Article de méthode

Profilage phénotypique des phénotypes comportementaux de type parkinsonien induits par le MPTP chez les larves de poisson-zèbre basé sur une expérience comportementale

DOI :

10.3791/70041

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15 mai 2026

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1Department of Medicinal Chemistry, State Key Laboratory of Discovery and Utilization of Functional Components in Traditional Chinese Medicine, Key Laboratory of Chemical Biology (Ministry of Education), NMPA Key Laboratory for Technology Research and Evaluation of Drug Products, School of Pharmaceutical Sciences, Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 2College of Information Engineering, Ningde Normal University, 3Digital Fujian Research Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing, 4Department of Neurology, Qilu Hospital Cheeloo College of Medicine, Shandong University, 5Key Laboratory of Bioactive Materials, Ministry of Education, Nankai University, 6Jinan Microecological Biomedicine Shandong Laboratory

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole établit un paradigme de phénotypage comportemental chez les larves de poisson-zèbre traitées par MPTP afin d’évaluer les déficits moteurs et non moteurs similaires à la maladie de Parkinson.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article présente un protocole unique de phénotypage comportemental multiparamétrique pour la maladie de Parkinson (MPP) induite par MPTP chez les larves de poisson-zèbre. L’induction chimique de pathologies de type DP chez le poisson-zèbre fournit un système à haut débit et génétiquement manipulable, pourtant la plupart des études se sont concentrées étroitement sur des tests locomoteurs de base ou des transitions simples, lumière-obscurité. Ces approches limitées ne parviennent pas à couvrir le spectre plus large des dysfonctionnements liés à la MP, allant de la bradykinésie et des déficits sensorimoteurs aux comportements anxieux et aux troubles du sommeil. Pour combler cette lacune, cette étude a développé une batterie intégrée de 6 tests complémentaires : essai locomoteur pour évaluer la locomotorie générale et la transmission exploratoire ; évaluation de thigmotaxie pour détecter les comportements liés à l’anxiété et la préférence des bords ; test de réponse au sursaut pour enregistrer la bradykinésie et la réactivité motrice altérée ; des tests de défis lumière-obscurité pour évaluer la prise de risques et la réactivité au stress ; des paradigmes de réponse photomotrice (y compris la stimulation à la lumière stroboscopique) pour quantifier le mouvement sensorimoteur et réflexe ; et la surveillance de la régulation sommeil-éveil pour mesurer le comportement sommeil-éveil. Les larves de poisson-zèbre sont exposées à des concentrations sublétales de MPTP de 1 jour après la fécondation (dpf) à 5 dpf, avec des évaluations comportementales initiées de 4 à 6 dpf. Le suivi automatisé haute résolution génère plusieurs points de terminaison comportementaux par essai. Cette approche met en lumière des altérations similaires à la MP jusque-là non détectées, telles qu’une architecture du sommeil désordonnée, un apprentissage d’habituation altéré, des mouvements sensorimoteurs et réflexes, reflétant des symptômes non moteurs précoces. En combinant ces tests, les chercheurs obtiennent un symptôme comportemental complet qui reflète de plus près la complexité de la MP humaine. Ce protocole élargit le paradigme pour l’étude de la pathogenèse de la MP, le dépistage des traitements candidats et l’exploration des modulateurs environnementaux. Elle illustre l’objectif de la collection de présenter des modèles animaux innovants qui renforcent la pertinence translationnelle grâce à un phénotypage robuste et multifacette.

Introduction

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La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative la plus répandue après la maladied’Alzheimer 1. Sa prévalence et le nombre de personnes touchées ont augmenté régulièrement ces dernières années, posant un défi important pour la santé publiqueà l’échelle mondiale 2. Le taux d’incidence de la MP augmente notablement à l’âgede 3,4 ans. Cliniquement, la MP se manifeste à la fois par des symptômes moteurs — tels que la dyskinésie, la bradicinésie, le tremblement au repos et l’instabilité posturale — ainsi que par une variété de symptômes non moteurs, notamment des troubles cognitifs, de l’anxiété et des troubles dusommeil 5. Actuellement, le diagnostic de MP dépend principalement de la présence de symptômes moteurs6 ; Cependant, lorsque ces symptômes deviennent apparents, plus de 60 % des neurones dopaminergiques de la substance noire ont déjà étéperdus. Bien que les symptômes non moteurs apparaissent fréquemment plus tôt, l’absence de critères d’évaluation spécifiques et objectifs complique le diagnostic précoce et l’intervention8. Actuellement, le traitement principal de la MP consiste à administrer de lalévodopa 9, qui est convertie en dopamine dans le cerveau, reconstituant ainsi les niveaux de dopamine dans le striatum. Bien que ce traitement puisse temporairement soulager les symptômes, il n’arrête pas la progression de la maladie10. Par conséquent, des recherches approfondies sur la pathogenèse de la MP et le dépistage de drogues sont essentielles.

La construction de modèles animaux appropriés est cruciale pour la recherche sur la pathogenèse de la MP et le dépistage des médicaments anti-. Il existe maintenant trois principaux modèles pour les études sur la MP : modèle d’inductionchimique 11, modèled’édition génétique 12 et modèle de xénotransplantationhumaine 13. Les animaux modèles couramment utilisés incluent les rongeurs, comme la souris14, et les primates non humains comme lessinges 15. Récemment, les poissons-zèbres (Danio rerio) ont attiré une attention croissante dans les études sur la DP pour leurs avantages tels que leur petite taille, leur croissance rapide, une forte homologie génétique avec l’humain et la transparencedes embryons 16. L’utilisation de la neurotoxine MPTP (1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine) pour induire des lésions des neuronesdopaminergiques 17,18 est une méthode classique pour construire un modèle de DP. Les poissons-zèbres exposés à des concentrations sublétales de MPTP présentent divers phénotypes comportementaux similaires à la DP19.

Cependant, la plupart des études actuelles sur la DP sur le poisson zèbre se concentrent principalement sur les comportements locomoteurs de base ou les transitions simples,lumière-obscurité 16,20, et les tests comportementaux unidimensionnels sont difficiles à refléter pleinement les caractéristiques comportementales complexes de la MP, en particulier les changements comportementaux des fonctions non motrices. Considérant que la MP est une maladie impliquant plusieurs systèmes neurocomportementaux au-delà du contrôle moteur 21,22,23, une méthode d’évaluation comportementale multiparamétrique du phénotype est urgemment nécessaire pour capturer ses phénotypes multisystémiques 24.

En conséquence, cette étude construit un protocole de phénotypage comportemental multiple et rapide afin de décrire de manière plus complète les phénotypes comportementaux de type chez les larves de poisson-zèbre traitées avec MPTP. Une dose sublétale de MPTP (50 μM)25 a été appliquée aux larves de 1 à 5 jours après la fécondation (dpf)16,20,26. De 4 à 6 dpf16, 20, 24, nous avons réalisé 6 tests comportementaux : surveillance de la régulation sommeil-veille, paradigmes de réponse photomotrice, évaluation de thigmotaxie, évaluation locomotrice, test de réponse au sursaut et tests de défi lumière-obscurité. Ces évaluations comportementales couvrent à la fois les aspects moteurs et non moteurs, tels que les déficits de mouvement, les capacités sensorimotrices, l’apprentissage par habituation, la prise de risques, la réactivité au stress et le rythme sommeil-éveil.

En utilisant le système de suivi vidéo à haut débit Zebrabox et la méthode d’analyse quantitative, nous avons extrait et quantifié divers paramètres comportementaux et comparé les différences comportementales entre le groupe traité par MPTP et le groupe de type sauvage (WT) par des statistiques. Comparée aux tests existants sur la du poisson-zèbre, cette batterie comportementale multiparamétrique capture les phénotypes moteurs et non moteurs dans un cadre standardisé. Le système de suivi automatisé garantit une acquisition objective de données comportementales et une grande reproductibilité. De plus, la petite taille corporelle des larves permet de placer des animaux individuels dans des plaques à plusieurs puits, permettant une évaluation à haut débit. Les avantages ci-dessus sont bénéfiques pour analyser en profondeur le mécanisme pathologique de la MP, dépister les médicaments ou composés candidats, et explorer l’influence des facteurs environnementaux sur l’apparition ou le développement de la MP.

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Protocole

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Cette étude portant sur le poisson-zèbre a été réalisée conformément aux directives institutionnelles pour le soin et l’utilisation des animaux, et a été approuvée par le Comité d’éthique de l’École des sciences pharmaceutiques de l’Université du Shandong (n°YXDW2025-0056). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation au MPTP

  1. Préparez 1× milieu E3 en diluant 100× solution d’origine E3 1:100 avec de l’eau ultrapure (par exemple, mélangez 5 mL de 100× E3 avec 495 mL d’eau ultrapure pour obtenir 500 mL de milieu 1× E3).
    REMARQUE : Préparez E3 moyen fraîchement le jour de l’utilisation.
  2. Préparez une solution MPTP de 1 mM en ajoutant 5,0 mg de poudre MPTP dans un tube centrifugeuse de 50 mL et en ajoutant un milieu E3 à un volume final de 25 mL (utilisez le tube centrifugeuse comme récipient de mélange, mais aucune centrifugation n’est requise). Étiquetez la solution comme une solution MPTP d’origine 1 mM. Conservez la solution d’origine dans le noir.
  3. Préparation de la solution MPTP de 50 μM : transférer 2,5 mL de la solution stock de MPTP de 1 mM dans un récipient propre et diluer avec 47,5 mL de milieu E3 pour obtenir un volume final de 50 mL à une concentration finale de 50 μM MPTP. La partie restante de la solution d’origine continuait d’être stockée dans l’obscurité.
    ATTENTION : Le MPTP est une neurotoxine puissante et doit être manipulée avec une extrême prudence. Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection. Élimination des déchets MPTP conformément aux directives institutionnelles de biosécurité.

2. Préparation et regroupement des embryons de poisson-zèbre

  1. Sélectionnez des poissons-zèbres adultes mâles et femelles adultes sexuellement matures et effectuez une reproduction contrôlée à l’aide d’aquariums de reproduction avec séparateurs amovibles. À 20h00, placez séparément les poissons-zèbres mâles et femelles dans les aquariums de reproduction au ratio de 2:3, puis séparez-les avec des séparateurs.
  2. Le lendemain, retirez les séparateurs à 8h00 pour permettre l’accouplement, ce qui initie la fraie. Prélever les embryons après 1 heure, puis les laver trois fois avec de l’eau propre du système.
  3. Héberge les embryons dans des boîtes de Petri de 100 mm avec un milieu E3 frais, et les incube à 28 °C dans un cycle de 14 heures de lumière / 10 heures d’obscurité (lumières allumées de 08h00 à 22h00).
    REMARQUE : Ne pas dépasser 50 embryons par plat contenant un milieu de 20 mL pour assurer un développement normal.
  4. À 1 dpf, retirez soigneusement les embryons non fécondés, malformés et anormaux à l’aide d’une pipette Pasteur, puis remplacez la solution contenant des embryons de poisson-zèbre. Pour le groupe WT, remplacez le milieu existant par un milieu embryonnaire E3 frais. Pour le groupe traité par MPTP, remplacer le milieu par une solution MPTP à 50 μM (Figure 1A), puis renvoyer les deux groupes dans l’incubateur.
  5. Pour les deux groupes, replacez la solution et retirez tous les embryons morts ou en mauvaise santé toutes les 24 heures. Pour le groupe traité par MPTP, remplacer la solution de MPTP quotidiennement du matin de 1 dpf jusqu’au matin de 4 dpf (Figure 1A). Ensuite, il faut passer le groupe traité au MPTP vers un milieu E3 à partir du matin de 5 dpf jusqu’à la fin de l’expérience.
    REMARQUE : Remplacez doucement la solution à l’aide d’une pipette Pasteur. Aspirez lentement le milieu depuis le bord de la boîte de Petri et ajoutez une solution fraîche le long de la paroi de la boîte de Petri pour minimiser les perturbations des embryons.

3. Surveillance de la régulation du sommeil et de l’éveil

  1. À 4 dpf, sélectionnez les larves de poisson-zèbre de chaque groupe à 18h00, puis transférez-les sur une plaque à 96 puits à l’aide d’une pipette Pasteur modifiée de 3 mL avec la pointe coupée, une larve par puits (Figure 1B). Les quatre premières rangées représentent les groupes WT, et les quatre dernières rangées représentent les groupes MPTP (48 poissons-zèbres dans chaque groupe).
    REMARQUE : Pour éviter de stimuler ou d’endommager le poisson-zèbre, modifiez les pipettes Pasteur en coupant la pointe (10 mm) pour obtenir un large calibre supérieur à celui de 4 larves de poisson-zèbre dpf (la longueur du corps dépasse 3,7mm 27,28).
  2. Observez chaque puits avec un microscope stéréoscopique pour vous assurer que l’apparence de chaque larve de poisson-zèbre est saine, que les nageoires sont ouvertes et régulièrement tournées, que le corps est droit et que la vessie natatoire estgonflée à 29. Après avoir vérifié que les poissons-zèbres de chaque puits sont en bon état, remplissez chaque puits avec un milieu E3.
    REMARQUE : Remplissez chaque puits avec de l’E3 en proche de la promontion, en veillant à maintenir la tension de surface. Ajoutez soigneusement le liquide pour éviter les bulles et les débordements de puits en croisière.
  3. Après avoir transféré le poisson et le liquide dans une plaque à 96 puits, placez-le dans la chambre Zebrabox pour s’acclimater pendant 30 minutes avant le test comportemental sommeil-éveil.
    REMARQUE : Avant de placer la plaque à 96 puits dans la chambre Zebrabox, nettoyez soigneusement le bas de la plaque afin d’éviter que la saleté n’affecte les résultats du suivi vidéo.
  4. Ouvrez le logiciel de suivi vidéo Zebralab, sélectionnez le mode Quantification , et assurez-vous que la plaque à 96 puits est positionnée centralement au fond de la chambre Zebrabox.
  5. Réglez le réglage de la lumière pour éteindre la lumière à 22h00 et allumer la lumière à 8h00, ce qui correspond aux conditions de lumière lors de l’élevage du poisson-zèbre. Pendant la journée, la lumière blanche est généralement autour de 1000 lux. Définir les paramètres logiciels commesuit : 29 : seuil de détection, 40 ; rafale, 25 (seuil pour le déplacement) ; gel (seuil pour le mouvement), 4 ; taille du bac, 60 s ; Temps total de surveillance, 52 h (20h00 le premier jour jusqu’à 00h00 le troisième jour). Commencez la procédure de veille et de sommeil à 20h00.
    REMARQUE : Une fois la procédure commencée, interdisez tout bruit et vibration extérieurs pendant toute l’expérience, afin de ne pas affecter le rythme normale sommeil-éveil des poissons-zèbres. Pour éviter l’évaporation de l’eau lors d’un suivi à long terme, couvrez la plaque à 96 puits d’un film plastique transparent.
  6. Après 52 heures, arrêtez l’expérience veille-sommeil et enregistrez le fichier de données. Retirez la plaque à 96 puits du ZebraBox.
    REMARQUE : En utilisant MATLAB et Excel, paramètres nécessaires tels que le nombre de périodes de sommeil (les périodes de sommeil sont définies comme des périodes d’inactivité d’au moins 1 minute)29, la durée moyenne des périodes de sommeil (durée moyenne des périodes de sommeil), la durée totale du sommeil (toutes les périodes de sommeil sur la période de surveillance), la latence du sommeil (le temps entre une transition légère et le début du premier sommeil), l’activité moyenne (définie comme l’activité locomotrice pendant toute la période de surveillance) et l’activité éveillée (définie comme l’activité locomotrice pendant la période d’éveil uniquement, hors périodes de sommeil) ont été extraites et analysées du fichier de données.
    1. Utilisez un test t d’Étudiant pour comparer les différences entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. De plus, tracez la courbe du sommeil, la courbe d’activité éveillée et la courbe d’activité moyenne des poissons-zèbres sur les 52 heures à l’aide du logiciel MATLAB.

4. Paradigmes de réponse photomotrice

REMARQUE : Les paradigmes de réponse photomotrice (y compris la lumière stroboscopique) sont des tests comportementaux à haut débit chez 5 larves dpf visant à quantifier les changements locomoteurs sensorimoteurs et réflexifs en réponse à une transition soudaine de la lumière. Ce test a été réalisé à l’aide d’une plaque à 96 puits, comprenant 2 paradigmes : (1) une transition lumineuse d’une minute d’obscurité à une minute de lumière constante (1000 lx), et (2) une réponse à la lumière stroboscopique impliquant une transition de 1 minute d’obscurité à 1 minute de lumière stroboscopique à 10 Hz.

  1. Placez les 5 larves de dpf dans une plaque de 96 puits (1 larve par puits) (Figure 1B), et remplissez chaque puits avec un milieu E3. Divisez un total de 96 larves en groupe WT et groupe MPTP en moyenne.
  2. Paradigme de lumière sombre-constante :
    1. Placez la plaque à 96 puits avec 5 larves de dpf dans le Zebrabox et laissez les larves s’acclimater pendant 5 minutes dans l’obscurité avant le test.
    2. Ouvrez le mode Suivi - analyse en ligne.
    3. Définissez le programme de transition de la lumière comme suit : 0-60 s : Sombre, 60-120 s : Lumière constante (1000 lx).
    4. Démarrez le protocole, collectez les paramètres de mouvement correspondants tous les 6 secondes tout au long du test de 120 secondes.
    5. Arrêtez le protocole à 120s, exportez le fichier de données. Placez les larves dans l’obscurité totale pendant 5 minutes pour s’acclimater à l’environnement, en les préparant au test suivant à la lumière stroboscopique.
  3. Paradigme de lumière à strobe sombre :
    1. Réglez le programme de transition lumineuse comme suit : 0-60 s : sombre, 60-120 s : lumière stroboscopique (1000 lx) à 10 Hz.
      REMARQUE : Un stroboscope de 10 Hz correspond à 10 impulsions lumineuses par seconde. Dans ZebraLab, appliquez cela en alternant l’intensité lumineuse de 0 à 1000 lx tous les 100 ms.
    2. Après avoir terminé l’adaptation sombre de 5 minutes, commencez le test de la lumière sombre vers stroboscopique. Collectez les paramètres de mouvement tous les 6 secondes tout au long de l’essai de 120 secondes.
  4. Analyse des données : Une fois l’essai terminé, exportez le fichier de données. Utilisez le logiciel MATLAB pour extraire la distance de nage tous les 6 secondes. Tracez la distance totale (valeur moyenne par 6 secondes) nagée dans la période de 2 minutes pour les deux tests. Calculez l’indice de gel en soustrayant la distance totale parcourue en 1 minute dans le noir de la distance totale parcourue enlumière 30.
    REMARQUE : L’indice de gel < 0 indique un comportement de gel ; L’indice de gel > 0 indique une fuite ; Indice de gel = 0 signifie aucune réaction. Utilisez un test t de l’élève et une ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. Un total de 48 larves de poisson-zèbre (n = 48) ont été utilisées pour chaque groupe.

5. Évaluation de la thigmotaxie

  1. Sélectionnez deux plaques à 6 puits, remplissez chaque puits avec un medium E3 de 4 mL.
  2. À 5 dpf, des larves de poisson-zèbre du groupe WT et du groupe traité par MPTP ont été collectées et placées dans deux plaques à 6 puits (l’une est le groupe WT, l’autre le groupe traité par MPTP, 1 larve par puits) (Figure 1C).
    REMARQUE : Assurez-vous que la position initiale des larves est au centre des puits.
  3. Avant l’évaluation de la thigmotaxie, les plaques du puits doivent être placées à la position appropriée de Zebrabox 15 minutes à l’avance pour s’adapter.
  4. Collecte et analyse des données : En utilisant la fonction de zone de tirage , dessinez deux cercles concentriques dans la zone d’observation de chaque puits (le rayon du cercle central représente la moitié du rayon du trou) (Figure 1C), et les paramètres restants sont réglés pour être identiques à l’évaluation locomotrice. Commence le protocole pour une évaluation de thigmotaxie de 5 minutes, puis fais une expérience parallèle.
    REMARQUE : Après la fin du programme, le logiciel Zebralab génère la trajectoire des larves de poisson-zèbre en 5 minutes ainsi que divers paramètres de mouvement associés. Dans le fichier de données, an1 représente toute la surface de chaque puits, et an2 représente la zone intérieure de chaque puits. Ainsi, dis(an1) et dur(an1 total) désignent la distance totale de nage et le temps total passé dans l’ensemble du puits, tandis que dis(an2) et dur(an2) total, respectivement représentent la distance et le temps passés dans la zone intérieure.
    1. Calculez la thigmotaxe avec les formules suivantes :
      Calculez le pourcentage de distance nagée dans la zone extérieure :
      figure-protocol-1
      Calculez le pourcentage de temps passé dans la zone extérieure :
      figure-protocol-2
    2. Utilisez un test t d’Étudiant pour comparer les différences de thigmotaxie entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. Un total de 24 larves de poisson-zèbre (n = 24) ont été utilisées pour chaque groupe.

6. Évaluation locomotorie

  1. À 5 dpf, sélectionnez les larves de poisson-zèbre du groupe WT et du groupe traité par MPTP, puis transférez respectivement sur deux plaques à 12 puits (l’une est le groupe WT, l’autre le groupe traité par MPTP, 1 larve par puits, avec 2 mL de milieu E3) (Figure 1D).
    REMARQUE : Assurez-vous que les tailles des larves de poisson-zèbre sont similaires, et les larves sélectionnées doivent avoir des nageoires ouvertes, une posture droite, une bonne expansion de la vessie natatoire et des mouvements réguliers.
  2. Avant l’évaluation locomotrice, placez la plaque de puits en position d’essai du Zebrabox 15 minutes à l’avance pour l’adapter.
    REMARQUE : Veillez à ce que les conditions lumineuses lors de l’adaptation soient cohérentes avec celles du test.
  3. Après une période d’acclimatation de 15 minutes, sélectionnez l’analyse en ligne en mode de suivi, enregistrez l’activité locomotrice de chaque larve pendant 5 minutes à l’aide d’un système automatisé informatisé de suivi vidéo. En utilisant le logiciel Zebralab pour collecter les pistes de mouvement et divers paramètres locomoteurs associés tous les 60 s, exportez le fichier de données complet, et utilisez MATLAB pour analyser la distance totale et la vitesse moyenne de chaque larve en 5 minutes.
    1. Utilisez un test t de l’élève et une ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. Un total de 24 larves de poisson-zèbre (n = 24) ont été utilisées pour chaque groupe.

7. Test de réponse à la sursaute

REMARQUE : Ce test mesure la réponse visuelle au sursaut (VSR), également appelée sursaut induit par un éclair sombre, provoquée par des transitions soudaines vers l’obscurité. Ce test de réponse au sursaut évalue un sursaut visuel évoqué par la photique, induit par des éclairs sombres soudains à l’échelle de la milliseconde. Contrairement au paradigme de la lumière stroboscopique, qui implique des impulsions lumineuses répétées pour évaluer des réponses comportementales soutenues, ce test se concentre sur des réactions motrices rapides et réflexives à un stimulus visuel aigu.

  1. Préparations : à 5 DPF, sélectionnez les larves de poisson-zèbre du groupe WT et du groupe traité par MPTP, et transférez-les respectivement sur deux plaques à 12 puits (l’une est le groupe WT, l’autre le groupe traité par MPTP, 1 larve par puits, avec un milieu E3 de 2 mL) (Figure 1D).
  2. Avant le test de réponse au sursaut, placez la plaque de puits en position d’essai du Zebrabox 5 minutes à l’avance pour l’adapter.
  3. Définir les paramètres de stimulation : ouvrir le logiciel Zebralab , exécuter le mode d’analyse en ligne Tracking , ouvrir l’interface de déclenchement de lumière , sélectionner Utiliser l’une des 3 méthodes de déclenchement ci-dessous, activer les stimuli améliorés, régler sur Quand la session est lancée ; Dans le calendrier de transition, le rythme de flash sombre est défini comme suit (le programme commence à se déclencher après 21 s) : Transition 1 : 5 ms, intensité lumineuse à 100 % ; transition 2 : 2890 ms, intensité lumineuse à 100 % ; transition 3 : 5 ms, 0 % d’intensité lumineuse ; transition 4 : 100 ms, 0 % d’intensité lumineuse ; cochez Répéter la liste des transitions pour garantir des clignotements périodiques.
  4. Protocole de démarrage : assurez-vous que la fonction d’enregistrement vidéo Numeriscope est activée, le suivi automatisé à haut débit générera un jeu de données multidimensionnel englobant 30 points comportementaux dans ce test des années 90.
  5. Analyse des données : Après avoir terminé l’essai de réponse au sursaut, exportez les fichiers bruts et importez-les dans le logiciel MATLAB pour analyse. Calculez la distance de nage de chaque larve par intervalles de 3 secondes, ainsi que la vitesse moyenne de nage.
    1. Identifier la distance maximale de mouvement, la vitesse maximale ou la latence de réponse suivant le stimulus flash pour chaque groupe. Utilisez un test t de l’élève et une ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. Un total de 24 larves de poisson-zèbre (n = 24) ont été utilisées pour chaque groupe.

8. Essai de défi clair-obscur

  1. À 5 dpf, transférez les larves de poisson-zèbre individuellement dans deux plaques de 24 puits (Figure 1E), avec une larve par puits et 1 mL de milieu E3 par puits. Chaque plaque contenait 24 larves, et les deux plaques à 24 puits étaient réparties équitablement en groupe WT et groupe traité par MPTP (n = 24 par groupe).
  2. Avant le test, placez la plaque à 24 puits dans la zone de test désignée à l’intérieur du Zebrabox pour une période d’acclimatation à la lumière de 5 minutes afin d’adapter l’environnement de test. Activez le mode Suivi - Analyse en ligne. Configurez le programme d’éclairage comme suit : 6 minutes de lumière constante suivies de 4 minutes d’obscurité totale (Figure 1E). Le temps total de test est de 10 minutes, et le temps d’intervalle pour collecter les points de données est de 60 s.
    REMARQUE : Les 6 minutes globales de lumière servent à l’acclimatation et à l’habituation, garantissant une locomotorie de base stable et des réponses spécialeslumière-obscurité 31,32.
  3. À la10e minute, arrêtez l’enregistrement comportemental et la sauvegarde des données. Retirez soigneusement l’assiette de la boîte à zèbres.
  4. Pour chaque larve, extraire la distance de nage à chaque intervalle de 60 s. Calculez la distance parcourue pendant la phase lumineuse (0-6e minute), la phase sombre (7-10e minute) et la période totale de 10 minutes. Quantifiez la performance du comportement thigmotaxique et de l’apprentissage par habituation dans la phase sombre.
    REMARQUE : L’apprentissage par habituation est défini comme la réduction d’une réponse comportementale lorsqu’un animal est exposé à un stimulus/environnement continu33,34, et il a été évalué en comparant statistiquement la distance totale moyenne parcourue (mm) durant la 1re minute et la4e minute suivant la transition de la lumière à l’obscurité. Utilisez un test t de l’élève et une ANOVA bidirectionnelle pour comparer les différences entre le groupe WT et le groupe traité par MPTP. Un total de 24 larves de poisson-zèbre (n = 24) ont été utilisées pour chaque groupe.

9. Élimination des déchets MPTP

REMARQUE : Après chaque expérience comportementale, pulvérisez et essuyez les surfaces contactées par le MPTP (par exemple, les bancs de laboratoire et le ZebraBox) avec de l’hypochlorite de sodium fraîchement préparé (eau de Javel ; ≥10 % v/v).

  1. Collectez les déchets liquides (y compris les solutions d’exposition restantes et les milieux de rinçage) ainsi que les déchets solides (par exemple, pipettes Pasteur, gants, boîtes de Petri et plaques multi-puits) du MPTP. Étiquetez-les clairement comme déchets neurotoxiques dangereux.
  2. Traiter les déchets liquides contaminés et les matières solides avec de l’hypochlorite de sodium fraîchement préparé (eau de Javel ; ≥10 % v/v) pendant au moins 24 heures afin d’assurer la décontamination, suivi de l’élimination conformément à la réglementation institutionnelle.
  3. Euthanasiez les larves de poisson-zèbre traitées à MPTP en les immergeant dans une solution diluée d’hypochlorite de sodium (par exemple, un ratio 1:5 de 6 % d’eau de Javel/eau) pendant 5min 35. Décès confirmé par manque de mouvement et de battement de cœur. Traiter les larves et les milieux décontaminés comme des déchets biologiques dangereux destinés à l’élimination institutionnelle (conformément aux protocoles approuvés par l’institution).

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Surveillance de la régulation sommeil-veille
La surveillance de régulation sommeil-veille sur 52 heures a commencé à 4 dpf et a été réalisée à l’aide d’une plaque à 96 puits. Le poisson-zèbre traité par MPTP a montré des perturbations significatives de la structure du sommeil par rapport au groupe WT. Des courbes de sommeil représentatives, des graphiques d’activité de veille et des traces d’activité moyennes sont présentés à la Figure 2....

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a développé et vérifié un protocole complet pour évaluer et analyser le phénotype comportemental de type MPTP de type DP. Ce protocole intégrait 6 tests différents : évaluation locomotrice, test de thigmotaxie, test de réponse au sursaut, paradigmes de réponse photomotrice (y compris la stimulation à la lumière stroboscopique), test de défi lumière-obscurité et surveillance de la régulation sommeil-veille, afin d’évaluer et de représenter les défauts moteurs et non moteurs de...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 21906095), du parrainage du programme Young Scholar Future de l’Université du Shandong, de la Fondation des sciences naturelles du Shandong (n° ZR2019BB018), les fonds de recherche fondamentale de l’Université du Shandong (n° 2017GN0030), la Fondation chinoise de recherche postdoctorale (n° 2018M640640). Elle est également soutenue par le Fonds de recherche ouverte 2025 du Digital Fujian Institute of Big Data for Elderly Rehabilitation and Nursing (Grant No. BDRI202502) et le Fonds de recherche ouverte 2025 du Laboratoire clé des matières bioactives, Ministère de l’Éducation, Université de Nankai (Subvention n° SWHX-202503). Projet de recherche du laboratoire de biomédecine microécologique Jinan Shandong (Grant n° JNL-2023002KF). Les auteurs tiennent à remercier le Centre des animaux de laboratoire, l’hôpital Qilu de l’Université du Shandong, ainsi que le Dr Sun Chengxi du département du laboratoire clinique de l’hôpital Qilu de l’université du Shandong, pour leur aide durant l’expérience.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
100 et fois ; Solution d’origine E3Shanghai Feixi BiotechnologieN/Acontenant 34,8 g de NaCl, 1,6 g de KCl, 5,8 g de CaCl2 et middot ; 2H2O, et 9,78 g de MgCl2· ; 6H2O par litre
Plaque de culture cellulaire à 12 puitsNEST Biotechnologie712011Non traité, non pyrogénique, stérile, polystyrène. Utilisé pour les tests comportementaux des larves de poisson-zèbre
Plaque de culture cellulaire à 24 puitsNEST Biotechnologie702011Non traité, non pyrogénique, stérile, polystyrène. Utilisé pour les tests comportementaux des larves de poisson-zèbre
Pipette Pasteur de 3 mLBiologix30-0238A1
Plaque de culture cellulaire à 6 puitsNEST Biotechnologie703011Non traité, non pyrogénique, stérile, polystyrène. Utilisé pour les tests comportementaux des larves de poisson-zèbre
Plaque de culture cellulaire à 96 puitsNEST Biotechnologie701011Non traité, non pyrogénique, stérile, polystyrène. Utilisé pour les tests comportementaux des larves de poisson-zèbre
MATLAB R2020aMathWorks, USA & nbsp ;N/AMATLAB R2020a, licence à l’échelle du campus obtenue auprès du portail logiciel de l’Université du Shandong (softms.sdu.edu.cn). Utilisé pour l’analyse statistique des données comportementales larvaires de poisson-zèbre.
Microsoft ExcelMicrosoftN/AMicrosoft Excel (partie de Microsoft Office), version installée via le portail logiciel sous licence de l’Université du Shandong (softms.sdu.edu.cn).
MPTP(1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine)  ;Beyotime411252815 mg
Boîte de PetriNEST Biotechnologie704202100 mm, stérile, poignée facile à prendre, traitée TC
Solution d’hypochlorite de sodiumMacklinS817439solution d’eau de Javel ménagère (base chlore active 6-14 %), diluée à &ge ; 10 % v/v pour la décontamination des surfaces et des déchets ; également dilué à 1:5 (6 % d’eau de Javel : eau) pour l’euthanasie des larves de poisson-zèbre traitées au MPTP.
Microscope stéréostérographiqueOlympeSérie SZX2
Système de suivi vidéo haute résolution Zebrabox   ;Viewpoint, France & nbsp ;N/A
Zebralab Software  ;Viewpoint, France & nbsp ;N/AVersion (3,52,3,87)

Références

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Mots-clés

Mod le de la maladie de Parkinson chez le poisson z breinduction au MPTPph notypage comportementallarves de poisson z breessai locomoteurvaluation de la thigmotaxietest de r ponse de sursautd fi lumi re obscuritsuivi du cycle veille sommeilsuivi vid o automatis

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