Stratégie intégrée de microplaques et HPTLC pour déterminer et profiler les phénoliques totaux et les flavonols dans les extraits d’écorces d’agrumes

Résumé

Cette étude présente une approche combinée AlCl₃/Folin–Ciocalteu pour le profilage et la quantification des flavonols/5-hydroxyflavones et des composés phénoliques dans les pelures d’agrumes, complétée par une analyse de microplaques.

Résumé

Les composés phénoliques et les flavonoïdes contribuent significativement à l’activité antioxydante et à la valeur fonctionnelle des sous-produits des agrumes. Cependant, les tests colorimétriques conventionnels, bien que largement utilisés, manquent de séparation chromatographique et peuvent être affectés par des interférences chimiques. Ce protocole présente un flux de travail analytique intégré qui combine des tests spectrophotométriques sur microplaques avec la chromatographie en couche fine haute performance (HPTLC) pour la détermination et le profilage de la teneur phénolique totale (TPC) et de flavonols totaux plus la teneur en 5-hydroxyflavones (TFHC) dans les extraits d’écorces d’agrumes. Des extraits éthanoliques de pelures de chaux (Citrus aurantifolia) et de mandarine (Citrus reticulata) ont été évalués à l’aide de tests Folin–Ciocalteu (FC) et chlorure d’aluminium (AlCl₃) dans un format micro-plaque à 96 puits, suivis d’une analyse HPTLC utilisant deux phases mobiles séquentielles et une dérivatisation double post-chromatographique. Les mesures de microplaques ont donné des valeurs TPC de 74,2 mmol/g pour la chaux et 72,8 mmol/g pour la mandarine, tandis que les valeurs TFHC étaient respectivement de 15,5 mmol/g et 6,0 mmol/g. La séparation HPTLC a résolu quatre bandes phénoliques dans la chaux et six en mandarine. Deux bandes de chaux ont été visualisées sélectivement après la dérivatisation d’AlCl₃, ce qui correspond aux flavonols ou aux 5-hydroxyflavones. La somme des mauvais protège-phénolique estimée par le HPTLC était de 22,0 et 20,8 mmol/g de matière sèche pour la chaux et la mandarine, respectivement, tandis que le TFHC a atteint 13,4 mmol/g en chaux et n’a pas été détecté en mandarine. Ces résultats démontrent que les tests de microplaques permettent une estimation rapide et sensible du contenu total, tandis que le HPTLC améliore la sélectivité par séparation des composés et dérivation spécifique au groupe fonctionnel. Cette stratégie combinée permet un criblage à haut débit suivi d’une confirmation chromatographique, offrant une plateforme pratique et reproductible pour la caractérisation phytochimique de matrices végétales complexes.

Introduction

Les pelures d’agrumes sont un sous-produit de l’industrie des jus et ont démontré la présence de composés fonctionnels tels que les^{antioxydants 1}. Ils ont été utilisés comme aliments^{neuroprotecteurs 2}, anti-inflammatoires, cosméceutiques^{anti-acné 3}, et additifs^{alimentaires 4}. Plusieurs de ces bioactivités sont attribuées aux flavonoïdes⁵, et aux composés phénoliques⁶. Des méthodes générales pour estimer la quantité totale de flavonoïdes et de phénols ont été établies dans la^{littérature 7}, les plus courantes étant le Folin-Ciocalteu pour la teneur en phénolique totale (TPC⁾⁸, et le chlorure d’aluminium pour les composés flavonoïdes totaux (TFC⁾⁹ par spectrophotométrie. La méthode de Folin-Ciocalteau a été publiée pour la première fois en 1927¹⁰, basée sur une modification de la réaction de Folin-Denis¹¹, toutes deux basées sur une réaction redox de composés phosphotungstiques-phosphomolibdiques. La méthode Folin-Ciocalteau mesure la capacité réductrice des composés phénoliques¹². Le test du chlorure d’aluminium et des flavonoïdes a été proposé pour la première fois en 1960, basé sur des complexes entre les ligands métalliques et^{flavonoïdes 13}.

Les deux tests spectrophotométriques sont des outils utiles pour estimer et comparer la teneur globale en phytocomposés couramment présents dans les matériaux végétaux. Cependant, ils sont soumis à diverses limitations. Par exemple, certaines limitations découlent de l’utilisation des normes^{externes 14}, où l’on suppose généralement que la nature chimique de la norme n’affecte pas significativement la réponse du signal. En pratique, cette hypothèse est difficile à valider, car l’absorptivité molaire dépend de facteurs tels que la conjugaison et d’autres caractéristiques structurelles difficiles à standardiser dans les produits naturels. Par exemple, Appel et^{al. 15} ont évalué la TPC à partir de onze espèces de chênes et développé l’approche dite « auto-standard », rapportant des différences supérieures à 50 % dans les pentes des courbes d’étalonnage. L’utilisation auto-standard est une stratégie conçue pour représenter le même mélange compositionnel de composés que celui présent dans l’échantillon, fournissant ainsi une correspondance plus proche du contenu phénolique total réel (TPC) de l’échantillon¹⁶. Les auto-standards fournissent également certaines informations sur le rapport entre les groupes réactifs et le poids moléculaire moyen ; cependant, il est laborieux et difficile à standardiser.

Le test total des composés flavonoïdes basé sur la complexation au chlorure d’aluminium a été évalué de manière critique dans des études^{récentes 17,18}, qui ont conclu que l’AlCl₃ forme spécifiquement des complexes avec deux sous-groupes de flavonoïdes : les flavonols et les 5-hydroxyflavones. En général, les flavonols présentent une absorption maximale autour de 440 nm, tandis que les 5-hydroxyflavones absorbent autour de 415 nm. De plus, certains flavonoïdes peuvent présenter une absorbance intrinsèque dans la plage de 415–440 nm même en l’absence de dérivatisation, et l’augmentation de l’absorptivité lors de la complexation varie selon les composés. De plus, les deux tests colorimétriques manquent de séparation et ne peuvent donc pas distinguer les différents constituants phénoliques ; Bien que cette fonctionnalité puisse être avantageuse pour estimer le contenu total, elle entraîne une spécificité limitée. Ces considérations soulignent la nécessité d’une stratégie analytique qui résolve les composants individuels avant la détection colorimétrique, distinguant ainsi les véritables réponses au test des interférences spectrales ou chimiques.

Malgré ces limites, ces essais restent des outils précieux pour le dépistage général des composés phénoliques bioactifs dans les extraits de plantes et^{de fruits 19}. Pour évaluer les interférences potentielles, l’utilisation d’une méthode de chromatographie en couche fine haute performance (HPTLC), qui a été révélée avec les réactifs Folin–Ciocalteu et AlCl₃, représente une approche efficace. La séparation chromatographique permet de détecter des substances interférantes avec des bandes d’absorption préexistantes avant la complexation, tandis que la documentation photographique permet l’analyse simultanée de multiples maxima d’absorption. De plus, l’analyse HPTLC offre plusieurs avantages par rapport aux techniques chromatographiques plus complètes telles que HPLC–MS/MS, notamment une consommation de solvant plus faible, un temps d’analyse plus court grâce au traitement simultané de plusieurs échantillons (jusqu’à 18 par plaque⁾²⁰, et une interprétation facilitée des mélanges complexes grâce à la sélectivité de la dérivatisation^{post-chromatographique 21}.

Dans ce travail, nous présentons un protocole intégré pour la détermination des composés spécifiques comprenant la teneur totale en polyphénols (TPC) et les flavonols totaux plus les 5-hydroxyflavones (TFHC) dans les extraits d’écorces d’agrumes en utilisant la séparation chromatographique à couche fine haute performance (HPTLC), ainsi qu’une estimation générale du contenu basée sur un test colorimétrique sur microplaques. La quantification chromatographique planaire des composés phénoliques est réalisée à l’aide du réactif de Folin–Ciocalteu, tandis que la dérivatisation du chlorure d’aluminium est appliquée exclusivement pour l’identification chromatographique des bandes correspondant aux flavonols et aux 5-hydroxyflavones. Dans cette approche, la détermination des TFHC repose sur la réponse de Folin–Ciocalteu des composés résolus chromatographiquement et identifiés chimiquement, plutôt que sur la complexation au chlorure d’aluminium pour la quantification. L’analyse HPTLC permet une séparation et une visualisation spécifiques à chaque composé, permettant l’identification de constituants phénoliques individuels et la détection d’interférences spectrales potentielles. De plus, une méthode spectrophotométrique basée sur des microplaques est présentée pour une estimation rapide du TPC et du TFHC totaux du corps, fournissant un outil complémentaire de criblage à haut débit pour les matrices végétales complexes.

Protocole

1. Préparation des pelures de fruits

1. Retirez environ 50 g de pelures de chaque fruit, en les séparant de la portion comestible. Pour nos résultats représentatifs, des mandarines ont été achetées dans un magasin local (importées du Chili, variété isabelleine), et des citrons verts ont été récoltés sur un arbre près de San José, Costa Rica (spécimen bon JVR-16434).
2. Placez les pelures dans un sac plastique zip-lock et congelez-les à -20 °C pendant au moins 2 heures.
3. Transférez les pelures congelées dans un lyophilisateur pré-refroidi, laissez les sacs ouverts, puis appliquez du vide (0,1 mbar) toute la nuit jusqu’à ce que ce soit complètement sec.
4. Meuler chaque matériau séché à environ 0,1 mm à l’aide d’un broyeur à lames.

2. Extraction

1. Pèser environ 100 mg d’écorce d’agrumes secs et moulues (citron vert ou mandarine) et placez-les dans un tube en verre de 15 mL.
2. Ajoutez 3 mL d’éthanol à 60 % dans le tube.
3. Sonicez le mélange dans un bain ultrasonique pendant 10 minutes à 40 °C pour perturber les cellules végétales et faciliter la libération phytochimique.
4. Centrifugez l’échantillon à 850 × g pendant 10 minutes.
5. Transférez soigneusement le surnageant éthanolique dans une fiole volumique de 10 mL à l’aide d’une pipette Pasteur, évitant ainsi la perturbation des sédiments.
6. Ajoutez 3 mL supplémentaires d’éthanol à 60 % dans le tube contenant le résidu humide et solide.
7. Répétez les étapes de sonication et centrifugation décrites ci-dessus aux étapes 2.3 et 2.4.
8. Transférez le surnageant dans la même fiole volumétrique et combinez-le avec l’extrait précédent.
9. Effectuez une troisième extraction en répétant les étapes précédentes (2,6–2,8).
10. Acidulez l’extrait combiné (≈9 mL) avec deux gouttes de 0,1 mol/L HCl (afin d’augmenter la stabilité des anthocyanines et autres composés phénoliques) et portez le volume à 10 mL avec du méthanol.
11. Effectuez cette procédure en triple exemplaire pour chaque échantillon.

3. Teneur totale en flavonols et 5-hydroxyflavones (TFHC) par spectrophotométrie de microplaques

1. Préparez une solution de quercétine (100 μg/mL) ou un standard flavonoïde équivalent.
   1. Pèse 10 mg de quercétine avec une balance avec une précision de 0,1 mg.
   2. Dissoudre la quercétine dans environ 5 mL d’éthanol à 95 % et transférer la solution dans une fiole volumétrique de 10 mL marquée comme solution stock.
   3. Rincez le bécher deux fois avec 2 mL d’éthanol à 95 % et ajoutez les rinçages dans la fiole.
   4. Réduisez le volume à la cible avec 60 % d’éthanol.
   5. Préparez des solutions standard (10–100 μg/mL) et un blank dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL selon le tableau 1.
   6. Assurez-vous que tous les échantillons et étalons se situent dans une plage d’absorption de 0,2 à 0,8, en ajustant les concentrations si nécessaire.
   7. Préparez la disposition des microplaques en distribuant 60 μL de blanc, d’échantillon ou d’étalonnage dans chaque puits selon la Figure 1. Effectuez trois réplications par échantillon ou par standard.
   8. Distribuez des solutions aqueuses de 2 % de chlorure d’aluminium, 5 % d’acétate de sodium et 80 % de méthanol dans des réservoirs de réactifs séparés.
      REMARQUE : Manipulez avec soin le chlorure d’aluminium et les solutions méthanoloriques. Les solutions de chlorure d’aluminium sont irritantes, et le méthanol est toxique par ingestion, inhalation et absorption cutanée. Évitez le contact visuel et portez des EPI appropriés
   9. À l’aide d’une pipette multicanal à 8 canaux, ajoutez 10 μL de solution d’AlCl₃, 10 μL de solution d’acétate de sodium et 200 μL de méthanol à 80 % dans chaque puits.
   10. Secouez l’assiette à intensité intermédiaire pendant 10 secondes et laissez-la couver dans le noir pendant 30 minutes.
   11. Mesurez l’absorbance à 415 nm. Si le secouage n’est pas possible, mélangez manuellement avec une micropipette avant l’incubation (Figure 2).
   12. Interpolez les valeurs d’absorbance de l’échantillon à partir de la courbe d’étalonnage et appliquez les facteurs de dilution, de volume et de correction de masse selon les besoins.

Tableau 1 : Quantités d’étalons de quercétine pour la courbe d’étalonnage totale des flavonols et des 5-hydroxyflavones (TFHC). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 1 : Disposition des microplaques pour l’analyse totale des microplaques en flavonols et en 5-hydroxyflavones (TFHC). (A) Schéma des microplaques. (B) Logiciel Gen5 programme de mise en page. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Configuration logicielle des microplaques pour l’analyse totale du contenu des flavonols et des 5-hydroxyflavones. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

4. Teneur totale en polyphénoliques (TPC) par spectrophotométrie de microplaques

1. Préparez une courbe standard de l’acide gaulois (0,000–0,120 mg/mL).
   1. Pèser environ 0,0123 g d’acide gaul (pureté à 98 %) à l’aide d’une balance analytique et le dissoudre dans de l’eau distillée.
   2. Transférez la solution dans une fiole volumétrique de 10 mL, rincez deux fois, puis remplissez jusqu’à la marque d’eau distillée pour obtenir la solution de fond.
   3. Préparez une solution de travail en diluant 1 mL de la solution de base pour en faire 10 mL avec de l’eau distillée.
   4. Préparez des étalonnages en diluant davantage la solution de travail selon le tableau 2.
   5. Ajustez les concentrations si les valeurs d’absorbance dépassent la plage de 0,2 à 0,8.
   6. Préparez le réactif de travail Folin–Ciocalteu en diluant le réactif commercial 1:14 avec de l’eau distillée.
      REMARQUE : Le réactif de Folin–Ciocalteu et les solutions d’acide chlorhydrique sont corrosifs. Évitez les éclaboussures et le contact direct. Effectuer la manipulation des réactifs dans une hotte à fumées.
   7. Pipettez 30 μL de chaque échantillon, standard ou blank dans une microplaque à 96 puits en suivant la disposition de la Figure 3A, en utilisant trois réplications par échantillon.
   8. Ajoutez 215 μL de réactif de travail Folin–Ciocalteu à chaque puits à l’aide d’une pipette multicanal.
   9. Ajoutez 50 μL de solution de carbonate de sodium à 20 % dans chaque puits et mélangez soigneusement avec une micropipette.
   10. Incubez la plaque pendant 20 minutes à 40 °C avec agitation (Figure 3B).
   11. Mesurez l’absorbance à 755 nm.

Tableau 2 : Quantités d’étalons de l’acide gaulois pour la courbe d’étalonnage de la teneur en phénolique totale (TPC). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Figure 3 : Disposition des microplaques et configuration logicielle pour l’analyse des microplaques à contenu phénolique total (TPC). (A) Mise en page. (B) Programme logiciel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

5. Conditions générales utilisées pour l’analyse chromatgraphique en couche fine à haute performance

1. Courbes standard
   1. Préparez des solutions de quercétine et d’acide gaulique (100 μg/mL chacune) comme décrit ci-dessus dans les sections 3 et 4.
   2. Appliquez de l’acide gaulois sur six voies à des volumes de 2, 4, 6, 8, 10 et 12 μL.
   3. Appliquez 5 μL d’acide gaulique et de quercétine individuellement sur des voies séparées pour identification.
2. Disposition des plaques :
   1. Utilisez une plaque TLC en aluminium à dos de 10 × 20 cm de gel de silice de 60 °F₂₅₄ comme phase stationnaire.
   2. Réglez les paramètres d’application suivants : position Y 7,0 mm, longueur de bande 6,0 mm, première position X 14,0 mm, distance entre les pistes 9,4 mm.
   3. Appliquez 10 μL de chaque extrait par bande en utilisant de l’azote comme gaz de pulvérisation.
   4. Réglez la distance du front solvant à 70 mm.
3. Développement de la plaque :
   1. Développer des plaques dans une chambre manuelle contenant 40 mL de phase mobile, et laisser 10 minutes de saturation de la chambre à l’aide de papier filtre en contact avec la phase mobile et la paroi de la chambre pour aider les vapeurs de la phase mobile à saturer l’atmosphère de la chambre.
   2. Développer les plaques en utilisant soit MP1, soit MP2, en effectuant un double développement lorsque cela est nécessaire. Phase mobile 1 (MP1), composée d’acétate d’éthyle : acide formique : acide acétique : eau (100:11:11:26) ; et MP2 à base de toluène : acétate d’éthyle : acide formique (5:4:1).
      REMARQUE : Développer des plaques HPTLC dans une hotte à fumée. Les composants de la phase mobile (acétate d’éthyle, toluène, acide formique et acide acétique) sont volatils, tandis que le toluène ainsi que l’acétate d’éthyle sont hautement inflammables. Évitez l’inhalation de vapeur et éliminez les sources d’inflammation.
   3. Laissez les assiettes sécher à température ambiante.
4. Dérivatisation
   1. Les plaques de pulvérisation avec le réactif Folin–Ciocalteu (300 μL de réactif + 600 μL d’éthanol à 50 %), séchent brièvement avec un pistolet à air chaud, puis pulvérisent avec 1 mL de carbonate de sodium à 10 % dans 50 % d’éthanol.
   2. Par contre, vaporisez d’autres plaques avec du chlorure d’aluminium à 1 % dans 50 % d’éthanol.
5. Les plaques chauffantes sont uniformément avec un pistolet à air chaud jusqu’à ce que le développement des couleurs se stabilise et que les plaques soient complètement sèches.

6. Développement de l’analyse de la teneur en flavonols totaux et en 5-hydroxyflavones (TFHC) et de la teneur en phénoliques totaux (TPC) par chromatographie à couches fines haute performance

1. Appliquez des échantillons dans les voies tripliquées ainsi que dans les voies de référence de l’acide gaulois et de la quercétine (pour l’identification, comme décrit à l’étape 5.1.4).
2. Développez une plaque en utilisant MP1.
3. Développez à nouveau la plaque avec du MP2.
4. Dériviser la plaque à l’aide d’un réactif FC comme décrit précédemment.
5. Documentez la plaque en photo-documentant avec un éclairage blanc, ainsi que des UV à 254 nm et 366 nm.
6. Répétez la procédure, en remplaçant l’étape finale de dérivation d’AlCl₃ , comme montré à la Figure 4.

Figure 4 : Étapes VisionCats pour l’analyse des TPC et TFHC par HPTLC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Résultats

Conditions d’extraction
Le protocole d’extraction général décrit ici utilise 60 % d’éthanol, comme indiqué^{précédemment 22}. Lorsqu’on extrapole à d’autres sources végétales, les conditions d’extraction peuvent être optimisées en termes de polarité du solvant et du nombre de cycles. Une justification complète pour choisir à la fois le solvant et le nombre de cycles a été détaillée ailleurs¹⁶. La sélection du solvant peut être guidée par la littérature antérieure et les indices de polarité ; En général, des mélanges hydroalcoolisés d’éthanol ou de méthanol, ainsi que de l’acétone, sont recommandés. Le nombre optimal de cycles d’extraction (n) peut être évalué en divisant un volume total fixe de 10 mL en 1 à 5 cycles de 10/n mL, suivi d’un regroupement des extraits liquides. L’efficacité des différents numéros de cycles d’extraction est ensuite comparée statistiquement afin d’identifier la condition donnant la maxime d’absorption dans l’essai TPC.

Quantification des microplaques et HPTLC
Les courbes d’étalonnage standard pour le test de microplaques et l’analyse HPTLC sont présentées à la Figure 5. Pour la détermination de la teneur en phénoliques totale (TPC) par la méthode de microplaques de Folin–Ciocalteu et pour les plaques HPTLC dérivées avec le même réactif, des courbes d’étalonnage ont été établies en utilisant l’acide gaulique comme composé de référence. L’acide gaulois a été choisi non seulement parce qu’il est l’un des standards les plus couramment utilisés pour la quantification des TPC, mais aussi parce qu’il peut être élué sous les mêmes conditions de phase mobile appliquées aux échantillons de chaux et de mandarine. La quercétine a également été évaluée comme un standard potentiel pour le test HPTLC ; cependant, il s’est avéré inadapté à ce système chromatographique, car il coéluait avec le devant du solvant et ne pouvait pas être quantifié de manière fiable. Néanmoins, le TFHC a été déterminé en utilisant la quercétine comme norme de référence, puisque l’acide gaulique ne forme pas de complexe coloré avec le chlorure d’aluminium, étant donné qu’il ne s’agit ni d’un flavonol ni d’une 5-hydroxyflavone.

Figure 5 : Plaque HPTLC composée de chaux, mandarine, acide galique et quercétine développée séquentiellement avec MP1 suivie de MP2, et dérivée séparément avec des réactifs chlorure d’aluminium (AlCl₃) et Folin–Ciocalteu (FC). Le profil chromatographique après dérivatisation AlCl₃ est montré. Abréviations : FC, dérivation de Folin–Ciocalteu ; AlCl₃, dérivation du chlorure d’aluminium ; W, éclairage à lumière blanche ; 366, éclairage UV à 366 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Les résultats pour la teneur en phénolique totale (TPC) et la teneur totale en flavonoïdes et acides hydroxycinnamiques (TFHC) sont présentés dans le tableau 3. Comme prévu, les valeurs de TFHC étaient significativement inférieures aux valeurs TPC, environ cinq fois plus basses dans les échantillons de chaux et douze fois plus basses dans les échantillons de mandarine.

Tableau 3 : Résultats pour la teneur en phénolique totale de mandarine et de chaux par la méthode des microplaques. Abréviations : Abs : absorbance, CV : coefficient de variation, DF : facteur de dilution, GE : équivalents en acide gallique, IR : réplication indépendante, QE : équivalents quercétine, Rep : répétition, SD : écart-type, TFHC : flavonols totaux et composés 5-hydroxiflavone, TPC : teneur en phénolique totale, et moyenne . *Calculé sur la base de matière sèche. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

De même, les résultats obtenus à l’analyse HPTLC sont résumés dans le tableau 4. La séparation chromatographique permet de visualiser des bandes individuelles correspondant à des composés distincts. Quatre constituants phénoliques ont été détectés dans des échantillons de chaux et six dans des échantillons de mandarine. Aucune de ces bandes ne correspondait aux facteurs de rétention des standards de référence utilisés (acide gaulois et quercétine), ce qui est cohérent avec les attentes.

Tableau 4 : Les résultats pour la teneur phénolique totale et les bandes correspondant à AlCl₃ ont révélé des composés par HPTLC dérivés avec AlCl₃. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Le tableau 4 rapporte également la teneur en phénolique totale estimée à partir de l’analyse HPTLC, calculée comme la somme des composés individuels détectés chromatographiquement (analogue à la TPC). De plus, le tableau inclut le contenu cumulatif des bandes attribuées aux flavonols ou aux 5-hydroxyflavans (Rf = 0,46 et 0,62 en chaux ; aucune détectée en mandarine). Ces bandes apparaissaient jaunes après la dérivationisation avec AlCl₃ et présentaient une fluorescence jaunâtre sous une illumination UV de 366 nm. Cependant, aucune coloration visible n’a été observée avant la dérivé, comme le montre la Figure 5.

Pour l’analyse HPTLC, la dérivation Folin-Ciocalteu (FC) permet une détection complète des composés phénoliques, bien que des interférences mineures puissent survenir. De plus, la dérivationation du chlorure d’aluminium (AlCl₃) colore sélectivement un sous-ensemble de flavonoïdes. L’application combinée des deux réactifs améliore la normalisation des méthodes et atténue certaines des limites inhérentes à chaque approche. Il est à noter qu’il est improbable qu’un composé non flavonoïde présente à la fois la coloration bleue caractéristique sous FC et l’absorption jaune-rouge sous AlCl₃. De plus, les chromophores préexistants peuvent être exclus comme interférences s’ils sont visibles avec la même intensité avant la dérivation.

Comme montré à la Figure 5, l’extrait de chaux présentait deux bandes à Rf 0,62 et 0,46, qui n’étaient pas détectables sur la plaque non développée mais sont devenues clairement visibles après la dérivatisation de Folin–Ciocalteu (FC) et d’AlCl₃. Ce comportement soutient leur nature flavonoïde, correspondant possiblement à la néoériocitrine et à l’hépéridine²³. D’autres constituants phénoliques ont été observés à Rf 0,21 et 0,37 dans la chaux, et à Rf 0,36, 0,39, 0,42, 0,46, 0,54 et 0,89 en mandarine. Ces bandes étaient détectables après dérivation par FC mais pas après traitement avec AlCl₃, ce qui suggère qu’elles pourraient correspondre à des composés phénoliques non flavonoïdes. Selon la littérature, les principaux phénoliques non flavonoïdes rapportés dans la mandarine incluent l’acide chlorogénique et l’acide^{trans-férulique 24,25}. Dans la chaux, d’autres composés précédemment décrits incluent l’acide coumarique et l’acide dihydroxyférulique²³. Néanmoins, la confirmation de ces attributions nécessite une analyse avec des normes de référence supplémentaires.

Comparaison des phases mobiles HPTLC
Les deux phases mobiles ont été développées comme une modification des systèmes précédemment^{rapportés 26, 27, 28}. La phase mobile plus polaire (MP1, Figure 6A) a permis une séparation supérieure des constituants phénoliques par rapport à MP2. En revanche, la phase mobile moins polaire (MP2) (Figure 6B) a permis la conservation simultanée des composants de l’échantillon et des standards de référence au sein d’une même série chromatographique. Cependant, en conditions MP2, les valeurs Rf des constituants de l’échantillon étaient relativement faibles, certains composés restant proches de l’origine, comme montré à la Figure 6. Pour remédier à cette limitation, une procédure de double développement utilisant MP1 suivie de MP2 a été mise en place. Cette stratégie a permis une meilleure migration et résolution des composants de l’échantillon tout en permettant la quantification par rapport aux standards d’acide gaulique sur la même plaque dans des conditions chromatographiques identiques. La quercétine présentait une coloration jaune pâle avant le traitement à AlCl₃, qui s’est intensifiée après la dérivation. Pour les extraits de chaux et de mandarine, deux bandes distinctes ont été observées en plus d’une bande restant à l’origine. De plus, une bande jaune avec une valeur Rf de 0,14 est devenue clairement visible après la dérivatisation d’AlCl₃.

Figure 6 : Plaques HPTLC de chaux, mandarine, acide galique et quercétine développées avec la phase mobile 1 (A) et la phase mobile 2 (B). Pour chaque plaque, les pistes de gauche à droite correspondent à : des échantillons développés (non dérivés), dérivés de Folin–Ciocalteu et dérivés AlCl₃. La visualisation a été réalisée sous éclairage à lumière blanche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Discussion

La collecte et le stockage des échantillons sont des étapes cruciales pour garantir l’intégrité des analyses phytochimiques. Après la collecte, les échantillons doivent être transportés en conditions réfrigérées et lyophilisés dès que possible afin de minimiser la dégradation. Bien que les matériaux biologiques séchés soient généralement stables, les extraits en solution sont nettement plus labiles, même lorsqu’ils sont conservés en réfrigération. Par conséquent, les déterminations analytiques sont de préférence effectuées sur des extraits fraîchement préparés. Un stockage prolongé, même pendant quelques jours dans des conditions froides et à l’abri de la lumière, ou pendant quelques heures à température ambiante, peut entraîner des changements observables dans les profils chromatographiques, notamment des modifications de l’intensité des bandes et la formation de précipités. Ces changements sont généralement associés à des transformations chimiques telles que l’oxydation, l’hydrolyse ou les réactions de complexation. Par conséquent, tous les réactifs et extraits doivent être stockés et manipulés dans des conditions froides et sombres afin de préserver leur stabilité chimique.

En comparant les deux techniques (Tableau 3 et Tableau 4), des différences quantitatives systématiques sont évidentes. À la fois dans la chaux et la mandarine, les valeurs de TPC obtenues par le test de microplaques étaient environ trois fois supérieures à celles estimées par le HPTLC. En chaux, la TPC était de 74,2 mmol/g par microplaque contre 22,0 mmol/g DM par HPTLC, tandis que les valeurs de TFHC étaient respectivement de 15,5 mmol/g et 13,4 mmol/g. En mandarine, le TPC a atteint 72,8 mmol/g par microplaques contre 20,8 mmol/g par HPTLC. Pour le TFHC, la méthode des microplaques a donné 6,0 mmol/g, tandis qu’aucune bande correspondante n’a été détectée par le HPTLC.

Ces divergences peuvent s’expliquer par les limitations intrinsèques et les mécanismes de réponse de chaque méthode. Le test Folin–Ciocalteu (FC) est connu pour réagir non seulement avec des composés phénoliques mais aussi avec diverses substances réductrices non phénoliques, notamment l’acide ascorbique, la tyrosine, l’acide formique et^{l’acide acétique 29}, ainsi qu’avec d’autres réducteurs à faible poids moléculaire. Ces composés contribuent au signal spectrophotométrique global, ce qui peut conduire à une surestimation de la TPC. De plus, des constituants phénoliques mineurs peuvent collectivement augmenter l’absorption totale dans le test de microplaques, même si leurs concentrations individuelles sont trop faibles pour produire des bandes distinctes et quantifiables dans le HPTLC. Certains petits métabolites ou très polaires peuvent également ne pas être conservés, résolus ou visualisés dans les conditions chromatographiques employées.

Figure 7 : Représentation schématique des complexes AlCl₃ formés avec des flavonols et des 5-hydroxyflavones. (A) Flavonols et (B) 5-hydroxyflavones. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Les différences méthodologiques dans la chimie de détection contribuent également aux variations observées. La réaction FC produit une augmentation substantielle de l’absorbance due à la réduction du réactif, ce qui entraîne une sensibilité analytique élevée. En revanche, la méthode AlCl₃ est relativement non spécifique et repose sur la formation complexe avec certains flavonoïdes. Les flavonols présentent généralement une absorption maximale autour de 410 nm, tandis que les 5-hydroxyflavones absorbent près de 440^{nm 18}, et leurs complexes avec Al³⁺ sont illustrés à la Figure 7. Cependant, l’augmentation de l’absorption après complexation est relativement modeste, rendant le test AlCl₃ plus susceptible aux interférences des composants de la matrice colorée, y compris les flavonoïdes eux-mêmes.

Malgré ces limitations, l’utilisation combinée de la dérivatisation FC et AlCl₃ dans le HPTLC représente une stratégie complémentaire puissante pour l’analyse phénolique. Cette approche associe la haute sensibilité de la réaction FC à la discrimination structurelle fournie par la complexation AlCl₃ et la séparation chromatographique. De plus, plusieurs flavonols sont connus pour présenter des bandes jaunâtres caractéristiques sous l’éclairage UV³⁰, ce qui soutient la classification et la confirmation des composés.

Les méthodes de microplaques sont particulièrement avantageuses pour le criblage à haut débit. Ils nécessitent une préparation minimale des échantillons, une faible consommation de réactifs et permettent l’analyse simultanée de dizaines d’échantillons. Dans des conditions de laboratoire typiques, un test complet sur microplaques peut être réalisé en environ 4 heures en utilisant des instruments largement disponibles. Ces caractéristiques rendent les essais sur microplaques très adaptés aux études comparatives rapides, au contrôle qualité de routine et à l’évaluation préliminaire de grands ensembles d’échantillons. En revanche, le HPTLC demande plus de temps et de travail, avec un flux de travail analytique complet nécessitant généralement 7 à 8 heures. Elle repose également sur des instruments spécialisés qui ne sont pas disponibles dans tous les laboratoires, et l’utilisation de plaques dédiées et de réactifs de dérivatisation augmente le coût par analyse. Une autre limitation est que les métabolites présents à très faibles concentrations peuvent rester indétectables dans des conditions de visualisation standard. Cependant, ces limitations pratiques et liées à la sensibilité sont compensées par l’avantage clé de la séparation^{chromatographique 30,31}. Le HPTLC permet la résolution de constituants individuels dans des matrices végétales complexes, la confirmation de réponses authentiques au test et la détection de composés potentiellement interférents. De plus, la dérivatisation sélective post-chromatographique permet une classification simple des composés en groupes fonctionnels (par exemple, flavonols et 5-hydroxyflavones), renforçant ainsi l’interprétation chimique au-delà de l’estimation totale du contenu.

Ainsi, dans les études à grande échelle, le flux de travail analytique peut commencer par des analyses de microplaques pour identifier rapidement des échantillons présentant des niveaux élevés de composés cibles. Des échantillons sélectionnés peuvent ensuite être soumis à une analyse HPTLC pour visualiser des constituants individuels, évaluer la sélectivité et évaluer les interférences possibles par dérivéisation duale. Cette stratégie intégrée (illustrée à la Figure 8) combine vitesse et débit avec spécificité chimique et compréhension structurelle.

Figure 8 : Flux de travail proposé pour le dépistage et l’analyse des échantillons. (A) Criblage micro-plaque à haut débit d’un grand lot d’échantillons. (B) Analyse HPTLC d’échantillons sélectionnés pour la quantification utilisant la méthode de Folin–Ciocalteu et pour l’identification des flavonols et des 5-hydroxyflavones par dérivation de l’AlCl₃. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Comparé à la HPTLC, la HPLC couplée à la spectrométrie de masse haute résolution (HPLC–HRMS) — l’alternative la plus courante rapportée dans la littérature — offre une sensibilité inégalée et une identification structurelle sans ambiguïté des composés^{individuels 32}. Néanmoins, les analyses HPLC–HRMS sont intrinsèquement plus lentes, car chaque cycle chromatographique doit être effectué séquentiellement, et elles impliquent des coûts beaucoup plus élevés liés à l’instrumentation, aux exigences de pureté des solvants et à la consommation de solvants. De plus, le criblage en classes fonctionnelles nécessite souvent un traitement complexe des données et une interprétation spécifique aux composés, tandis que le HPTLC permet un regroupement visuel direct des composés après dérivation. Par conséquent, le HPTLC représente une plateforme intermédiaire efficace entre le criblage rapide des microplaques et l’analyse complète HPLC–MS, équilibrant débit, coût et sélectivité chimique.

L’analyse des flavonoïdes et des phénoliques a de nombreuses applications dans les domaines des sciences alimentaires, des nutraceutiques, des produits pharmaceutiques, de l’agriculture et de la recherche sur les matériaux. En science alimentaire, il est utilisé pour évaluer la capacité antioxydante, l’authenticité, la durée de conservation et le contrôle qualité de produits tels que les jus, vins et thés, ainsi que pour soutenir des études agronomiques, notamment la détermination du temps optimal de récolte basé sur la maturité^{phénolique 33}. Dans le secteur nutraceutique, le profilage phénolique est essentiel pour la standardisation et l’assurance qualité des extraits botaniques et des produits commerciaux tels que les capsules d’extrait de thé vert, les compléments d’extrait de graines de raisin, les comprimés de quercétine et les formulations de bioflavonoïdes d’agrumes. Dans la recherche pharmaceutique et biomédicale, ces analyses soutiennent le dépistage de composés bioactifs présentant un potentiel antioxydant, anti-inflammatoire et^{antimicrobien 6}. En agriculture et en physiologie végétale, la détermination phénolique aide à évaluer les réponses au stress des plantes et à orienter les stratégies d’amélioration des cultures. De plus, en science des matériaux — notamment dans les études sur les inhibiteurs de corrosion d’origine^{végétale 34,35} — la caractérisation phénollique aide à corréler la composition chimique avec le comportement d’adsorption et l’efficacité protectrice.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes Eppendorf de 1,5 mL	Eppendorf
Flasques volumétriques de 10 mL	Eisco Labs	CH0451B	10/19 Tapon en polypropylène, verre borosilicate, ambre - Marque blanche de graduation, tolérance et plusmn ; 0,025 ml  ;
100 & micro ; L et 1000 & micro ; Pointes en micropipette en L	générique
100&ndash ; 1000 & micro ; Micropipette en L	Eppendorf	Research Plus
10&ndash ; 100 & micro ; Micropipette en L	Eppendorf	Research Plus
Tubes en verre à bouchon de 15 mL	générique
Béchers de 50 mL	générique
Micropippette multicanal à 8 canaux	ThermoSciecntific
Microplaques à 96 puits	Greiner	655891	Polyciclooléfine, fond en verre, noir
Bilan analytique & nbsp ;			± ; 0,0001 g
Échantillonneur TLC automatique	CAMAG	ATS4
Centrifugeuse	ThermoSciecntific	Sorvall ST8R	&ge ; 850 et fois ; g
Papier filtre  ;	Whatman		Pour la saturation de chambre
Lyophilisateur	LABCONCO	Modèle 10
Réservoirs de réactifs plastiques	Eppendorf
Spatule à extrémité plate et extrémité cuillère	Merck Chemicals	HS15906
Lecteur de microplaques multi-détection Synergy HT	BioTek Instruments	Synergie HT
Plaques en gel de silice TLC 60 F254 à dos en aluminium (10 et fois 20 cm)	Merck
Pulvérisateur TLC	Sigma-Aldrich		20 mL
Visualiseur TLC	CAMAG	2
Baignoire/nettoyage à ultrasons	Creworks	ZX-040	avec un contrôle de température à 40 °F ; C
Agneau UV	UPV	UVGL-58
Logiciel VisionCATS	CAMAG
Sacs zip-lock	Générique		1/4 de gallon