Method Article

Méthode de co-culture tridimensionnelle pour l’étude des interactions indirectes entre différents types cellulaires à travers une membrane basale reconstituée

DOI:

10.3791/70027

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April 17th, 2026

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1Department of Biochemistry, Memorial University of Newfoundland, 2Beatrice Hunter Cancer Research Institute, 3Grupo Multidisciplinar de Oncología Traslacional & University Research Institute for Health Sciences (IUNICS), Health Research Institute of the Balearic Islands (IdISBa) & University of the Balearic Islands, 4Ciber Fisiopatología Obesidad y Nutrición (CB06/03), Instituto Salud Carlos III, 5Department of Biomedical Sciences, Ontario Veterinary College, University of Guelph

In This Article

Summary

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Cet article détaille une méthode simple pour la co-culture tridimensionnelle de deux types cellulaires séparés par une membrane basale reconstituée, qui nécessite peu d’équipements spécialisés et peut être facilement analysée par diverses techniques expérimentales.

Abstract

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La co-culture tridimensionnelle (3D) est une technique en évolution rapide pour les chercheurs cherchant à étudier avec précision les interactions cellulaires à l’aide d’expériences in vitro . Les limites de la culture cellulaire monocouche, notamment les interactions limitées entre l’environnement cellulaire et extracellulaire et la morphologie cellulaire perturbée, sont abordées en simulant l’environnement cellulaire in vivo . En utilisant un échafaudage pour fournir un support structurel et en incluant des composants de matrice extracellulaire biologiquement actifs, les cultures 3D présentent des comportements et morphologies plus cohérents avec les tissus. L’intégration de plusieurs types cellulaires dans ce type d’environnement 3D permet d’étudier les interactions cellulaire au sein d’un système modèle biomimétique. Une large gamme de technologies de co-culture 3D a émergé, chacune avec ses propres avantages et défis. Souvent, ces technologies nécessitent un équipement spécialisé, une installation complexe ou des connaissances techniques spécifiques. De plus, il existe quelques méthodes standardisées pour étudier les interactions indirectes entre cellules entre deux types cellulaires séparés par une membrane basale reconstituée. Ici, nous décrivons une méthode de co-culture 3D qui ne requiert que des compétences techniques fondamentales et utilise des matériaux plus largement applicables pour récapituler avec succès les interactions indirectes cellule-cellule à travers une membrane basale. Une monocouche de cellules est recouverte d’une couche de matrice extracellulaire, sous forme de Matrigel, et un second type cellulaire est ensemencé par-dessus. La co-culture résultante est maintenue pendant cinq jours, moment où les cellules sont analysées pour détecter des changements morphologiques par immunofluorescence ou extraites de la co-culture pour des analyses génomiques, transcriptomiques ou protéomiques plus détaillées. Ce protocole est idéal pour étudier l’impact de la communication cellule-cellule sur le comportement cellulaire lorsque le contact physique est interdit par une membrane basale. Alors que les chercheurs continuent d’opter pour des méthodes de culture cellulaire plus pertinentes in vivo , une approche simplifiée est nécessaire pour éviter de fortes barrières à l’entrée.

Introduction

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La culture cellulaire in vitro est une technique de recherche robuste, rapide et largement utilisée. Bien que les méthodes traditionnelles de culture cellulaire soient puissantes, elles diffèrent grandement d’un environnement in vivo. La nature spatialement restreinte de la culture cellulaire monocouche entraîne des changements dans l’expression génique, la morphologie et labiochimie 1,2,3. Les techniques de culture tridimensionnelle (3D) traitent cette disparité, car les cellules sont développées dans un échafaudage qui simule la matrice extracellulaire (CLE) présente dans les organes et tissus. En culture 3D, les cellules présentent une morphologie et un comportement plus proches de ceux observés invivo 4,5 Cependant, la culture 3D seule ne récapitule pas entièrement les nombreux composants d’un microenvironnement in vivo car elle manque d’apports d’autres typescellulaires 6.

Les interactions directes (contact entre cellules) et indirectes entre cellules jouent un rôle majeur dans le comportement des cellules in vivo 7,8. La récapitulation de ces interactions nécessite des modèles de co-culture 3D, où plusieurs types cellulaires sont cultivés ensemble dans un environnement 3D. Grâce à ces techniques, un environnement de croissance de type in vivo peut être établi in vitro, améliorant la pertinence biologique desrésultats 9,10. Cependant, plus l’environnement requis pour une expérience particulière est spécifique, plus la méthodologie devient complexe. Il manque un système modèle standardisé pouvant être utilisé pour étudier les interactions cellulaire-cellule entre cellules séparées par une matrice membranaire basale. Ainsi, ce protocole a été conçu pour simuler les interactions cellule-cellule qui se produisent à travers une matrice membranaire basale de manière robuste et reproductible. Adaptée d’un modèle de culture3D 11 déjà établi, la technique utilise une couche de Matrigel, désormais appelée gel ECM, pour séparer physiquement deux types cellulaires différents en culture tout en laissant passer les facteurs sécrétés. Il a été initialement conçu pour étudier l’impact indirect des adipocytes sur les cellules du cancer du sein mésenchymateux, mais peut facilement être modifié pour accueillir une variété de types cellulaires. Il convient de réfléchir attentivement à la pertinence de cette méthode pour un projet expérimental donné. Cette méthode ne permet pas d’interagir directement cellule-cellule et devrait donc se limiter à la modélisation de scénarios in vivo impliquant une communication indirecte entre cellules à travers une matrice membranaire basale. Par exemple, ce système ne serait pas idéal pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T cytotoxiques et les cellules tumorales, car elles interagissent couramment directement. Considérons plutôt des scénarios biologiques où une membrane basale sépare naturellement les deux types cellulaires d’intérêt. Par exemple, cette méthode pourrait être appliquée à l’étude des interactions entre les cellules tumorales et les cellules endothéliales vasculaires avant l’intravasation.

Une méthode courante de co-culture 3D alternative consiste à utiliser des puces microfluidiques spécialisées, ou « organ-on-a-chip (OoC) ». Les systèmes OoC sont puissants et peuvent être adaptés à des expériences individuelles, mais nécessitent un temps et des ressources importants consacrés à la conception des puces, au choix des matériaux, aux équipements périphériques, à l’optimisation et à la collectede données 12,13. De plus, il n’existe actuellement aucun matériau ou méthode standard capable de fournir les indices biologiques et physiques de la matrice membranaire du socle sans interférer avec l’écoulementmicrofluidique 14. Ainsi, appliquer la technologie OoC à l’étude des interactions cellulaire à travers la membrane basale présente d’autres défis. La méthode décrite dans ce protocole vise à offrir une alternative standardisée qui maintient la pertinence biologique et l’accessibilité.

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Protocol

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Ce protocole (Figure 1A) décrit un système de co-culture 3D conçu pour récapituler les interactions cellule-cellule à travers une matrice membranaire basale. L’analyse en aval est possible par microscopie confocale (Figure 1B) ou en prélèvant des cellules au sein de la co-culture (Figure 1C). En utilisant une construction « sandwich », où une couche de gel ECM est prise en sandwich entre deux populations cellulaires, le protocole ne nécessite pas d’appareil spécialisé et peut être réalisé avec des connaissances fondamentales des techniques modernes de culture cellulaire.

1. 3D Préparation à la co-culture

REMARQUE : Le protocole décrit est destiné à être une application représentative de la méthode de co-culture 3D utilisant les adipocytes 3T3-L1 et les cellules MDA-MB-231 du cancer du sein. L’utilisation de différents types cellulaires nécessitera une optimisation de la densité d’ensemencement cellulaire et des prétests des lots de gel ECM pour garantir leur efficacité. Ce protocole aborde l’utilisation d’un contrôle sans adipocytes et d’un contrôle conditionné des supports. Plus de contrôles peuvent être nécessaires selon l’objectif expérimental.

  1. Culture cellulaire et préparation de la solution
    1. Acquérir et établir des cultures de lignées cellulaires de pré-adipocytes 3T3-L1 et MDA-MB-231 de cancer du sein. Cultiver et maintenir indépendamment toutes les cellules en utilisant une technique aseptique dans une armoire de sécurité biologique de classe II et des méthodes standard de culture cellulaireadhérente 15. Maintenir des cellules 3T3-L1 dans le milieu modifié pour aigles (DMEM) de Dulbecco, complétés avec 10 % (v/v) de sérum pour veaux nouveau-nés (NBCS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (10 000 U/mL). Maintenir les cellules MDA-MB-231 dans le RPMI 1640 complétées avec 10 % de sérum bovin fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptycine (10 000 U/mL).
      REMARQUE : Ne jamais permettre aux cellules 3T3-L1 de dépasser 80 % de confluence pendant l’entretien, et n’utilisez pas de cultures au-delà du20e passage de la cellule.
    2. Acquérir ou préparer une solution d’origine de 1x solution séline tamponnée phosphate (PBS) avec 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na2HPO 4, 1,8 mM deKH 2PO4, pH 7,4.
    3. Préparez 50 mL de solution de lavage PBS-glycine en ajoutant 0,375 g de glycine à 50 mL de PBS pour une concentration finale de glycine de 100 mM. Conserver la solution à 4 °C pendant jusqu’à 12 mois.
    4. Préparez 10 mL de tampon de perméabilisation en ajoutant 50 μL de Triton X-100 à 9,5 mL de PBS. Remplissez jusqu’à 10 mL pour une concentration finale de 0,5 % (v/v) de Triton X-100. Conserver à 4 °C et consommer dans un mois.
    5. Préparez 50 mL de tampon d’immunofluorescence (FI) en ajoutant 50 μg d’albumine sérique bovine (BSA), 100 μL de Triton X-100, et 25 μL de Tween-20 à 45 mL de PBS. Remplir jusqu’à 50 mL pour une concentration finale de 0,1 % (v/v) BSA, 0,2 % (v/v) Triton X-100, et 0,05 % (v/v) Tween-20. Conserver à 4 °C et consommer dans un mois.
    6. Préparez 10 mL de tampon de blocage en ajoutant 1 mL de sérum animal à 9 mL de tampon FI pour une concentration finale de 10 % de sérum. Conserver à 4 °C et consommer dans un mois.
      REMARQUE : L’identité de l’espèce du sérum dépend de l’espèce hôte des anticorps fluorescents secondaires utilisés (voir 2.2.4).
    7. Décongelez le gel ECM (concentration totale de protéines ~9-9,5 mg/mL) à 4 °C pendant la nuit. Préparez des aliquotes de 500 μL dans des tubes micro-centrifuge de 1,5 mL et conservez à -20 °C.
      REMARQUE : Le gel ECM est très variable et doit être vérifié pour induire le comportement attendu dans chaque type cellulaire. Différents types cellulaires peuvent nécessiter différentes concentrations de protéines ou une rigidité de la matrice.
      REMARQUE : Utilisez toujours des pointes et des contenants de pipette pré-refroidis lors de la manipulation du gel ECM pour éviter la polymérisation à température ambiante. Gardez toujours le gel ECM sur glace pendant la manipulation.
  2. Différenciation des adipocytes
    1. Semez 50 000 à 80 000 pré-adipocytes 3T3-L1 dans 0,5 mL de milieu de croissance standard dans 2 puits d’une lame à chambre à 4 puits. Les puits vides seront utilisés pour le contrôle sans adipocytes et les milieux conditionnés.
      REMARQUE : Les cultures cellulaires à lames de chambre sont sujettes à des perturbations mécaniques. Évitez l’aspiration sous vide du milieu et utilisez une technique de pipetage douce avec des pipettes manuelles.
    2. Semez 50 000 à 80 000 pré-adipocytes 3T3-L1 dans 0,5 mL de milieu de croissance standard dans un puits unique d’une plaque de culture tissulaire à 24 puits. Cela sera utilisé pour collecter des milieux conditionnés pour le contrôle du milieu conditionné.
    3. Laissez les deux cultures atteindre une confluence de 100 % sur 24 heures.
    4. Initier l’adipogenèse en remplaçant le milieu de croissance par un milieu d’initiation d’adipogenèse, composé de DMEM complété par 10 % de FBS, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX) et 1 μM de dexaméthasone. Incubez les cellules pendant 48 heures à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO-2 .
    5. Après 48 heures, remplacer le milieu épuisé par un nouveau milieu de progression de l’adipogenèse, composé de DMEM avec 10 % de FBS et 10 μg/mL d’insuline. Incubez les cellules pendant encore 48 heures à 37 °C dans un incubateur à 5 % deCO-2 .
    6. Avant de poursuivre la co-culture 3D, confirmez visuellement la présence de gouttelettes lipidiques dans >60 % des cellules. Si l’accumulation de gouttelettes lipidiques est lente, remplacer le milieu de progression par du DMEM complété par un FBS de 10 % et surveiller la teneur lipidique toutes les 24 heures.
  3. Superposition et maintien de la co-culture 3D
    1. Décongelez le gel ECM à 4 °C pendant la nuit avant de poursuivre avec la superposition.
      REMARQUE : Pour éviter les effets de variabilité d’un lot à l’autre, il est recommandé d’utiliser le même lot de gel ECM pour toutes les expériences au sein d’une même étude.
    2. Après une différenciation réussie des 3T3-L1, retirez les milieux de culture usés, laissant un petit tampon de ~50 μL de milieu.
    3. Ajoutez soigneusement 110 μL de gel ECM à chaque puits contenant des adipocytes de la lame de la chambre, en veillant à ne pas perturber la monocouche d’adipocytes.
      REMARQUE : Le gel ECM se solidifie rapidement à température ambiante. Pour éviter une polymérisation prématurée de la matrice, gardez toujours le gel ECM sur la glace et utilisez des embouts pré-refroidis à -20°C.
    4. Ajoutez 110 μL de gel ECM dans le puits de contrôle vide sans adipocytes. Pour assurer une répartition uniforme de Matrigel, ajoutez des gouttes dans les coins du puits et au milieu du puits. Utilisez la pointe de la pipette pour étaler doucement le Matrigel sur la surface de culture sans gratter.
    5. Incubez la lame pendant 1 heure à 37 °C pour permettre au gel ECM de polymériser.
    6. Pendant cette étape d’incubation, collectez et comptez les cellules MDA-MB-231
      OPTIONNEL : Voir l’étape 1.4 pour les détails sur le marquage fluorescent de ces cellules.
    7. Préparez une suspension diluée de cellules MDA-MB-231 à 30 000 cellules/mL dans un milieu de croissance mammaire contenant un gel ECM (v/v) à 2 %.
      REMARQUE : La densité optimale d’ensemencement des cellules varie selon les types cellulaires et doit être optimisée avant l’expérimentation. REMARQUE : Le milieu de croissance mammaire est un milieu de culture cellulaire disponible dans le commerce, optimisé pour les cellules épithéliales mammaires. Elle contient 0,4 % d’extrait hypophysaire bovin, 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique (humain recombinant), 5 μg/mL d’insuline (humaine recombinante) et 0,5 μg/mL d’hydrocortisone. Le milieu de co-culture doit être choisi avec soin pour répondre aux besoins des deux types cellulaires.
    8. Une fois le gel ECM polymérisé, ajoutez doucement 450 μL de suspension MDA-MB-231 à chaque puits. Cela donne un total de 13 500 cellules par puits.
      REMARQUE : Une superposition inégale de la suspension cellulaire sur le gel est possible à cette étape. Évaluez visuellement les côtés de la chambre et tapotez doucement sur tous les côtés pour répartir uniformément.
    9. À la culture d’adipocytes sur la plaque à 24 puits, ajoutez 450 μL de milieu de croissance mammaire contenant 2 % de gel ECM (v/v). Récoltez et changez le substrat toutes les 48 heures.
    10. Maintenez la co-culture pendant un maximum de 5 jours, avec des changements de média toutes les 48 heures.
      REMARQUE : Évitez l’aspiration sous vide et utilisez un pipetage délicat. Le décollement du gel ECM est un problème possible qui peut survenir lors du maintien en coculture.
    11. Pour le puits de contrôle du milieu conditionné uniquement, diluer les adipocytes récoltés (à partir de l’étape 1.3.9) a conditionné le milieu 1:1 avec un milieu frais avant de remplacer le milieu de co-culture épuisé les jours 2 et 4.
      REMARQUE : À ce stade, la période de co-culture est terminée et doit être analysée soit en fixant et colorant les cultures pour déterminer la morphologie et l’expression des marqueurs (voir section 2), soit en extrayant des cellules de l’environnement de co-culture et en préparant les cellules pour une analyse en aval ( voir section 3).
  4. Marquage des cellules fluorescentes (optionnel)
    REMARQUE : Le marquage des cellules superposées peut être effectué avant l’étape 1.3.7 pour aider à identifier les cellules superposées lors de la capture d’image par immunofluorescence.
    1. Préparez une solution de 5 mM de succinimidyl ester de diacétate de carboxyfluorescéine (CFSE) en dissolvant 10 mg de CFSE dans 4,22 mL de DMSO. Conservez des aliquotes de 500 μL à -20 °C, protégées de la lumière.
    2. Après avoir compté les cellules de l’étape 1.3.6, lavez les cellules une fois avec 5 mL de PBS. Resuspendez le pellet obtenu dans 1x PBS jusqu’à une concentration finale de 1 000 000 de cellules/mL.
    3. Ajouter 1 μL de 5 mM de CFSE par mL de suspension cellulaire pour obtenir une concentration de travail finale de 5 μM. Incuber la suspension cellulaire pendant 20 minutes à température ambiante, protégée de la lumière.
    4. Trempez la coloration CFSE en ajoutant 5 volumes de milieu de culture. Incubez 5 minutes supplémentaires à température ambiante.
    5. Utilisez des cellules à pellets et lavez deux fois avec du PBS pour éliminer les résidus de CFSE. Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance mammaire préchauffé. Incubez encore 10 minutes à température ambiante pour éviter qu’il ne reste de colorant.
    6. Semez les cellules marquées fluorescentement comme décrit à l’étape 1.3.7. Le reste du protocole peut être exécuté tel que décrit.

2. Immunofluorescence

  1. Fixation
    REMARQUE : Pour éviter la dépolymérisation du gel ECM et la perte d’échantillons lors du lavage, laissez tous les réactifs s’équilibrer à température ambiante pendant ~30 minutes avant utilisation.
    1. Après 5 jours de co-culture, remplacer le média par 500 μL de PBS.
      REMARQUE : Les étapes 2.1.2 à 2.3.7 peuvent être réalisées dans des conditions non stériles.
    2. Retirez le PBS et remplacez-le par du paraformoldéhyde à 2 % (PFA) dans du PBS (préparé frais) à température ambiante pendant 10 minutes.
      REMARQUE : Le gel ECM est sensible aux PFA et peut entraîner un décollement de la couche de gel.
      ATTENTION : Le PFA se décompose en formaldéhyde avec le temps. Évitez l’inhalation de vapeurs, assurez-vous d’une ventilation suffisante et portez toujours un équipement de protection individuelle approprié (c’est-à-dire gants, blouse de laboratoire, protection oculaire) lors de la manipulation de PFA.
    3. Retirez le PFA et lavez les puits avec 500 μL de solution de lavage PBS-Glycine pendant 15 minutes à température ambiante avec une légère agitation.
      REMARQUE : L’utilisation d’un lavage PBS-Glycine est essentielle pour empêcher les aldéhydes libres de produire de la fluorescence de fond. Ne pas laver dans du PBS sans glycine.
    4. Répétez l’étape 2.1.3 deux fois pour un total de trois lavages. Voir 2.1.5 pour les conditions de stockage, passer à l’étape 2.2.2 si ce n’est pas nécessaire.
    5. À ce stade, le protocole peut être mis en pause jusqu’à 1 semaine, et la lame peut être stockée à 4 °C. Pour stocker la culise, remplissez tous les puits avec 1 mL de PBS, et scellez le couvercle de la lame de la chambre avec un fin ruban de parafilm. Placez la lame à plat dans un récipient étanche à la lumière, sur un tissu délicat humidifié afin de s’assurer que les cultures ne sèchent pas.
  2. Coloration par anticorps
    1. Amenez les lames précédemment stockées à température ambiante, retirez le PBS et lavez les puits avec 500 μL de PBS frais pendant 15 minutes en agitant doucement. Saute cette étape si tu continues directement depuis l’étape 2.1.4.
    2. Perméabiliser les cellules avec 500 μL de tampon de perméabilisation pendant 15 minutes à température ambiante sans agitation.
    3. Laver les puits avec 500 μL de PBS, avec 15 minutes d’agitation douce. Répétez deux fois pour un total de 3 lavages.
    4. Ajoutez 500 μL de tampon de blocage à chaque puits et faites couver pendant 1 h à température ambiante avec une légère agitation.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’espèce source du sérum dans le tampon bloquant correspond à l’espèce hôte de l’anticorps secondaire. Dans ce protocole, nous utilisons le sérum d’âne et les anticorps secondaires de l’âne.
    5. Diluer les anticorps primaires d’intérêt dans le tampon FI, selon les recommandations du fabricant. Retirez le tampon bloquant et ajoutez 300 μL de solution diluée d’anticorps à chaque puits.
    6. Scellez le couvercle de la culasse de la chambre avec un parafilm et placez la culasse dans un récipient étanche à la lumière. Incubez toute la nuit à 4 °C avec une légère agitation.
    7. Laver les puits avec 500 μL de tampon FI, avec 15 minutes d’agitation douce. Répétez deux fois pour un total de 3 lavages.
    8. Diluez les anticorps secondaires fluorescents appropriés dans un tampon FI, selon les recommandations du fabricant. Ajoutez 300 μL de dilution d’anticorps secondaires à chaque puits et incubez pendant 1 h à température ambiante avec une légère agitation.
      REMARQUE : Évitez une exposition prolongée à la lumière après cette étape pour limiter le photoblanchiment.
    9. Répétez l’étape 2.2.7.
    10. Diluez une solution d’origine de 300 μM de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) 1:800 dans PBS. Ajoutez 300 μL à chaque puits et faites couver pendant 20 minutes, à température ambiante, avec une légère agitation.
    11. Lavez les cellules avec 500 μL de PBS pendant 5 minutes avec une légère agitation. Répétez une fois.
  3. Montage de culasse
    1. Retirez autant que possible de PBS résiduel sans déranger les cultures. Remplacez le couvercle et séparez la chambre de la glissière en verre à l’aide de l’outil fourni par le fabricant de la glissière de chambre.
    2. À l’aide d’un mouchoir délicat, essuyez les bords de la lame pour éliminer les résidus de PBS sans déranger le gel ECM.
    3. Faites lentement passer du scellant silicone autour des bords de la lame à l’aide d’une seringue et d’une aiguille de 18G. Laissez 3 minutes pour que le silicone prenne.
    4. Pendant que le silicone prend, ajoutez 1 à 2 gouttes de support antifondu dans chaque puits. Évitez les bulles. Si des bulles se forment, utilisez une pipette pour les retirer soigneusement sans endommager la culture.
    5. Une fois le silicone pris, abaissez doucement une toile de verre à un angle faible. Utilisez des pinces ou une pointe de pipette pour expulser les bulles d’air pendant que la gaine est descendue. Exercez une pression douce pour éviter de briser la bâtonne.
    6. Placez la lame dans un récipient étanche à température ambiante et laissez-la reposer toute la nuit. La lame peut ensuite être stockée à 4 °C, et le protocole est mis en pause pendant jusqu’à 1 semaine.
      REMARQUE (Optionnelle) : Pour mieux sceller les glissades, appliquez un vernis transparent sur les bords de la gaine 1 h après le couvre-slip.
    7. Des lames d’image à l’aide d’un microscope à fluorescence confocal à un grossissement de 10 à 20x. Capturez cinq champs de vision aléatoires pour minimiser le biais de l’opérateur.

3. Récolte des cocultures pour l’analyse en aval

REMARQUE : La récolte de cellules ou de biomolécules est incompatible avec l’immunofluorescence. Il est recommandé de cultiver des co-cultures destinées à d’autres analyses en aval dans des plateaux de culture standard à 24 puits en utilisant les mêmes concentrations et volumes cellulaires que ceux décrits dans les sections 1 et 2.

  1. Extraction cellulaire
    1. Retirez le substrat usé et lavez doucement les puits avec du PBS bien froid. Répétez une fois pour un total de deux lavages.
    2. À l’aide d’une pointe de pipette à large calibre, ajoutez 1 mL de solution de récupération à cellules glacées, désignée ci-après par solution de récupération. Pippette doucement de haut en bas pour perturber la couche de gel ECM. Transférez le liquide dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL.
      REMARQUE : La solution de récupération cellulaire est une solution non enzymatique disponible dans le commerce conçue pour libérer doucement les cellules intégrées dans un gel ECM. Il s’agit d’une composition propriétaire et peut être incompatible avec certains types de cellules. En alternative, la dépolymérisation enzymatique du gel ECM peut être envisagée à l’aide de protéinases douces comme la Dispase ou l’Accutase. Cela nécessitera des incubations à 37 °C ainsi qu’une optimisation du temps d’incubation.
    3. Ajoutez 250 μL de solution de récupération glacée à chaque puits pour recueillir les cellules restantes. Transférez dans le tube microcentrifuge correspondant.
    4. Inversez les tubes 4 à 5 fois pour mélanger.
    5. Transférez les tubes sur de la glace et éclovez pendant 60 minutes avec une légère agitation. Toutes les 10 minutes, inversez les tubes 2 à 3 fois pour éviter que le contenu des tubes ne se dépose.
    6. Tubes centrifugeurs à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C
    7. Vérifiez la présence d’une granule cellulaire visible. Retirez soigneusement le surnageant et ajoutez 1 mL de 1x PBS bien froid. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à 4 °C. Répétez une fois pour un total de deux lavages. Attendez-vous à ce que le pellet contienne 80 à 90 % des cellules initialement semées, les proportions de chaque type de cellule restant constantes.
      REMARQUE : À ce stade, la pastille cellulaire peut être lysée pour collecter des protéines ou des acides nucléiques. Les granulés lysés peuvent être stockés à -80 °C, et le protocole peut être mis en pause pendant 3 mois. La lyse est incompatible avec la version 3.2.
  2. Préparation de la suspension monocellule
    1. Resuspendez le comprimé dans 200 μL de 0,25 % de trypsine-EDTA. Ensuite, couver à 37 °C pendant 3-4 minutes.
    2. Ajoutez 600 μL de milieu de croissance complet pour calmer la digestion de la tryppine.
    3. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez le surnageant et ajoutez 500 μL de PBS à température ambiante.
    4. Centrifugez à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Répétez une fois pour un total de deux lavages.
    5. Resuspendez le pellet dans 80 μL de PBS avec 0,04 % de BSA, puis la suspension filtrée à l’aide d’un tamis de cellules de 40 μm.
    6. Diluez 5 μL de suspension dans 5 μL de bleu de trypan. Comptez les cellules et évaluez la viabilité à l’aide d’un hémacytomètre. Les cellules sont désormais prêtes pour une analyse en aval.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pour démontrer l’efficacité de ce protocole dans l’étude des effets des interactions cellule-cellule à travers une membrane basale, les figures 2 et 3 ont été réutilisées d’une publication précédente (Pallegar et al.16) comme résultats représentatifs. Les figures 4 et 5 sont des données nouvelles et ont été produites pour montrer l’adaptabilité d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’absence d’interactions complexes entre cellules dans la culture cellulaire traditionnelle souligne la nécessité d’améliorer les modèles d’organes et de tissus pour étudier plus précisément les réponses aux médicaments et la progression de la maladie in vivo. Le développement de systèmes de co-culture 3D a contribué à combler ce manque en permettant l’étude des conséquences des interactions cellulaire-cellule sans nécessiter d’études in vivo

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le développement de la méthode a été partiellement financé par la Cancer Research Society. GRK a été soutenu par un financement fourni par la bourse d’études supérieures Carol Ann Cole de la Société canadienne du cancer, via le programme de formation en recherche sur le cancer de l’Institut de recherche sur le cancer Beatrice Hunter. Le PMMB a été soutenu par la subvention du programme MOBILITAS (2024) de l’Institut de recherche en santé des îles Baléares (IdISBa). La figure 1 a été créée avec BioRender.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plaque de culture tissulaire à 24 puitsCorning3524
Verre de couverture 24 x 60 mmUltident Scientific170-C2460
4 % de paraformaldéhyde dans PBSInvitrogenJ61899. AKDilué à 2 % dans 1x PBS
Diapositives de culture à 4 puits chambrésFaucon354114
Alexa Fluor 647 AffiniPure Fab Fragment Anti-Chèvre IgG (H+L)Jackson Immunoresearch Laboratories Inc.705-607-003
Hémacytomètre à raies clairesHausser Scientific3120
Kit de prolifération CellTrace CFSEInvitrogenC34570
Solution de récupération cellulaireCorning354253
DAPISigma-Aldrich Canada Co.D9542
Anticorps secondaire adsorbé croisé contre l’IgG (H+L) de l’Âne, DyLight 594InvitrogenSA5-10168
Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorps secondaire fortement adsorbé croisé, Alexa Fluor 647InvitrogenA31573
DMEM/F-12, sans rouge phénoléGibco21041025
Média d’aigle modifié de Dulbecco, glycémie élevé, pyruvateGibco11995-065
Sérum fœtal bovin, origine canadienneGibco12483-020
Filtres cellulaires Flowmi, 40 & micro ; MBel-Art136800040
Fenêtre et porte en silicone GE Advanced, transparentesHenkel International2811093
Anti-ZO-1 polyclonal de chèvreSantaCruz BiotechnologieSC8146Anticorps primaire, arrêté
Rat Monoclonal Anti ZO-1SantaCruz BiotechnologieSC33725Anticorps primaire alternatif pour remplacer le SC8416 anti-ZO-1 abandonné
Milieu basale des cellules épithéliales mammairesPromocellC-21210
Matrigel, sans phénol rouge, facteur de croissance réduit, sans LDEVCorning356231Concentration en protéines : 9-9,6 mg/mL
Anti-Vimentine monoclonale de sourisSigma-Aldrich Canada Co.V2258Anticorps primaire
Sérum pour veaux nouveau-nés, origine néo-zélandaiseGibco16010159
Pénicilline-streptomycineGibco15140-122
Solution physiologique tamponnée au phosphate, pH 7,4Gibco10010023
Montage antifade en or ProLongInvitrogenP36934
Anti-E-Cadherin purifié pour sourisBD Biosciences610181Anticorps primaire
Rabbit Polyclonal Anti-Claudin 7  ;AbcamAB27487Anticorps primaire
RPMI 1640, GlutamineGibco11875-093
SupplementMixPromocellC-39115
Trypan Blue Stain (0,4 %)Gibco15250-061
Trypsine 0,25 %-EDTAGibco25200056

References

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