazou, D., Volkov, Y., Prina-Mello, A. Multilayered cultures of NSCLC cells grown at the air-liquid interface allow the efficacy testing of inhaled anti-cancer drugs. Sci Rep. 8 (1), 12920(2018).
  25. Waltl, E., Eckl-Dorna, J., Selb, R., Valenta, R., Niederberger, V. Characterisation and culture of primary human nasal epithelial cells and the influence of interferon-gamma. Clin Transl Allergy. 4 (2), P21(2014).

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