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Article de méthode

L’analyse ratiométrique quantitative des biocapteurs à base de FRET chez Arabidopsis thaliana permet la mesure en direct des analytes dans les compartiments subcellulaires

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DOI :

10.3791/70028

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24 février 2026

 , 
1Department of Biology, Texas A&M University

Dans cet article

Résumé

Nous présentons un protocole d’analyse quantitative des molécules ou ions dans les compartiments subcellulaires de cellules vivantes à l’aide de biocapteurs basés sur le transfert d’énergie par résonance de Förster (FRET). Elle inclut l’imagerie standardisée, le traitement par masque binaire et l’analyse ratiométrique avec régression linéaire appliquée au phosphate chez Arabidopsis thaliana (A. thaliana), mais elle est largement applicable à d’autres biocapteurs et organismes.

Résumé

Les biocapteurs fluorescents offrent une approche non invasive et polyvalente pour surveiller les changements dynamiques des concentrations de métabolites ou d’ions au sein des cellules vivantes. Plus précisément, les biocapteurs basés sur FRET permettent des mesures ratiométriques qui rapportent les niveaux d’analytes subcellulaires tout en étant indépendants des niveaux d’expression des biocapteurs. Nous décrivons un protocole complet et standardisé pour l’analyse ratiométrique quantitative des biocapteurs à base de FRET chez les plantes. Le protocole guide les utilisateurs à travers la préparation d’échantillons vivants, l’acquisition d’images confocales des donneurs, les canaux FRET et accepteurs, la génération de masques binaires pour les régions subcellulaires d’intérêt, suivie d’une analyse ratiométrique basée sur la régression. Le résultat principal est une lecture ratiométrique dérivée de la régression qui permet des comparaisons quantitatives entre les génotypes, les tissus, les stades de développement et les conditions de traitement. En utilisant le biocapteur cpFLIPPi-5.3m pour le phosphate inorganique comme exemple, nous démontrons la mesure des niveaux de phosphate inorganique dans le stroma chloroplastique d’A. thaliana. Ce cadre analytique est largement applicable à d’autres biocapteurs et systèmes modèles basés sur FRET, permettant une quantification spatiotemporelle précise des métabolites et ions in vivo. Cette stratégie offre des informations mesurables sur la dynamique subcellulaire des métabolites et des ions, en soutenant des comparaisons dans divers contextes expérimentaux.

Introduction

La surveillance de la dynamique des métabolites et des ions dans les cellules végétales vivantes est essentielle pour comprendre comment les voies métaboliques et les réseaux de signalisation sont coordonnés dans l’espace et le temps afin de soutenir la croissance etle développement 1,2. Les niveaux de métabolites cellulaires fluctuent rapidement en réponse à des signaux environnementaux tels que la disponibilité en nutriments, l’intensité lumineuse et le stress3. Parmi ceux-ci, le niveau de phosphate inorganique (Pi) est particulièrement important et joue un rôle clé dans le transfert d’énergie, la signalisation et la régulation métabolique, mais sa dynamique subcellulaire reste difficile àmesurer 4.

Les tests colorimétriques standards et la résonance magnétique nucléaire au phosphore-31, (³¹P)-RMN, peuvent estimer le Pi total ou compartimenté, mais ils manquent de résolution monocellulaire et ont une précision temporellelimitée 5,6. Bien que la spectrométrie synchrotron à rayons X et l’imagerie radiotraceur fournissent des informations subcellulaires ou de flux, elles ne peuvent pas distinguer de manière fiable Pi des métabolites phosphorylés et sont souvent invasives. Le fractionnement non aqueux et les tests cinétiques enzymatiques offrent des estimations indirectes du Pi stromal et cytosolique, mais ces approches sont laborieuses et susceptibles decontaminer 7,8. Ensemble, ces limites soulignent la nécessité de méthodes non destructives avec une haute résolution spatiale et temporelle pour surveiller des métabolites comme Pi, telles que l’imagerie en temps réel des biocapteurs basés sur FRET.

Les biocapteurs à base de FRET codés génétiquement sont des outils puissants pour les analyses in vivo de la dynamique des ions intracellulaires et des métabolites. Les premières études ont démontré l’utilité de ces biocapteurs pour surveiller les concentrations de glucose, de saccharose et d’ATP dansles cellules 9, 10, 11. Des avancées plus récentes ont étendu cette approche à la surveillance du calcium, nitrate, phosphate, auxine, acide abscissique et inchiberelline, offrant des informations précieuses sur la régulation des nutriments et deshormones 12,13,14,15,16.

cpFLIPPi-5.3m est un biocapteur Pi basé sur FRET, optimisé pour surveiller les niveaux subcellulaires de Pi dans les cellulesvégétales 17. Ce biocapteur se compose d’une protéine liant le Pi aux cyanobactéries flanquée d’un donneur de FRET (eCFP, protéine fluorescente cyan améliorée) et d’un accepteur de FRET (cpVenus, une variante modifiée de la protéine fluorescente jaune de Vénus), et il subit un changement conformationnel lors de la liaison à Pi. Ce changement modifie le signal de fluorescence dérivé du FRET dépendant de Pi, capté par imagerie confocale, de sorte qu’une augmentation de la concentration de Pi entraîne une diminution du ratio FRET/donneur. L’analyse ratiométrique dépendante du Pi est réalisée lors du post-traitement des images en comparant les intensités des émissions accepteurs etdonneurs 18.

L’analyse quantitative ratiométrique des FRET dans les tissus vétéraux vivants nécessite une correction pour le passage spectral et l’excitation croisée des fluorophores donneurs (CFP) et accepteurs (cpVenus),respectivement 18. Le bleed-through survient lorsque l’émission de CFP est détectée dans le canal FRET, tandis que l’excitation croisée résulte de l’excitation de cpVenus lors de l’excitation CFP. Ces artefacts spectraux peuvent varier selon les cellules et compartiments subcellulaires, en particulier dans les tissus végétals pigmentés, et donc confondre les mesures ratiométriques. Pour obtenir une émission de FRET corrigée ou sensibilisée, les contributions de traversée et de cross-excitation sont soustraites du signal brut du FRET comme suit :

Émission FRET sensibilisée = Émission brute de FRET - débordement - excitation croisée

Les facteurs de correction pour le passage par hémorragie et l’excitation croisée sont déterminés en imageant les plantes exprimant la CFP ou la cpVenus individuellement dans les mêmes emplacements cellulaires et subcellulaires que lebiocapteur 18. L’émission FRET sensibilisée est ensuite calculée comme suit :

Émission FRET sensibilisée = Émission brute de FRET - (émission CFP × facteur de correction par filtre) - (émission cpVenus × facteur de correction d’excitation croisée)

Le rapport entre l’émission FRET sensibilisée et l’émission du donneur (rapport FRET) rapporte des variations relatives de la concentration de ligands et est indépendant des niveaux d’expression19 des biosenseurs.

Le biocapteur cpFLIPPi-5.3m a été ciblé avec succès vers des compartiments sous-cellulaires distincts d’A. thaliana et d’autres espèces, permettant la visualisation de la dynamique Pi 18,20,21,22. Ce biocapteur a révélé une hétérogénéité dans la distribution et le transport du Pi cytosolique entre les tissus et a lié les fluctuations du stromal Pi des chloroplastes à l’activité du transporteur et à la performancephotosynthétique 20,21. Parce que le biocapteur rapporte des changements dans une plage dynamique définie, l’interprétation exige que cette plage englobe les niveaux Pi in vivo dans des conditions d’imagerie stables. Un éclairage inégal ou une très faible abondance de biocapteurs peuvent influencer les mesures ratiométriques, soulignant l’importance de réglages d’acquisition standardisés et de contrôles négatifs appropriés tels que le capteur de contrôle insensibleau Pi 20. Lorsque la variation du ratio FRET entre les régions d’intérêt (ROI) est minimale, l’analyse de régression peut ne pas être appropriée, et il est recommandé de regrouper les moyennes du ROI.

Dans cet article, nous présentons un protocole détaillé pour l’analyse ratiométrique quantitative de cpFLIPPi-5,3m chez A. thaliana, incluant l’imagerie confocale, la segmentation d’image à l’aide de masques binaires, et les calculs du rapport FRET pour la surveillance dynamique de Pi dans les cellules vivantes. Cette méthode offre un flux de travail reproductible pour analyser les signaux biosensoriels basés sur FRET, avec des données ratiométriques analysées à l’aide de régressions linéaires et de comparaisons statistiques entre conditions expérimentales. Des données représentatives sont présentées grâce à une accumulation altérée de stroma Pi de chloroplaste dans PHT2 ; 1, un mutant transporteur chloroplaste Pi exprimant le capteur cpFLIPPi-5,3m 21,23. Ce protocole aidera les chercheurs à appliquer l’imagerie ratiométrique basée sur FRET à d’autres systèmes expérimentaux en détaillant les corrections spectrales des biocapteurs, les réglages d’imagerie et les étapes d’analyse quantitative. En standardisant l’acquisition d’images et l’analyse basée sur la régression dans des contextes expérimentaux définis, le flux de travail permet une comparaison cohérente des réponses FRET entre les échantillons analysés dans des conditions correspondantes. Il convient à ceux qui cherchent à mesurer des changements rapides et spécifiques à chaque compartiment des niveaux d’analytes dans les tissus végétaux vivants, y compris les mutants ou les lignées transgéniques présentant un transport ou un métabolisme de métabolites modifiés. Cette approche standardisée facilitera la reproductibilité des études quantitatives d’imagerie cellulaire vivante en biologie végétale. En plus du biodétection Pi localisé par chloroplaste décrit ici, la stratégie analytique peut être adaptée à d’autres biocapteurs à base de FRET et à des tissus spécifiques à l’organisme, à condition que des mesures d’étalonnage et de contrôle spécifiques aux biosenseurs soient établies.

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Protocole

REMARQUE : Les lignées transgéniques d’Arabidopsis exprimant cpFLIPPi-5,3m et cpFLIPPi-null (variantes cytosoliques et ciblées sur les plastides) ont été générées auparavant17, 18, et pht2 ; 1-1 (CS19883) a été obtenu auprès du Arabidopsis Biological Resource Center, milieu MS, lunettes de couverture, perfluorodécale, microscope confocal et un objectif d’immersion à l’huile 40x (ouverture numérique 1,3), des lasers d’excitation (CFP/445 nm et cpVenus/515 nm ou longueurs d’onde d’émission adaptées à l’instrument), des filtres d’émission pour CFP, cpVenus/FRET, et un accepteur, caméra ou détecteurs cpVenus, une station de travail d’analyse d’image, FIJI24 et Excel.

1 . Préparation de l’échantillon

  1. Génération des lignées transgéniques d’A. thaliana
    1. Clonez les biocapteurs cpFLIPPi-5.3m, ainsi que les contrôles insensibles au pi-insensible (cpFLIPPi-Null), uniquement au donneur (CFP) et uniquement à l’accepteur (cpVenus) dans les vecteurs d’expressionvégétale 17.
    2. Pour une expression stable, transformez les plants d’A. thaliana dans le fond mutant SGS3-13 via le dip floral dip d’Agrobacterium tumefaciens , récoltez les graines T1, et sélectionnez des transformants sur des plaques d’agar Murashige & Skoog (MS) 0,5x contenant l’agent de sélection approprié, par exemple la phosphinothricine (10 μg/mL).
    3. Stériliser les graines d’A. thaliana exprimant les biocapteurs en les immergeant dans de l’éthanol à 70 % pendant 1 minute, transférer à l’eau de Javel à 50 % pendant 1 minute, puis rincer 6 à 10 fois avec de l’eau stérile.
      ATTENTION : L’éthanol et l’eau de Javel sont des irritants et doivent être manipulés en portant un équipement de protection individuelle (EPI) approprié. Effectuez la stérilisation des graines dans une hotte chimique ou dans un espace bien ventilé pour éviter l’inhalation des vapeurs et ne mélangez jamais directement de l’eau de Javel et de l’éthanol. Éliminez les solutions de déchets conformément aux directives institutionnelles de sécurité chimique.
    4. Stratifiez les graines à 4°C dans l’obscurité pendant 2 à 3 jours pour synchroniser la germination, puis transférez les graines dans un milieu MS solidifié à l’agar ou liquide contenant 0,5x MS contenant 0,25 % de saccharose et la concentration désirée de Pi (250 μM) pour le plan expérimental. Incluez l’agent de sélection si vous sélectionnez des transformants.
    5. Transférer les plaques vers une chambre de croissance contrôlée réglée à 21°C, 16 h de lumière : 8 h de photocycle sombre, 120 μmol·m⁻²·s⁻¹ d’intensité lumineuse et ~60 % d’humidité relative. Faites pousser les semis pendant 4 à 7 jours pour imager les racines ou transférez les semis dans le sol pendant 21 jours pour imager les feuilles.
    6. Lors de tests de traitements Pi, transférer les semis dans le milieu Pi désiré (par exemple, 250 μM Pi pour le Pi complet ; 10 μM Pi pour le Pi-carence) et maintenir le traitement pendant la période définie (par exemple, 48 h pour une privation aiguë de Pi).
    7. If possible, screen plants for adequate sensor expression by imaging for donor or acceptor fluorescence (low-intensity excitation) using a fluorescence stereo microscope (7-‬10x magnification).
    8. Évaluer les lignées du même fond génétique qui expriment cpFLIPPi-nul comme témoins insensibles au ligand.

2 . Imagerie confocale

  1. Pour les radics, montez les semis dans leur milieu de croissance ou dans l’eau stérile sur une lame en verre. Posez doucement une petite couche de couverture pour aplatir les racines sans compression. Image immédiatement.
  2. Pour les feuilles, exciser la feuille cible (par exemple, la 3e ou la 4e feuille chez les plantes âgées de 21 jours), placer la surface adaxiale en lames.
  3. Infiltrez avec 10-15 μL de perfluorodécaline pour dégager les espaces d’air si nécessaire, puis recouvert doucement d’un petit poids en verre pour aplatir l’échantillon. Image immédiatement.
  4. Utilisez un objectif à haute NA approprié pour les cellules vivantes (par exemple, 40× / 1,2-1,3 NA). Utilisez le même objectif pour tous les échantillons afin de maintenir la comparabilité.
  5. À l’aide du logiciel Metamorph, réglez les canaux d’excitation et d’émission et capturez les images (Figure 1).
    REMARQUE : Pour capturer l’émission du donneur (CFP) : une excitation à ~445 nm (ou ligne CFP adaptée à l’instrument) et la collecte de l’émission du donneur (par exemple, une bande passante de 470-500 nm) peuvent être utilisées. Par exemple, l’excitation du laser 445 nm à 70 % (Figure 1A) avec un temps d’exposition de 1000 ms (Figure 1B) a été utilisée pour capturer l’émission de CFP. Pour capturer la FRET (émission d’accepteur sensibilisée) : excitation à la longueur d’onde donneuse (445 nm) et collecte de la bande d’émission de l’accepteur (par exemple, 530-560 nm). Pour capturer le canal accepteur direct : excitation à l’excitation accepteur (par exemple, 500-515 nm) et collecte de la même bande d’émission accepteur que pour le FRET.
  6. Acquérir les images séquentiellement : capturez l’excitation du donneur/émission du donneur, l’excitation du donneur/émission de la FRET, puis l’excitation de l’accepteur/l’émission de l’accepteur. Limitez le temps d’imagerie par champ pour limiter le photoblanchiment (500-1000 ms).
    REMARQUE : Pour chaque localisation cellulaire (cytosol racinaire, cytosol mésophylle foliaire, stroma chloroplastique), déterminer la puissance laser optimale, le gain du détecteur et le temps d’exposition (Figure 1) de sorte que les intensités moyennes des pixels soient supérieures au fond local mais inférieures à la saturation du détecteur. Maintenir les mêmes réglages de capture pour les canaux dérivés de l’excitation donneuse (donneur et FRET) pour un emplacement donné. Les paramètres d’imagerie dépendent de l’échantillon, du microscope, de la source lumineuse et du système de détection, et doivent donc être déterminés empiriquement, avec des plages acceptables évaluées et documentées par analyse de régression comme décrit dans ce protocole. Le logiciel de capture d’image utilisé ici est Metamorph version 7.
  7. Utilisez la même sensibilité du détecteur (par exemple, ici, un gain de 2,4x et un décalage nul) sur toutes les images pour la localisation d’une cible. Si vous utilisez plusieurs détecteurs, caractérisez les réponses spectrales pour chaque détecteur et documentez-les.
  8. Acquérir des images témoins pour chaque tissu/génotype d’intérêt.
    1. Imagez un tissu sauvage non transformé pour déterminer l’autofluorescence de fond pour chaque canal.
    2. Imager les plantes exprimant le donateur uniquement (CFP) et l’accepteur seul (cpVenus) aux mêmes réglages de capture pour chaque emplacement afin d’obtenir les coefficients de correction spectrale (bleed-through et cross-excitation). Capturez des images de plusieurs individus (≥6-8) avec une gamme d’intensités d’émission.

3 . Traitement d’image

  1. Ouvrez les images brutes des canaux donneur (appelés CC pour excitation/émission par donneur), FRET (appelé CY pour excitation doneur/émission accepteur) et accepteur (YY pour excitation/émission accepteur) dans des logiciels d’analyse tels que FIJI ou ImageJ. (Figure 2).
  2. Déterminez l’intensité moyenne de fond par canal en échantillonnant plusieurs (5 à 10) ROI dans des emplacements équivalents provenant de plantes non transformées imagées avec les mêmes réglages. Soustrayez la valeur moyenne de fond de chaque image de canal correspondante.
  3. Étapes à suivre aux Fidji
    1. Cliquez sur l’onglet Analyser> définir les mesures > sélectionner la valeur grise moyenne. Mesurez l’intensité de fond en choisissant un ROI spécifique ou une moyenne de l’image entière.
    2. Cliquez sur Analyser > Mesurer. Enregistrez les valeurs dans un tableau Excel et calculez les valeurs moyennes en arrière-plan pour chaque canal. Seuillez l’image du donneur (CFP) pour définir la frontière spatiale du biocapteur (le donneur a généralement le signal le plus faible). Convertissez l’image donneuse seuillée en masque binaire (Figure 3 A).
    3. Cliquez sur l’image d’onglet> ajuster> seuil.
    4. Une fenêtre de seuil s’ouvrira. Choisissez la méthode Max Entropy pour le seuil. Établir la frontière spatiale, dans ce cas le stroma chloroplaste, et appliquer le seuil. Cela génère une image binaire en noir et blanc (Figure 3 B).
    5. Cliquez sur Tab Math> Diviser> Entrer la valeur 255. L’image deviendra toute blanche. Enregistrez cette image de masque binaire en fichier .tiff.
    6. Multipliez le masque binaire par les trois images soustraites de fond pour créer des images masquées à analyser (Figure 3C).
    7. Ouvre le fichier masque binaire dans FIJI.
    8. Clique sur Processus d’onglet > Mathématiques>Multiplicer.
    9. Choisissez le masque binaire comme l’une des images et l’image CC soustraite en arrière-plan comme l’autre.
    10. Répétez les étapes pour CY et YY.
    11. Tirez les ROI sur les images masquées adaptées à la structure étudiée (cellule entière, cytosol, stromal chloroplastique). Pour chaque ROI, extraire les intensités moyennes des pixels pour les canaux donneur, FRET et accepteur direct. Sauvegardez les métadonnées du ROI (nom de l’image, coordonnées, état expérimental, identifiant de la réplication) pour une analyse statistique en aval.
    12. Images CC, CY et YY en ouvert.
    13. Cliquez sur Tab Math> Soustraire > Entrer la valeur moyenne en arrière-plan. Sinon, cela peut se faire juste avant de calculer le FRET sensibilisé dans Excel.
    14. Ouvre le fichier CC masqué.
    15. Cliquez sur Onglet Processus > Calculatrice d’image. Multipliez le CC avec le fichier image CC masqué. Cela ouvrira un nouveau fichier image 32 bits.
    16. Dessinez les ROI en utilisant les outils FIJI appropriés dans la barre des tâches principale. Par exemple, ici le stroma chloroplaste est sélectionné à l’aide de l’outil ROI « ovale ». Ajoutez les ROI à un gestionnaire de ROI (ctrl+T). Choisissez 5 à 10 ROI par image. Cochez « Tout afficher ». Ces ROI peuvent être stockés sous forme de métafichier séparé (Figure 3D). Ne fermez pas le responsable du ROI.
    17. Cliquez sur Onglet Analyser> Définir les mesures> Sélectionnez la valeur grise moyenne.
    18. Cliquez sur « Mesurer » dans le gestionnaire de ROI.
    19. Les valeurs moyennes des pixels des ROI choisis apparaîtront sous forme de liste dans une fenêtre séparée.
    20. Copiez ces données dans Excel. Ne fermez pas le responsable du ROI.
    21. Répétez la multiplication du fichier CC masqué avec les images CY et YY pour obtenir des mesures des mêmes ROI en utilisant le gestionnaire de ROI dans chaque canal individuel. Stockez les valeurs dans Excel.

4. Analyse ratiométrique

  1. Ouvrez Microsoft Excel pour effectuer les opérations suivantes (Figure 4).
  2. Calcul des coefficients de correction.
    1. Pour chaque localisation cellulaire, tracez les intensités des canaux FRET (axe Y) des plantes uniquement donneuses par rapport aux intensités donneuses (axe X). Ajustez une régression linéaire. La pente correspond au coefficient de traversée du donneur (désigné a).
    2. Répétez en traçant les intensités des canaux FRET des plantes à accepteur seul (axe Y) par rapport aux intensités des accepteurs directs (axe X). La pente est le coefficient d’excitation croisée de l’accepteur (désigné b).
    3. Utilisez ≥ 15 à 20 ROI de plusieurs centrales pour obtenir des coefficients robustes. Pour le stroma chloroplastique, 50 à 60 chloroplastes sont choisis.
  3. Calculer le FRET sensibilisé pour chaque ROI comme suit
    FRET sensibilisé = FRET brut - (donneur ×) - (accepteur × b )
    où a et b sont des coefficients spécifiques à la localisation dérivés ci-dessus (Figure 4).
  4. Tracez les fréquences de fret (axe Y) sensibilisées par rapport aux intensités des canaux donneurs (axe X) pour les ROI regroupés. Ajustez une régression linéaire et Excel fournira un ajustement au format y = mx + c, où y correspond aux intensités sensibilisées des FRET, x aux intensités du donneur, c à l’interception y et m à la pente de la régression. Notez R² pour les régressions ajustées. Typiquement, R² varie de 0,8 à 1, ce qui représente un bon ajustement (Figure 4).
  5. Pour les mesures cytosoliques et stromaliques, calculez et utilisez la pente du FRET/donneur (FRET ÷ donneur sensibilisé) comme lecture ratiométrique, également appelée rapport FRET.
    REMARQUE : L’erreur de l’ajustement de la régression représente l’erreur standard de la pente (utilisez la fonction LINEST dans Excel). Utilisez la sélection spécifique à la localisation de manière cohérente entre les échantillons et génotypes d’intérêt. La régression linéaire appliquée aux données provenant de multiples ROI et d’usines indépendantes confirme que le rapport FRET est indépendant de l’abondance des capteurs.
  6. Calibration, contrôles et distinction des effets non spécifiques.
    1. Utilisez cpFLIPPi-null (variante insensible au ligand) exprimée en parallèle et traitée de manière identique pour distinguer les changements potentiels non spécifiques du rapport FRET (pH, intensité ionique, photophysique) des changements spécifiques à Pi.
    2. Données agrégées au niveau du ROI avec champs : génotype, compartiment, ID de plante réplicative, ID ROI, donneur, accepteur, FRET brut, FRET sensibilisé, ratio ajusté (selon le cas). Conservez les intensités brutes.
    3. Pour les comparaisons de population, utilisez les pentes dérivées de la régression comme statistiques principales ; Rapporter les pentes ± SE et % d’erreur relative.
    4. Appliquer des statistiques inférentielles appropriées (par exemple, test t de Student ou ANOVA) sur des paramètres dérivés de la régression. Utilisez des tests non paramétriques si les distributions violent la normalité. Corrigez les comparaisons multiples lorsque cela est applicable.
  7. Liste de contrôle de contrôle qualité (avant d’accepter les données)
    1. Vérifiez que les trois canaux de chaque image sont en dessous de la saturation du détecteur et disposent d’un rapport signal/bruit adéquat (>2-10x de fond de fond).
    2. Confirmer que les contrôles à un seul fluorophore donneur et accepteur ont été imagés dans des réglages identiques et ont permis d’obtenir des relations linéaires pour dériver les coefficients de correction a et b.
    3. Confirmez que l’enregistrement de l’image est exact et que les masques définissent correctement les régions contenant des biosenseurs.
    4. Confirmez que le contrôle cpFLIPPi-nul montre un manque attendu de sensibilité Pi.
  8. Indicateurs représentatifs de contrôle qualité pour aider à exclure des images
    1. Taux de saturation : moins de 1 à 2 % des pixels atteignent l’intensité maximale (65 535) pour les images 16 bits.
    2. Niveau de fond : L’intensité moyenne dans les régions sans cellules varie de ~50 à 200 unités.
    3. Plage d’intensité en pixels : Les intensités moyennes sont bien supérieures à l’arrière-plan mais restent en dessous de la saturation (~2 000-20 000 unités).
    4. Rapport signal/bruit (SNR) : Les valeurs doivent dépasser 2 à 10.

5. Test statistique de la différence entre deux pentes de régression

  1. Déterminer si deux pentes (pentes du rapport FRET dérivées de la régression entre deux génotypes ou traitements) diffèrentsignificativement de 25.
  2. Calculez la statistique de test et les degrés de liberté comme suit
    figure-protocol-1
    avec des degrés de liberté df = n1 + n2 - 4. m1 et m2 correspondent aux pentes issues de la régression linéaire, sb1 et sb2 correspondent à l’erreur standard de chaque pente (obtenue à partir de LINEST ou de la sortie de régression) et n1 et n2 sont les tailles d’échantillon (nombre de ROI utilisés pour ajuster chaque régression).
  3. Obtenez une valeur p à deux queues pour t avec df (par exemple, utilisez une table de distribution t ou un calculateuren ligne 26). Lors de l’utilisation de la calculatrice en ligne (Figure 5C), saisissez les sb1 et sb2 , n1 et n2 obtenus à l’étape précédente pour calculer la valeur p et les statistiques de test.
  4. L’interprétation consistera à rejeter l’hypothèse nulle (les pentes ne sont pas significativement différentes) si p < α (par exemple, α = 0,05). Rapport b1, b2, sb1,s b2, t, df, et p.

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Résultats

Imagerie confocale

À l’aide de la microscopie confocale et du logiciel Metamorph, des canaux distincts ont été acquis pour visualiser les signaux donneurs et accepteurs de FRET dans les tissus foliaires d’A. thaliana de type sauvage (WT) et le pht2 ; 1 mutant transporteur Pi chloroplaste (Figure 2). Des images représentatives illustrent une localisation subcellulaire claire du biosenseur Pi, avec...

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Discussion

Ce protocole offre une approche standardisée pour la quantification des métabolites ou ions par cellules vivantes à l’aide de biocapteurs à base de FRET. Les principaux avantages incluent la mesure ratiométrique non invasive et l’applicabilité à plusieurs compartimentssubcellulaires 17,20,21,22. L’utilisation de masques binaires et de régression linéaire amélio...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts lié à cette œuvre.

Remerciements

Nous reconnaissons les contributions des anciens membres du laboratoire W.K.V., dont les efforts ont soutenu le développement de ce protocole. Un soutien financier a été fourni par le Département de l’Énergie des États-Unis, Bureau des sciences, le programme de technologie de la bioimagerie (DE-SC0014037) et les sciences de l’énergie fondamentale (DE-FG02-04ER15559). L’A.S.R. a été soutenue en partie par des fonds de l’Institut Hagler pour les études avancées, Texas A&M University.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Objectif d’immersion à l’huile 40X   ;Olympehttps://www.edmundoptics.in/p/olympus-uplxapo-40x-oil-immersion-objective/55558/?srsltid=AfmBOoo0cqmgz7SoQ3ZCUvlJn_LeA37O42aX5BbFqF76k40CwQLNVn4PObjectif pour l’imagerie   ;
Verres de couverture / couverturesVWR48393-081Encaissement de couverture pour le placement de l’échantillon
FIJI (ImageJ)Open source2.9.0Logiciels d’analyse d’images
Microscope Olympus IX81 inverséOlympehttp://www.olympusconfocal.com/brochures/pdfs/ix81.pdfSystème d’imagerie confocale
Appareil photo iXon3 897 EMCCD   ;Technologie Andorhttps://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-camera-series/ixon-life-897Partie du système d’imagerie confocale
Logiciel MetaMorph V7Dispositifs moléculaires. LLCVersion 7Station de travail d’analyse d’images
Microsoft Excel  ;Microsoft Suitev16.68Logiciels d’analyse de données
Murashige & Skoog (MS) moyen   ;CaissonMSP11-10LTMilieu de croissance végétale
Perfluorodécaline (Acros Organic)Acros OrganicsP9900-25GMédium d’imagerie
PhosphinothricineSigma77182-82-2Antibiotique
Chambre de croissance des plantesConvironCoutumesChambre de croissance
Unité confocale à disque rotatif Yokogawa CSU-X1Yokogawahttps://www.yokogawa.com/solutions/products-and-services/life-science/spinning-disk-confocal/csu-x1-confocal-scanner-unit/Partie du système d’imagerie confocale

Références

  1. Frommer, W. B., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Genetically encoded biosensors based on engineered fluorescent proteins. Chem Soc Rev. 38 (10), 2833-2841 (2009).
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