Profilage des mutations de l’ADN du récepteur du facteur de croissance épidermique dans des cellules rares circulantes à l’aide d’un système d’isolation cellulaire et de la PCR numérique par gouttelettes

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour illustrer l’isolement de cellules cancéreuses rares à partir d’un échantillon artificiel contenant du sang total et avec des cellules cancéreuses du poumon. Le protocole utilise une plateforme d’isolation de cellules semi-automatisée et sans étiquette. Les cellules enrichies sont ensuite analysées pour détecter des mutations des récepteurs des facteurs de croissance épidermiques à l’aide de la PCR numérique des gouttelettes.

Résumé

Les mutations trouvées dans le gène du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont cruciales pour déterminer les traitements les plus efficaces pour les patients atteints de cancer du poumon. Les tests de routine pour les mutations de l’EGFR peuvent prendre la forme de biopsies tumorales ou d’analyses d’ADNct provenant du plasma de patients atteints d’un cancer du poumon. Bien que le test d’échantillons de sang chez des patients atteints d’un cancer du poumon soit réalisé régulièrement pour fournir un aperçu de la présence ou de la récidive du cancer du poumon, via la détection d’ADNct ou la détection CTC, cela ne nécessite généralement pas l’analyse moléculaire ultérieure des cellules capturées. La détection de mutations individuelles au sein du gène EGFR présentes dans les cellules tumorales circulantes rares (CTC) peut offrir des éclairages supplémentaires sur l’efficacité potentielle des thérapies ciblées et, au-delà, sur le pronostic du patient, en particulier dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC). Malheureusement, la rareté de telles cellules tumorales circulantes et l’absence de procédures simplifiées pour interroger leurs informations génomiques représentent un défi de détection important.

L’objectif de ce protocole est d’illustrer le potentiel réaliste de la capture des CTC dans le sang total et de l’évaluation de leur contenu moléculaire à l’aide de ddPCR. Une plateforme d’isolation cellulaire semi-automatisée, basée sur la taille, a été utilisée pour capturer les cellules tumorales circulantes, qui ont ensuite été récupérées pour une analyse moléculaire en aval. Pour déterminer la présence de mutations spécifiques de l’EGFR dans l’ADN génomique des cellules capturées, la ddPCR a été réalisée à l’aide d’analyses pour EGFR pT790M et EGFR pL858R.

Deux lignées cellulaires distinctes de cancer du poumon (A549 et H1975) ont été activement enrichies à partir du sang total et la quantification précise des mutations présentes dans les lignées cellulaires H1975 a été réalisée à l’aide de ddPCR.

Introduction

Avec la poursuite de la recherche translationnelle sur la valeur des biopsies liquides et des publications récentes illustrant spécifiquement la valeur clinique de la surveillance par ADNct dans la sélection^{thérapeutique 1} , les biopsies liquides de sélection 1 arrivent à maturité. Les biopsies liquides offrent une méthode alternative moins invasive pour le suivi et le pronostic du cancer par rapport aux méthodes classiques de biopsie tissulaire. Des recherches approfondies se sont concentrées sur l’ADN fragmenté trouvé dans le sang (ADN sans cellule, cfDNA), et plus précisément sur le sous-compartiment issu d’une tumeur, appelé ADN tumoral circulant (ctDNA). Le ctDNA a été largement étudié au cours des deux dernières décennies et a montré qu’il contient des mutations génétiques spécifiques à la tumeur, par exemple les SNV et les variantes structurales, ainsi que des marqueurs de méthylation et un motif fragmentaire distinct comparé à l’ADNcf non tumoral. Ces caractéristiques spécifiques de ctDNA sont désormais utilisées pour surveiller l’état moléculaire des patients atteints de cancer à travers la détection précoce, la réponse thérapeutique, la maladie résiduelle minimale (MRD) et la résistance au statut thérapeutique. De même, les cellules tumorales circulantes (CTC), détachées du site tumoral primaire dans des vaisseaux sanguins, ont récemment évolué en biomarqueurs prometteurs dont l’existence et la quantité dans le sang ont montré une corrélation étroite avec la progression de la maladie et le potentiel de récidive. Bien que les toutes premières études sur les CTC reposaient principalement sur l’expression et l’énumération de leurs marqueurs^{protéiques 2}, des progrès significatifs ont été réalisés dans l’étude des CTC au niveau moléculaire, notamment la détection de mutations génomiques dans le récepteur œstrogène 1 (ESR1) pour le cancer du sein, et le gène du facteur de croissance épidermique (EGFR) pour divers cancers.

Les mutations de l’EGFR sont essentielles tant pour la détermination de la pathogenèse et du pronostic, mais aussi pour déterminer les traitements les plus efficaces pour les patients atteints de cancer^{du poumon 3}. Les tests de routine pour les mutations de l’EGFR peuvent prendre la forme de biopsies tumorales solides au diagnostic ou de la progression ou, plus récemment, d’échantillonnage d’ADNct dans le plasma de patients atteints d’un cancer du poumon récidivant/^{réfractaire 4}. Cependant, contrairement aux approches basées sur l’ADNct, l’analyse du matériel génomique dérivé du CTC permet une évaluation directe des cellules tumorales intactes et de leurs profils mutationnels. Parallèlement aux études MRD par ADNct, la détection de mutations dans le gène EGFR des CTC rares peut fournir une compréhension supplémentaire de l’efficacité potentielle des schémas thérapeutiques et, au-delà, du pronostic du patient, en particulier dans le cancer du poumon non à petites cellules (CPNM). La rareté des CTC et l’absence de protocoles simplifiés utilisant des instruments conviviaux pour les cliniques constituent un obstacle sérieux à une adoption plus large. Cette limitation met en lumière la nécessité d’un flux de travail standardisé et accessible qui permette à la fois une isolation efficace des CTC et une analyse moléculaire en aval. Par conséquent, l’objectif de cette étude est de présenter un flux de travail reproductible pour l’enrichissement des cellules tumorales circulantes et la détection ultérieure des mutations EGFR en utilisant une approche combinée d’isolement cellulaire et de PCR numérique.

Le système d’isolation cellulaire Genesis avec lames de capture cellulaire microfluidiques peut capturer des CTC dans un procédé semi-automatisé avec une viabilité et une grande efficacité de capture, grâce à leur taille plus grande et leur déformation réduite par rapport à la population primaire de globules blancs et^{rouges 5,6}. Les CTC capturés peuvent ensuite être récupérés à partir des lames de capture cellulaire microfluidiques par écoulement inverse de la lame pour une analyse génomique ultérieure. Pour déterminer la présence de mutations spécifiques de l’EGFR dans l’ADN génomique des cellules capturées, la ddPCR a été réalisée sur de l’ADN génomique dérivé du CTC à l’aide d’analyses pour EGFR T790M et L858R.

Ce protocole, utilisant un échantillon modèle de CTC et des tests ddPCR disponibles dans le commerce, est conçu pour illustrer un point d’entrée pour la détection ciblée des mutations associées au cancer dans les CTC. Ce protocole offre une approche pratique pour détecter les mutations associées au cancer dans les cellules tumorales circulantes et pourrait soutenir de futures recherches sur des applications en biopsie liquide.

Protocole

Déclaration éthique :

Des échantillons de sang ont été prélevés auprès de sources autorisées pour des fins de recherche, et un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les donneurs avant la collecte des échantillons. Tous les protocoles expérimentaux impliquant des échantillons de sang humain ont été examinés et approuvés par le comité d’éthique institutionnel d’un fournisseur de sang, Discovery Life Sciences (Alabama, États-Unis). Toutes les procédures impliquant des échantillons de sang humain ont été menées conformément aux normes éthiques du comité de recherche institutionnel et à la Déclaration d’Helsinki.

1. Enrichissement des cellules cancéreuses utilisant un système d’isolation cellulaire semi-automatisé

Note : Cette section décrit l’enrichissement des cellules tumorales circulantes (CTC) à l’aide d’une plateforme d’isolement cellulaire semi-automatisée, suivie de la détection des mutations EGFR par PCR numérique par gouttelettes. Un échantillon modèle de CTC est utilisé pour démontrer la faisabilité, et la validation des essais est recommandée avant l’application clinique. Deux lignées cellulaires de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC) ont été utilisées : NCI-H1975 (mutations EGFR L858R/T790M) et A549 (type sauvage EGFR), qui ont servi de témoins négatif pour la détection des mutations.

1. Échantillon de sang
   1. Assurez-vous que le consentement éclairé est obtenu des donneurs de sang/patients avant la prélèvement sanguin. Obtenir l’approbation du Conseil d’Éthique Institutionnelle (IRB), lorsque nécessaire, pour la recherche impliquant des spécimens humains, y compris le sang.
   2. Pour des tests de faisabilité, prélevez un échantillon sanguin auprès d’un fournisseur agréé tiers uniquement pour la recherche.
   3. Prélever le sang périphérique dans des tubes d’acide éthylédiaminétraacétique (EDTA) et traiter l’échantillon selon le protocole d’enrichissement Genesis dans les 48 heures.
      Note. Pour l’analyse en aval et le protocole d’enrichissement Genesis, les tubes EDTA sont recommandés. Le tube Streck et le tube EDTA peuvent être utilisés pour l’immunocoloration sur lame avec les protocoles d’énumération Genesis (direct/indirect).
   4. Conserver les échantillons de sang prélevés dans des tubes EDTA à 2–8 °C jusqu’à utilisation. Pour l’isolement des cellules Genesis, aucun prétraitement n’est requis et un sang total jusqu’à 10 mL peut être utilisé pour le protocole d’enrichissement.
2. Préparation d’échantillon CTC modèle / Échantillon clinique
   1. Préparez une solution de stock cellulaire à une concentration de 100 à 1 000 cellules dans un milieu de culture cellulaire approprié de 10 μL ou un tampon de solution saline tamponnée phosphate (PBS). Sauter cette étape si des échantillons cliniques sont utilisés.
      REMARQUE : Les concentrations de pic utilisées dans cette étude sont supérieures aux niveaux cliniques typiquement observés de CTC et sont destinées uniquement à des fins de démonstration de méthode.
   2. Ajoutez les 10 μL de la solution de base cellulaire dans jusqu’à 10 mL de sang total provenant d’un donneur sain pour préparer un échantillon modèle de CTC. Pour les échantillons cliniques, n’incluez aucune cellule cancéreuse dans les échantillons sanguins entiers des patients.
   3. Mélangez l’échantillon de sang avec un volume égal de PBS (1x) et agitez doucement sur un bascule à sang à température ambiante jusqu’à utilisation. Si le stockage dépasse une heure, conserver à 4 °C.
3. Enrichissement CTC
   1. Allumez le système d’isolation des cellules Genesis et attendez l’initialisation du système. Cela peut prendre jusqu’à 5 minutes.
   2. Placez le bocal à déchets en position à la base des baies de la station et fixez le tube du pot à déchets au pot.
   3. Appuyez sur le tube dans la vanne de pincement jusqu’à ce que vous sentiez qu’il s’enclenche en place, puis fixez le tube du système Genesis à la sortie du pot à déchets.
   4. Effectuez un auto-test en appuyant sur « start » depuis l’écran d’accueil et en touchant « Auto-test » à l’écran.
   5. Lorsque l’auto-test est terminé, sélectionnez « 2.0 Enrichment du kit » parmi les options du protocole sélectionné.
   6. Suivez les instructions à l’écran, remplissez les champs de saisie de données requis et terminez la procédure d’amorçage et d’assemblage. Un amorçage réussi utilisant 70 % d’éthanol et 1x PBS offre les meilleures performances de capture cellulaire et de récupération pour l’extraction de l’ADN. L’amorçage prend environ 20 minutes à compléter.
   7. Assurez-vous que le bon programme d’enrichissement (2.0 Kit Enrichment) est sélectionné et que toutes les connexions et emplacements des glissières des tubes sont correctement sécurisés avant de commencer la sortie. Évitez d’introduire des bulles d’air lors du chargement de l’échantillon, car cela peut affecter la régularité du flux et l’efficacité de la capture.
   8. Distribuez doucement l’échantillon de modèle préparé à l’étape 1.2.3 (Échantillon CTC Modèle/Préparation clinique de l’échantillon) dans l’entonnoir d’entrée et poursuivez le protocole d’enrichissement en appuyant sur « Reprendre » à l’écran système.
   9. Lorsque la capture CTC est terminée, le système d’isolation semi-automatisé des cellules demande à l’utilisateur de retirer le bocal à déchets et de rattacher le réservoir d’amorcement.
   10. Détachez le tube du système Genesis du bocal à déchets et pipetez 4 mL de tampon de dilution dans le réservoir d’amorçage.
   11. Fixez l’adaptateur de reflux au réservoir d’amorçage et rebranchez-le au tube du système Genesis. Appuyez sur Reprendre à l’écran pour poursuivre le protocole d’enrichissement. Cela libère les cellules capturées dans la lame microfluidique vers l’entonnoir d’entrée en appliquant un reflux.
   12. Collectez les cellules récupérées en pipettant depuis l’entonnoir d’entrée vers un tube Eppendorf de 5,0 mL. Assurez-vous de collecter tous les échantillons aqueux de l’entonnoir d’entrée, qui peuvent souvent dépasser 4 mL.
   13. Centrifugez l’échantillon récupéré à 600 g pendant 5 minutes pour pelleter les cellules capturées avant la lyse cellulaire.
   14. Retirez soigneusement le surnageant et procédez au protocole d’extraction d’ADN (Section 1.4).
4. Extraction d’ADN
   Attention : Le BD à DNAzol est nocif s’il entre en contact avec la peau ou est ingéré. Évitez le contact avec la peau et les yeux. Utilisez uniquement dans un environnement de hotte chimique et ne respirez pas de brume, de vapeur ou de spray. En cas de contact avec la peau, lavez-le immédiatement avec de l’eau.
   1. Ajoutez 1 mL de BD de DNAzol directement dans le tube à partir de l’étape 1.3.14.
   2. Transférez tout le volume de l’échantillon dans un nouveau tube de microcentrifuge Eppendorf DNA LoBind de 1,5 mL et secouez vigoureusement.
   3. Incubez le tube à température ambiante pendant 5 minutes. Faites un vortex vigoureux sur le tube et étouffez à température ambiante pendant au moins 4 minutes.
   4. Assurez-vous de mélanger complètement pendant les phases de lyse et de précipitation afin de maximiser la récupération de l’ADN. Un traitement optionnel par RNase peut être inclus si la contamination à l’ARN est un problème.
   5. Ajoutez 400 μL d’isopropanol directement au mélange d’échantillon de lysat de cellules BD en DNAzol.
   6. Centrifugez le tube à 10 000 g pendant 6 minutes pour précipiter l’ADN.
   7. Après centrifugation, retirez le surnageant et ajoutez doucement 0,5 mL de BD de DNAzol à l’ADN en pellet.
   8. Faites passer le tube en vortex jusqu’à ce que la pellete d’ADN soit complètement dispersée.
   9. Centrifugez le mélange à 10 000 g pendant 5 minutes.
   10. Retirez le surnageant et lavez la pastille d’ADN en pipettant 1 mL d’éthanol à 75 %.
   11. Répétez les étapes 9 à 10 pour un total de deux lavages.
   12. Retirez tout éthanol résiduel au fond du tube à l’aide d’une micropipette.
       REMARQUE : Assurez-vous que le pellet ne devienne pas complètement sec.
   13. Ajoutez 20 μL d’eau déionisée (DI) sans DNase-/RNase pour solubiliser l’ADN des échantillons CTC.
   14. Quantifiez l’ADN double brin (dsDNA) dans l’échantillon à l’aide de kits ou plateformes de quantification dsDNA, tels que le Qubit 1x dsDNA High Sensitivity Assay Kit ou le Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis.
   15. Conservez les échantillons d’ADN extraits à 4 °C ou -20 °C pour éviter la dégradation.
       Point de pause : Les échantillons d’ADN extraits peuvent être stockés à -20 °C pour un stockage à court terme ou à -80 °C pour un stockage à long terme avant de passer aux analyses en aval.

2. Analyse des mutations EGFR utilisant ddPCR

La PCR numérique est une méthode adaptée pour détecter des mutations rares avec une grande sensibilité et une grande précision. Les tests de détection de mutations ddPCR fournis dans un seul tube incluent généralement une sonde marquée FAM ciblant un allèle mutant et une seconde sonde marquée HEX ciblant un allèle de type sauvage.

1. Mise en place de la réaction et génération de gouttelettes
   1. Dégel ddPCR Supermix, ddPCR Détection de mutations Tests sur glace.
   2. Manipulez chaque tube pour garantir que le contenu est homogène, car un gradient de concentration peut se former lors du stockage à -20 °C.
   3. Centrifugez brièvement jusqu’au contenu sédimentaire au fond du tube et placez le tube sur la glace.
   4. Préparez les échantillons d’ADN extraits à la concentration souhaitée avant de préparer le mélange de réaction selon la recette du Tableau 1.
   5. Préparez un prémix contenant le super-mélange, les tests et les enzymes de restriction, ainsi que de l’eau pour tous les échantillons nécessaires à l’analyse, et ajoutez l’ADN individuel comme dernier composant de réaction. Assurez-vous que la concentration finale des échantillons d’ADN soit de 50 fg–100 ng.
      Note : La fragmentation de l’ADN par digestion par restriction avant la génération de gouttelettes est recommandée afin d’améliorer la précision, de réduire la viscosité et d’améliorer l’accessibilité du gabarit. Une digestion directe à l’aide de 2 à 5 U d’enzyme de restriction lors de la mise en place de la ddPCR est recommandée. Pour les tests de mutation ponctuelle EGFR (T790M/L858R), MseI est recommandé ; Consultez les fiches techniques du test pour les enzymes compatibles avant la personnalisation. Les fiches techniques sont disponibles en téléchargement pour chaque essai sur le portail des tests numériques Bio-Rad (Bio-Rad Droplet Digital PCR Assays | Accueil)
   6. Préparez un contrôle négatif pour au moins un puits, ne contenant que du modèle sauvage à une concentration similaire à celle des échantillons inconnus.
   7. Faites un vortex sur les tubes de réaction pour les mélanger soigneusement et centrifugez brièvement pour sédimenter tous les échantillons au fond de chaque tube de réaction. Laissez les tubes de réaction s’équilibrer à température ambiante pendant 2 minutes.
   8. Chargez 20 μL de chaque mélange de réaction dans un puits d’échantillon d’une cartouche microfluidique (cartouche DG8), suivi de 75 μL de pétrole de génération de gouttelettes pour les sondes dans les puits de pétrole.
   9. Couvrez la cartouche avec un joint et placez-la dans le générateur de gouttelettes QX200.
   10. Appuyez sur le bouton en haut du Générateur de gouttelettes pour fermer le couvercle. Lorsque le couvercle est fermé, la génération de gouttelettes commence automatiquement. Cette procédure combine les échantillons et l’huile dans les microcanaux de la cartouche microfluidique pour créer une émulsion de ~20 000 gouttelettes de la taille d’un nanolitre par échantillon.
2. Amplification PCR (conditions de cycle thermique)
   1. Programmer les conditions de cycle thermique sur un thermocycleur comme recommandé dans le Tableau 2
   2. Lorsque la génération de gouttelettes est terminée, toutes les lumières de l’instrument sont vert fixe. Ouvrez l’instrument en appuyant à nouveau sur le bouton du Générateur de gouttelettes et retirez le porte-cartouche et la cartouche.
   3. Retirez le joint jetable et aspirez 45 μL de gouttelettes de la cartouche, en veillant à un léger angle sur la pointe de la pipette pour éviter la déchiquetage des gouttelettes.
   4. Distribuez les gouttelettes dans les plaques ddPCR à 96 puits et scellez la plaque avec un joint thermique PCR à l’aide du scellant de plaques PCR PX1.
   5. Après avoir scellé la plaque à 96 puits contenant les gouttelettes, transférez soigneusement la plaque à 96 puits vers le cycleur thermique préparé à l’étape 2.2.1 et commencez le cycle thermique.
3. Affichage des gouttelettes et analyse des données
   1. Démarrez l’instrument lecteur de gouttelettes ddPCR (lecteur de gouttelettes QX200 ou lecteur de gouttelettes QX600) ainsi qu’un ordinateur connecté sur lequel le logiciel gestionnaire QX est installé et configuré.
   2. Une fois l’étape de cycle thermique terminée, déplacez la plaque scellée à 96 puits vers un instrument lecteur de gouttelettes.
   3. Open QX Manager Software pour configurer une nouvelle disposition de plaques basée sur une conception expérimentale. Cliquez sur l’onglet « Ajouter une plaque » et le logiciel activera le bouton Configurer la plaque. Cliquez sur « Configurer la plaque » pour assigner les détails de l’échantillon à la plaque.
   4. Remplissez les détails de la plaque et des informations du puits, sélectionnez les puits, désignez l’état de l’échantillon, le type d’expérience, le nom ou les noms de la cible, le type de cible, et référence : ch1 pour la FAM et ch2 pour la couleur HEX.
   5. Cliquez sur « Appliquer » pour charger le puits et, une fois terminé, sélectionnez « OK ».
   6. Lorsque la disposition des plaques est terminée pour tous les échantillons, sélectionnez « Run » pour commencer le processus de lecture des gouttelettes.
   7. Lors de la collecte des données, sélectionnez les échantillons dans le sélecteur de puits sous « Analyser » et fixez le seuil approprié pour le test de détection de mutations ddPCR afin de distinguer les signaux mutants des signaux de type sauvage.
   8. Pour les tests de mutation duplex comme ceux utilisés dans ce protocole, les seuils peuvent être automatiquement fixés en utilisant les paramètres par défaut du logiciel QX Manager (voir la figure dans les résultats).
   9. Sinon, les seuils peuvent être fixés manuellement à l’aide des méthodes des réticules ou des lassos, garantissant que les seuils ou les frontières de lasso séparent les groupes positifs et négatifs et sont positionnés selon les positions des groupes définies par les contrôles positifs et négatifs inclus dans chaque exécution.
      REMARQUE : Les seuils doivent être fixés de manière constante entre les échantillons d’un lot en utilisant des contrôles positifs et négatifs afin d’assurer un appel de mutation reproductible.
   10. La concentration rapportée correspond aux nombres de copies par μL de la réaction finale 1x ddPCR.

Résultats

Le système d’isolation cellulaire Genesis avec des lames de capture cellulaire microfluidiques a isolé en moyenne 84 % des cellules cancéreuses à pics dans des échantillons sanguins à une concentration de 25–250 cellules·^mL-1 (Figure 3A). Cette grande efficacité de capture démontre l’efficacité de l’étape d’enrichissement pour isoler des cellules tumorales circulantes rares à partir d’échantillons sanguins globaux. L’immunocoloration optionnelle des cellules capturées dans des lames de capture cellulaire microfluidique utilisant le protocole d’énumération du système a démontré l’identification des cellules rares à l’aide de deux anticorps positifs contre la cytokératine, DAPI, pour identifier les cellules nucléées et un anticorps négatif contre CD45, exprimé sur la plupart des globules blancs mais généralement non exprimé sur les CTC (Figure 3B). Ce schéma de coloration confirme l’identification réussie des cellules tumorales circulantes tout en excluant les globules blancs de fond.

Les tests de détection de mutations ddPCR ont permis l’identification et le profilage des mutations EGFR dans des cellules cancéreuses enrichies. Cette étude a démontré la détection de mutations de l’ADNg dans les cellules, initialement enrichies par la plateforme Genesis, à l’aide de tests ddPCR et de détection de mutations. Les graphiques ddPCR (Figure 4) des lignées de cellules cancéreuses A549 (type sauvage EGFR) et H1975 (L858R/T790M) pour les deux mutations EGFR testées ont montré que ddPCR peut détecter sensiblement les mutations présentes dans la lignée cellulaire H1975 après avoir atteint le sang total et un enrichissement subséquent via la plateforme Genesis. Des signaux de mutation positifs ont été observés dans les cellules H1975, tandis qu’aucun signe de mutation n’a été détecté dans les cellules A549, confirmant la spécificité du test. Les échantillons injectés avec la lignée cellulaire témoin A549 ne présentaient aucune mutation, de gouttelettes confirmant que la détection de mutations à L858R et T790M est spécifiquement associée à la lignée cellulaire H1975. Cette démonstration de l’isolation CTC sur la plateforme Genesis, suivie d’une analyse moléculaire utilisant ddPCR, peut offrir un outil diagnostique moléculaire puissant pour les biopsies liquides et les études précliniques utilisant des échantillons cliniques pour surveiller la progression de la maladie et un traitement personnalisé. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le flux de travail combiné enrichissement et ddPCR peut détecter et quantifier de manière fiable les mutations de l’EGFR dans les cellules tumorales circulantes.

Figure 1 : Flux de travail de biopsie liquide pour le profilage des mutations de l’ADN de l’EGFR dans le cancer du poumon. (A) Illustration de l’hétérogénéité tumorale montrant différents profils de mutations de l’EGFR détectés par biopsie tissulaire conventionnelle et cellules tumorales circulantes (CTC) à partir de biopsies liquides. (B) Flux de travail schématique pour le profilage des mutations de l’ADN de l’EGFR dans les cellules tumorales circulantes à l’aide de biopsies liquides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Démonstration du profilage des mutations ADN de l’EGFR à l’aide d’échantillons artificiels. (A) Préparation d’un échantillon modèle de CTC en injectant des lignées cellulaires de cancer du poumon avec un statut défini de mutation EGFR dans le sang total d’un donneur sain. (B) Flux de travail illustrant la détection des mutations de l’ADN de l’EGFR dans les cellules tumorales circulantes à l’aide de plateformes commerciales. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Isolement sans marquage et identification des cellules tumorales circulantes. (A) Efficacité de capture des lignées cellulaires de cancer du poumon (A549 et H1975) injectées dans des échantillons de sang total provenant de donneurs sains à l’aide d’une plateforme semi-automatisée d’isolation de cellules rares. (B) Immunocoloration des cellules capturées montrant des cellules tumorales positives à la cytokératine. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4. Profilage des mutations EGFR utilisant la PCR numérique à base de gouttelettes. Graphiques d’amplitude bidimensionnelles montrant la détection de mutations de l’EGFR dans les cellules cancéreuses enrichies après la lyse cellulaire et l’extraction d’ADN. Les cellules A549 (type sauvage) présentent l’absence de signaux spécifiques à la mutation, tandis que les cellules H1975 présentent des signaux positifs pour les mutations EGFR L858R et T790M. Le test permet une détection et une quantification sensibles des populations d’ADN mutants et sauvages. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Composant	Volume par réaction (μl)	Concentration finale
2x ddPCR Supermix pour sondes (pas de dUTP)	10	1x
Amorces/sondes 20x cibles (FAM) et wild-type (HEX)	1	1x
Enzyme de restriction diluée (Msel)	1	2-5 U/reaction
Échantillon cible et/ou eau sans DNase (NTA)	Variable	Variable
Volume total	20	-

Tableau 1 : Configuration de la réaction pour la détection de mutations PCR numériques par gouttelettes. Composition et concentrations finales des réactifs utilisés pour détecter des mutations rares de l’EGFR dans des échantillons d’ADN dérivés des cellules cancéreuses.

Étape du cycle thermique*	Température	Temps	Taux de rampe	Nombre de cycles
	(ºC)		(ºC/sec)
Activation enzymatique	95	10 min	2	1
Dénaturation	94	30 secondes	2	40
Recuissage/extension	55	1 min	2	40
Désactivation enzymatique	98	10 min	2	1
Refroidissement	4	30 min	2	1
Maintien (optionnel)	4	∞ (infini)	1	1
Utilisez un couvercle chauffant réglé à 105ºC et réglez le volume de l’échantillon à 40μl pour le C1000 Touch Thermal Cycler avec un module de réaction de puits de 96 profondeurs.

Tableau 2 : Conditions de cycle thermique pour l’amplification PCR numérique. Paramètres de cycle thermique utilisés pour l’amplification des cibles de mutations de l’EGFR à l’aide d’un recycleur thermique avec un module de réaction à 96 puits.

Discussion

La présence de cellules tumorales circulantes dans le sang de patients atteints de tumeurs solides fait l’objet d’études depuis plus de 60 ans^et a été reconnue comme une biopsie liquide primaire avant leur première inclusion dans le terme collectif en 2010^. Cependant, les CTC sont rares et difficiles à isoler sélectivement du sang^{total 9}. Il existe cependant de nombreuses méthodes pour capturer et enrichir les CTC, comme l’illustrent les revues^{suivantes 10,11}, couvrant les approches physiques/microfluidiques ainsi que les méthodes de sélection des marqueurs de surface cellulaire. Beaucoup de ces méthodes sont chronophages, laborieuses et impliquent souvent plusieurs étapes ou systèmes pour atteindre la sélectivité requise.

La capture des CTC dans le sang total dans ce protocole dépend de leur taille (> 8 μm) et de l’absence de déformation au fond des globules rouges et blancs phénotypiquement normaux qui traversent les pores microfluidiques à l’intérieur des lames de capture cellulaire microfluidique. Par conséquent, un chargement correct de l’échantillon, un amorçage approprié de la culasse et la prévention des bouchons sont des étapes cruciales pour maintenir l’efficacité de la capture et la récupération de l’échantillon.

Pour que le flux de travail soit efficace, la gestion des échantillons sanguins est le facteur clé ; veiller à ce que le sang frais soit utilisé pour le traitement des échantillons et maintenir les conditions de transport et de stockage appropriées pour prévenir l’hémolyse. La dégradation des globules rouges ou des globules blancs impactera respectivement la qualité de la capture du CTC et la sensibilité de détection de tout variant génomique rare. Si une hémolyse, une coagulation ou une dégradation visible de l’échantillon sont observées, l’échantillon ne doit pas être traité, car ces conditions peuvent réduire la récupération du CTC et la sensibilité à la détection des mutations en aval.

Puisque les CTC peuvent être présentes à des niveaux inférieurs à 1 CTC pour 10 millions de globules blancs dans le sang total, il est essentiel de capturer le volume le plus grand possible pour l’enrichissement. Les lames de capture cellulaire microfluidiques peuvent contenir 10 mL de sang en ligne avec les tubes de capture standard tels que Streck et EDTA, qui contiennent généralement ~7,5 à 10 mL de sang. Une réduction du volume sanguin collecté aura un impact direct sur la sensibilité à la capture du CTC et la détection ultérieure des variantes génomiques. Obtenir des volumes au-delà de cette routine auprès des patients en traitement peut être un défi tant cliniquement qu’éthiquement. Au-delà de l’augmentation du volume de plus de 10 ml ou l’utilisation d’échantillons de leucaphérèse diagnostique pour augmenter les populations de globules blancs/^{CTC 12}, augmenter la sensibilité avec des volumes plus importants dépasse actuellement le champ d’application de la plateforme Genesis.

Le protocole a été exécuté conformément à la procédure standard de procédure opérationnelle standard mais avec des soins, un mélange complet de l’EDTA avec le sang lors de la prélèvement et un stockage soigneux du sang prélevé avant utilisation, illustrant le potentiel de ce protocole à être utilisé dans un cadre clinique où les procédures opérationnelles standard de routine sont valorisées. Cependant, comme ce protocole a été démontré à partir d’échantillons artificiels, une validation avec des échantillons cliniques de patients est nécessaire avant une mise en œuvre clinique de routine.

La sensibilité à la détection des mutations au sein d’une population CTC dépend à la fois de la présence de CTC dans un échantillon sanguin total standard et de la détection ultérieure de mutations somatiques au sein de cette population CTC, ce qui dépend de la fréquence de la mutation dans la sous-population CTC. Ces deux facteurs de confusion limiteront finalement la sensibilité globale à la détection des mutations dans une population capturée de CTC ; ayant un impact plus important sur les échantillons de détection précoce, comparativement aux échantillons de stade avancé qui sont susceptibles d’avoir des taux de CTC plus élevés et des populations de CTC porteuses de mutations plus élevées.

Les études actuelles de biopsie liquide à base sanguine sont fortement biaisées en faveur de l’ADN tumoral circulant présent dans le plasma comme indication de la présence tumorale. En général, la détection de l’ADN ct se fait sur la présence de marqueurs génomiques spécifiques à la tumeur, par exemple les SNVs, variants structurels, MSI-H, TMB et CGP. Les CTC, en tant que biomarqueur moins utilisé mais tout aussi viable dans la biopsie liquide, sont connus pour se détacher dans la circulation sanguine à partir de tumeurs en croissance et potentiellement^{métastasées.} L’analyse des CTC se concentre principalement sur les marqueurs de surface cellulaire utilisés pour leur capture ou pour la validation post-capture, en utilisant des panneaux d’anticorps établis ou personnalisés, par exemple pan-cytokératine, vimentine,-L1, EpCAM, etc. En revanche, l’analyse moléculaire des CTC est limitée en adoption en raison des difficultés liées à l’enrichissement sélectif et à la capture des CTC dans le sang total, suivies d’une analyse précise de la sous-population des CTC. La méthode actuelle utilise un flux de travail standardisé intégrant des protocoles établis pour la capture CTC suivis d’une analyse moléculaire utilisant ddPCR avec des tests standards pour des mutations génomiques connues et pathologiquement pertinentes dans des échantillons de sang total artificiels. Cette approche est importante car elle permet un profilage des mutations directement à partir de CTC enrichis, complétant les approches de biopsie liquide basées sur l’ADNct plasmatique.

En utilisant l’approche actuelle, les CTC rares capturés peuvent être étudiés à la fois pour leur présence dans le sang total et pour la présence de marqueurs génomiques pathologiquement pertinents dans la population de CTC. Des études ont démontré la valeur d’évaluer à la fois le profil ctDNA des patients atteints de cancer et le réservoir CTC circulant en parallèle au ctDNA¹³, l’évaluation des deux sources de mutations élargissant le paysage moléculaire global des patients individuels. Cela a le potentiel de développer des paradigmes de tests pathologiques dans le cadre de la recherche translationnelle d’abord, mais finalement en milieu clinique. Le nouveau paradigme intégrerait à la fois la présence de CTC comme indication de la présence/progression du cancer et des mutations pathologiques présentes dans les cellules capturées par CTC, pouvant indiquer une expansion clonale ou une résistance^{thérapeutique 14}. L’implication de cela est que le développement de métastases et d’expansion clonale, suivi d’une résistance aux médicaments ultérieure, pourrait être surveillé simultanément au niveau CTDNA et CTC, impactant directement le choix du traitement en phase avancée du cancer.

Les applications futures pourraient inclure l’adaptation de ce flux de travail à d’autres mutations associées au cancer et le test de ses performances sur des échantillons cliniques longitudinaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Genesis Cell Isolation System	Bio-Rad Laboratories	12019822	Instrument (Désigné comme "Système d'isolement cellulaire semi-automatique")
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864002	Instrument
QX200 Droplet Reader ou QX600 Droplet Reader	Bio-Rad Laboratories	1864003 ou 12013328	Instrument (Désigné comme "Instrument Droplet Reader")
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad Laboratories	1814000	Instrument
C1000 Touch Thermal Cycler avec module de réaction 96–Deep Well	Bio-Rad Laboratories	1851197	Instrument
Qubit 4 Fluorometer	Thermo Fisher Scientific Inc.	Q33226	Instrument
Celselect Slides			Consommable (Désigné comme Microfluidic Cell Capture Slides)
Celselect Slides Enrichment Kit 2.0	Bio-Rad Laboratories	17009455	Consommable
DNAzol BD	Molecular Research Center, Inc.	DN129	Réactif
MseI restriction enzyme	New England Biolabs	R0525S	Réactif
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR T790M	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010019	Assay
ddPCR Mutation Detection Assay: EGFR L858R	Bio-Rad Laboratories	Assay ID dHsaMDV2010021	Assay
Qubit 1X dsDNA High Sensitivity Assay Kit	Invitrogen	Q33230	Kit d'essai
DG8 Cartridges pour QX200 Droplet Generator	Bio-Rad Laboratories	1864008	Consommable
Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1863005	Consommable
Automated Droplet Generation Oil for Probes	Bio-Rad Laboratories	1864110	Consommable (optionnel)
ddPCR Supermix for Probes (No dUTP)	Bio-Rad Laboratories	1863023	Réactif
PCR Plate Heat Seal	Bio-Rad Laboratories	1814040	Foule perforée
DNA LoBind Microcentrifuge Tube, 1.5 ml	Eppendorf	022431021	Consommable
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad Laboratories	12001925	Consommable