Enregistrements de photométrie multifibre bicolore du réseau de comportement social chez les souris

Résumé

La photométrie des fibres est l’une des techniques les plus courantes utilisées pour enregistrer l’activité calcique des populations neuronales profondes du cerveau. Ici, nous décrivons un protocole pour l’imagerie bicolore multisite personnalisable de l’activité calcique et d’autres signaux fluorescents dynamiques provenant de populations neuronales profondes du cerveau chez la souris.

Résumé

La photométrie de fibres, l’enregistrement massif des signaux via un câble à fibre optique, est une méthode utile pour enregistrer l’activité calcique des groupes de neurones dans le rongeur en mouvement libre. En particulier, cette méthode rend difficile de cibler de petites populations de neurones génétiquement spécifiés dans des zones plus ventrales et moins accessibles du cerveau, car il reste difficile de l’enregistrer à résolution cellulaire. Cette technique peut être adaptée pour enregistrer simultanément à partir de plusieurs sites en utilisant une approche multifibre groupée et cibler plusieurs types cellulaires en utilisant des stratégies génétiques à chaque site enregistré. Ici, nous fournissons un protocole pour construire et insérer des tableaux multifibres personnalisés ciblant le réseau de comportement social de la souris (jusqu’à 12 sites). Ce protocole détaille les procédures chirurgicales nécessaires pour cibler efficacement plusieurs sites grâce à nos réseaux multifibres personnalisés et l’approche virale pour la délivrance d’indicateurs fluorescents d’activité calcique décalés vers le vert et vers le rouge pour l’imagerie simultanée de deux populations neuronales génétiquement identifiées à chaque site. Nous démontrons comment enregistrer depuis ces régions à l’aide d’un système de caméra CMOS (semi-conducteur complémentaire) à oxyde métallique (CMOS) disponible dans le cadre du comportement social. De plus, ce protocole démontre des méthodes de contrôle qualité et détaille un pipeline de prétraitement pour la correction du bruit et la standardisation. Enfin, nous discutons de quelques applications potentielles de l’outil pour découvrir des découvertes inédites sur les réseaux cérébraux à grande échelle.

Introduction

La photométrie à fibres, l’enregistrement massif des signaux fluorescents via des câbles à fibre optique, s’est imposée comme une technique puissante pour mesurer l’activité des populations neuronales dans les régions profondes du cerveau. Souvent, ces régions ne sont pas facilement accessibles par microendoscopie ou par des approches électrophysiologiques^{traditionnelles 1,2,3}. Un objectif majeur en neurosciences des systèmes contemporains est d’identifier et de démêler les calculs utilisés par les réseaux cérébraux à grande échelle, spécifiques à un type cellulaire, impliqués dans la génération du comportement. Les sondes neuropixels et les viroles multifibres disponibles dans le commerce excellent pour enregistrer des populations neuronales alignées ^{linéairement} 4,5,6,7, tandis que l’imagerie corticale à large champ offre une excellente couverture de la dynamique corticale ^{superficielle 8,9}. Cependant, l’enregistrement simultané de populations neuronales sous-corticales spatialement dispersées mais fonctionnellement connectées reste techniquement^difficile 5,10,11,12. De plus, bien qu’il soit possible de cibler plusieurs structures cérébrales profondes en utilisant plusieurs viroles à fibre unique pour la photométrie, cette approche est limitée à des populations neuronales suffisamment distales les unes des autres pour que plusieurs ferrules soient^{implantées 12}. Les réseaux de photométrie multifibres sur mesure comblent cette lacune en permettant des enregistrements simultanés depuis de nombreuses régions sous-corticales chez des animaux en liberté avec des contraintes minimales, offrant une fenêtre unique sur la coordination au niveau du réseau lors de comportements complexes.

Le réseau comportemental social (SBN) représente un système idéal pour étudier la dynamique des réseaux cérébraux à grande échelle. Le SBN est un ensemble densément interconnecté et évolutivement conservé de structures sous-corticales impliquées dans la génération de comportements sociaux, identifiées dans toutes les classes de^{vertébrés 13, 14, 15}. Ces structures incluent traditionnellement, sans s’y limiter, le septum latéral, la zone préoptique, le noyau du lit de la strie terminale, les noyaux hypothalamiques antérieurs et ventromédiaux, l’amygdale médiale, le noyau accumbens et le gris^{périaqueductal} 13,14,15. Au sein du SBN, des populations neuronales spécifiques définies par des marqueurs moléculaires jouent un rôle crucial dans la régulation du comportement social. Les neurones acide-ergiques acides Σ-aminobutyrique (GABAergiques) du SBN (marqués par l’expression du transporteur vésiculaire GABA, ou VGAT) et les neurones glutamatergiques (caractérisés par l’expression du transporteur vésiculaire de glutamate, ou VGlut) représentent les principaux types cellulaires excitateurs et inhibiteurs du réseau et jouent probablement des rôles dissociables dans la modulation de l’action^sociale 16,17,18,19 . Au-delà de ces systèmes classiques de neurotransmetteurs, la signalisation des hormones sexuelles joue un rôle crucial dans le fonctionnement du réseau. Par exemple, de nombreux comportements sociaux masculins et féminins nécessitent l’expression du récepteur alpha des récepteurs œstrogènes, et l’activité dans les neurones SBN exprimant ces récepteurs est causal à l’origine^{de ces comportements} 16,20,21,22,23,24,25,26 . De plus, les populations neuronales SBN sont enrichies par des ligands et des récepteurs de nombreux systèmes neuromodulateurs, notamment la dopamine, l’arginine vasopressine, l’ocytocine, les opioïdes, la tachykinine, le neuropeptide Y, la prolactine, l’orexine, le peptide associé aux agoutis, les mélanocortines, la kisspeptine et l’hormone libératrice^{de gonadotrophine 17,18,19,27,28,29,30.31}, et les avancées récentes dans les capteurs codés génétiquement permettent désormais de suivre nombre de ces molécules de signalisation diverses 32,33,34,35,36,37,38. Parce que les populations neuronales SBN sont spatialement dispersées dans les structures sous-corticales, les préparations expérimentales traditionnelles (par exemple, l’électrophysiologie extracellulaire, l’imagerie corticale de surface et les approches antérieures de photométrie multifibre) ne peuvent pas capturer la dynamique d’activité moment par instant à travers ce réseau cérébral à grande échelle. Néanmoins, en surveillant la dynamique du calcium dans les populations neuronales génétiquement définies parallèlement aux schémas de libération des neuromodulateurs, des plateformes de photométrie multisite sur mesure peuvent révéler quels types cellulaires spécifiques et quelles molécules de signalisation codent sur certaines caractéristiques du comportement social, fournissant de nouvelles perspectives mécanistiques.

Ici, nous avons développé une plateforme personnalisable pour la photométrie multisite à fibre bicolore permettant l’enregistrement simultané de jusqu’à 12 régions cérébrales chez des souris en pleine liberté. Grâce à cette approche, nous avons réalisé des enregistrements photométriques bicolores de l’activité calcique à partir de 22 populations neuronales identifiées réparties dans 11 régions cérébrales du SBN, ainsi que des mesures des fluctuations de dopamine dans le noyau accumbens à l’aide d’un capteur DA basé sur l’activation du GPCR (GRAB-DA1m)³³ (Tableau 1). Ce protocole (Figure 1) détaille la construction de réseaux multifibres personnalisés, les interventions chirurgicales visant plusieurs sites profonds du cerveau, les stratégies de délivrance virale pour exprimer les indicateurs calciques doubles (GCaMP³⁹ et RCaMP⁴⁰), l’acquisition de données via un système de photométrie à fibres CMOS disponible commercialement, les méthodes de contrôle qualité, ainsi qu’un pipeline de prétraitement pour la correction du bruit et la standardisation du signal. De manière cruciale, notre pipeline de prétraitement intègre des enregistrements de longueur d’onde isosbestiques de contrôle qui nous permettent de réaliser des corrections d’artefacts de mouvement. Nous adoptons une approche basée sur la^{régression 41} pour corriger les artefacts de mouvement, en assurant la fidélité du signal lors de comportements sociaux vigoureux tels que la montée ou la bagarre. Comme notre méthode de photométrie multifibre sur mesure peut simultanément surveiller l’activité dispersée à travers les structures cérébrales profondes proximales et distales tout en maintenant la spécificité cellulaire des enregistrements grâce au ciblage^{génétique 42,43}, elle offre des avantages significatifs par rapport aux approches alternatives pour enregistrer la dynamique de l’activité neuronale à travers les réseaux cérébraux profonds et à grande échelle.

Ce protocole est parfaitement adapté aux expériences nécessitant des enregistrements simultanés dans des régions cérébrales sous-corticales spatialement dispersées (≥4 sites) chez des animaux en pleine nature, notamment lors de l’étude de la dynamique au niveau du réseau entre types cellulaires génétiquement définis ou du suivi de la libération des neuromodulateurs parallèlement à l’activité neuronale. Cette approche est particulièrement précieuse pour étudier les comportements naturalistes impliquant un mouvement vigoureux (par exemple, des interactions sociales), où notre pipeline de correction des artefacts de mouvement assure la fidélité du signal. Cependant, les chercheurs recherchant la résolution unicellulaire, la distinction entre signaux somatiques et axonaux, ou des enregistrements provenant de régions corticales superficielles peuvent trouver des approches alternatives (par exemple, microscopie miniature, neuropixels ou imagerie à champ large) plus appropriées. Les principales considérations pratiques incluent la complexité chirurgicale, la nécessité de fabrication personnalisée de réseaux multifibres, et la mise en place de l’infrastructure matérielle requise (capacités d’impression 3D, outils à fibre optique).

Protocole

REMARQUE : Ce protocole a été testé et validé chez des souris adultes âgées de 8 à 25 semaines. Les souris étaient logées à 21–26 °C et avec une humidité de 30 % à 70 % dans un cycle obscur-lumière inversée de 12 heures (OFF : 10h00 ; LE : 22h00). Les expériences se sont déroulées exclusivement pendant la phase active subjective (sombre). Nourriture et eau étaient fournies à la volonté. Toutes les procédures animales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Princeton et étaient conformes aux normes des National Institutes of Health.

1. Fabrication de réseaux multifibres et de cordons de remorcage (Figure 1A)

1. Fabriquer un cordon de brassage (Figure 2A).
   1. Obtenez un cordon de brassage à branchement fibre 12 et imprimez le connecteur de cordon de brassage fourni ainsi que les accessoires de perçage stéréotaxique (Fichier Supplémentaire 1, Fichier Supplémentaire 2, Fichier Supplémentaire 3) en utilisant de la résine (résistance à la traction : 8,7 kilolivres/pouce carré [ksi], module E : 377 ksi, déviation thermique : 138 °F, élongation : 8 %).
   2. Construisez le puck de polissage fourni (fichier supplémentaire 4) à partir d’une tige en acier inoxydable de 2 pouces de diamètre et incluez une découpe de la taille de la matrice multifibre au centre du puck.
   3. Retirez manuellement l’excès de résine des trous traversants de la goupille à chevilles dans la matrice multifibre avec un foret de 1,22 mm x 11 mm. Même avec l’impression 3D de précision, les trous pour les aiguilles sont légèrement trop petits pour que le bâton puisse passer.
   4. Perçez les trous de fibre traversants.
      1. Insérez des goupilles en acier alliage (1,19 mm x 12,7 mm) dans les 4 trous de l’accessoire stéréotaxique et placez le connecteur du cordon de réparation face inférieure vers le haut dans l’accessoire stéréotaxique de perçage, les goupilles passant par les trous traversants de la cheville multifibre.
      2. Serrez les vis M4 taille dans les trous filetés pour fixer le connecteur du cordon de patch et fixez l’accessoire de perçage stéréotaxique dans le cadre stéréotaxique.
      3. Insérez un trépan de 0,25 mm x 5,5 mm dans la perceuse stéréotaxique et montez la perceuse sur le cadre stéréotaxique. Avec ce foret, nivelez le lacet, le tangage et le roulis de la matrice multifibre avec une tolérance maximale de déviation de ±0,03 mm.
         REMARQUE : Nivelez le lacet et le tangage aux positions les plus antérieurs et postérieurs de l’impression 3D, nivelez le rouleau aux quatre coins de la matrice multifibre.
      4. Centrez le forage au-dessus d’un des trous de fibre imprimés en 3D et réglez les coordonnées X/Y du cadre stéréotaxique aux coordonnées ML (X) et AP (Y) de la région cérébrale associée (Tableau 1). Déplacez la perceuse vers les nouvelles coordonnées (0, 0) du cadre stéréotaxique pour centrer la perceuse au-dessus du trou traversant de la goupille de la cheville antérieure.
      5. Utilisez la mèche de 0,25 mm x 5,5 mm pour percer chaque trou traversant de fibre jusqu’à une profondeur de 5,5 mm aux coordonnées stéréotaxiquement définies (Tableau 1).
         REMARQUE : Utilisez un long excédent de fibre pour vérifier que tous les trous sont complètement dégagés avant de retirer le réseau multifibre du cadre stéréotaxique. Cela limitera le nombre de fois où le réseau multifibre devra être nivelé et percé pour dégager les trous de travers.
   5. Rejoignez le connecteur du cordon de brassage et le cordon de branchement
      1. Exposez >10 cm des fibres du cordon de réparation. Taillez les fibres avec un graveur pour vous assurer qu’elles sont de même longueur. Ensuite, placez un morceau de tube thermorétractable de 3/16 » et 5/16 » autour des 12 fibres du cordon de brassage.
         REMARQUE : Le tube protégera les fibres exposées une fois collées au connecteur.
      2. Insérez chaque fibre dans l’un des trous traversants du connecteur du cordon de réparation de sorte qu’environ 0,3 mm de fibre soit exposé à la surface inférieure. Après avoir inséré toutes les fibres, utilisez une pointe d’aiguille de 21 à 27 G pour appliquer de la superglue sur la surface supérieure du connecteur du cordon de brassage afin de fixer les fibres en place.
      3. Appliquez de l’époxy sur la surface supérieure du connecteur de cordon de brassage en forme de pyramide de 0,5 à 1 cm de haut. Veillez à ne pas recouvrer d’époxy autre que la surface supérieure où les fibres ont été insérées. Laissez l’époxy durcir à température ambiante toute la nuit.
      4. Utilisez un pistolet à air chaud au réglage le plus bas pour rétrécir le tube thermorétractable au-dessus de l’époxy et des fibres exposées au-dessus (<3–5 cm).
         REMARQUE : Évitez de toucher le tube thermorétractable pendant ce processus afin d’éviter les brûlures.
      5. Coupez un morceau de tube en plastique souple d’un diamètre intérieur de 3 mm à la longueur des fibres exposées restantes, coupez une fente le long du bord du tube, et enfermez les fibres exposées restantes dans le tube.
      6. Coloriez le tube transparent avec un marqueur noir opaque pour que les fibres ne soient plus visibles, minimisant ainsi l’éclairage des fibres exposées lors des expériences d’imagerie.
   6. Polissez le cordon de brassage.
      1. Fixez le connecteur du cordon de réparation à la surface inférieure dans le polis de polissage personnalisé. Polir le connecteur de cordon de réparation sur des feuilles de polissage à grain 6 μm, 3 μm, 1 μm, puis à 0,01 μm avec 10 à 20 mouvements en forme de symbole/feuille d’infini. Pour les feuilles de grain de 1 μm et 0,01 μm, placez 5 gouttes d’eau distillée avant le polissage.
      2. Essuyez la surface du connecteur pour éliminer l’excès d’eau distillée. Vérifiez la présence de défauts ou de fissures sur la surface polie du connecteur du cordon à l’aide d’un microscope à champ lumineux, et, s’il y en a, répétez le polissage.
   7. Vérifiez la sortie du câble de brassage.
      1. Connectez l’extrémité du connecteur Sub-miniature version A (SMA) du cordon de brassage à un système d’imagerie photométrique à fibre basé sur une caméra CMOS. À l’aide d’un logiciel de codage visuel, suivez le manuel du système d’imagerie photométrique et faites la mise au point de la caméra CMOS sur l’extrémité SMA du cordon de brassage.
         REMARQUE : Le manuel est régulièrement mis à jour pour s’aligner avec les mises à jour logicielles. Comme le code visuel du système de photométrie évolue souvent avec les nouvelles versions logicielles, ce manuel contient les informations les plus récentes sur les versions logicielles actuelles.
      2. Mesurez la sortie du câble de brassage à 470 nm à 20 % de puissance avec un photomètre optique. Répétez l’étape 1.1.7 si la sortie du câble est < 2,5 mW.
2. Fabriquez un réseau multifibre.
   1. Imprimez le réseau multifibre fourni (Fichier Supplémentaire 5, Fichier Supplémentaire 6) à l’aide de résine avec les spécifications techniques décrites à l’étape 1.1.1.
   2. Préparez un réseau multifibre.
      1. Insérez des écrous hexagonals en laiton M0.6 dans chacune des quatre fentes des coins latéraux de la matrice multifibre et alignez le trou de l’écrou hexagonal au centre de l’ouverture.
      2. Appliquez une goutte de super glue sur le côté de chaque fente d’écrou hexagonal avec une pointe d’aiguille de 21–27 G, en ajoutant des gouttes supplémentaires pour renforcer si nécessaire. Laissez la colle sécher à température ambiante pendant 5 minutes avant de passer à l’étape suivante.
      3. Rasez toute colle sur les côtés de la matrice multifibre à l’aide d’une lame de rasoir pour s’assurer qu’elle s’adapte bien à la rondelle de polissage.
      4. Si l’excès de superglue a séché du côté de surface de la matrice multifibre, polissez la surface de la matrice multifibres à l’aide d’un puck de polissage personnalisé et des feuilles de polissage à grain 30 μm jusqu’à ce que la colle soit retirée et que la surface de la matrice multifibre soit plate.
      5. Retirez manuellement l’excès de résine des trous traversants de la goupille à la cheville dans l’ensemble multifibre avec un foret de 1,22 mm.
   3. Percez les trous de fibre traversante (Figure 2B-C).
      1. Insérez des goupilles en acier allié (1,19 mm x 12,7 mm) dans les 4 trous de l’accessoire stéréotaxique de perçage et placez la multifibre côté surface (côté plat) vers le haut dans l’accessoire stéréotaxique de perçage, les goupilles passant par les trous traversants de la cheville multifibre.
      2. Répétez l’étape 1.4.2 – étape 1.4.5.
   4. Préparez les fibres pour le réseau multifibre.
      1. Retirez le boîtier plastique d’une section de fibre optique de 200 μm, 0,39 NA, à l’aide d’un décapant à fibres. Nettoyez la fibre avec de l’éthanol.
      2. Coupez les fibres en sections de ~3 à 5 cm de long à l’aide d’un couperet. Coupez encore ces sections en deux à l’aide d’un graveur à fibres. Utilisez un microscope à champ clair pour vous assurer qu’au moins une extrémité des sections tranchées est sans éclats ni taches. N’utilisez que des fibres avec au moins une extrémité intacte.
      3. Rubanez une règle précise d’au moins 15 mm de long sous le microscope en champ clair. Placez le côté non marqué de la fibre à la position 0 mm de la règle (Figure 2D). Coupez les fibres à la longueur souhaitée pour chaque région ciblée (Tableau 1).
         REMARQUE : La longueur de la fibre est calculée en ajoutant 6 mm à la coordonnée stéréotaxique D/V pour la fibre la plus profonde, puis en ajustant cette valeur pour toutes les fibres afin de correspondre à la différence entre leur coordonnée D/V et la coordonnée D/V de la fibre la plus profonde.
   5. Insérez les fibres dans le réseau multifibre.
      1. Placez le réseau multifibre dans le support de fabrication face vers le bas. Alignez et fixez la pièce à l’aide de goupilles à cheville.
      2. Ajustez la longueur de la fibre au site (Tableau 1) et insérez les fibres clivées dans les trous traversants appropriés de la matrice multifibre, avec le côté non marqué vers le haut. Assurez-vous que toutes les fibres sont poussées jusqu’au fond avant l’étape suivante.
      3. Appliquez de la superglue avec une pointe d’aiguille de 21 à 27 g pour coller toutes les fibres en place. Laissez la colle agir au moins 30 minutes à température ambiante avant de continuer.
   6. Polissez le réseau multifibre en répétant l’étape 1.1.6 avec le tableau multifibre face vers le bas (Figure 2E).
   7. Vérifiez l’efficacité des réseaux multifibres.
      1. Nettoyez la surface polie de la matrice multifibre avec de l’éthanol, puis appliquez un gel d’indexation dessus. Insérez 4 broches à chevilles dans le connecteur du cordon de brassage et fixez le réseau multifibre à l’aide de vis d’entraînement G5 et d’un tournevis associé (Figure 2F).
      2. Utilisez un powermètre pour mesurer les émissions de LED de 470 nm et 560 nm provenant de la matrice multifibre. Efficacité de calcul en utilisant ces valeurs :
         
      3. Si l’efficacité est <75 %, répétez les étapes 1.2.7.1–1.2.7.2.
         REMARQUE : Si le repolissage n’améliore pas l’efficacité et qu’il n’y a pas de défauts sur les fibres, il est possible que les fibres sur le réseau multifibre soient désalignées par rapport au connecteur du cordon de brassage.
   8. Préparez un réseau multifibre pour l’utilisation (Figure 2G).
      1. Insérez 4 goupilles à chevilles dans les trous traversants de la matrice multifibre. Assurez-vous que les goupilles de baguette ne dépassent pas de plus de 1 mm du côté cerveau de la matrice multifibre.
      2. Placez de la superglue côté cerveau sur les goupilles de la cheville. Laissez la colle sécher au moins 10 minutes à température ambiante avant d’utiliser le réseau multifibres.

2. Chirurgie (Figure 1B)

1. Préparez l’espace chirurgical et les outils.
   1. Un cadre stéréotaxique propre pour garantir une zone de travail aseptique.
   2. Obtenez une suture stérile et absorbable.
   3. Autoclave : une paire de pinces fines, des ciseaux fins et deux pinces bouledogue.
   4. Assurez-vous que le vaporisateur est rempli d’isoflurane. Assurez-vous que le tube pour les lignes d’isoflurance, de vide et d’oxygène est solidement relié au vaporisateur, à la chambre d’induction et au cône de nez du cadre stéréotaxique.
2. Obtenez les virus adéno-associés jRCaMP1b, GCaMP6f et GRAB-DA1m.
   ATTENTION : Portez toujours un équipement de protection individuelle lors de la manipulation des virus.
   1. Diluez les virus à une concentration de travail comprise entre 1x10^{, 13} et 4x10,¹³ parties/millilitre si nécessaire.
   2. Préparez un mélange 1:1 de virus adéno-associés jRCaMP1b et GCaMP6f.
   3. Placez une aliquote du mélange viral 1:1 jRCaMP1b :GcaMP6f et une aliquote du virus GRAB-DA1m sur la glace pour maintenir la température à 4 °C.
3. Induire l’anesthésie.
   1. Placez la souris dans la chambre à induction et fermez la porte de la chambre. Commencez le flux d’oxygène dans le vaporisateur à 1 L/min.
   2. Dirigez le flux de gaz vers la chambre d’induction et activez la conduite à vide pour éliminer l’excès de gaz de la chambre. Réglez le vaporisateur à une concentration d’isoflurane comprise entre 3 % et 5 %.
4. Transférez la souris dans le cadre stéréotaxique.
   1. Une fois que la respiration de la souris est ralentie à 1 souffle/s, déplacez-la sur le cadre stéréotaxique. Accrochez les incisives avant de la souris dans la fente de l’embout buccal du nez et serrez le cône de nez sur le nez de la souris.
   2. Transférez le flux de gaz vers le référentiel stéréotaxique avec la concentration d’isoflurane réglée à 1 % à 2 % pour maintenir l’anesthésie. Changez la conduite de vide pour retirer le gaz du cône de nez.
      REMARQUE : Surveillez la respiration de la souris tout au long de l’opération et ajustez la concentration d’isoflurane selon les besoins pour maintenir une anesthésie profonde avec un rythme respiratoire de 1 respiration/s. L’anesthésie profonde doit être confirmée périodiquement tout au long de l’opération en veillant à ce que la souris ne réponde pas à une pincée de l’orteil.
   3. Réglez le système de chauffage pour maintenir une température corporelle de 35 °C et appliquez une pommade optique sur les yeux de la souris pour éviter qu’ils ne sèchent.
   4. Insérez des barres d’oreilles stéréotaxiques de façon à ce qu’elles poussent de chaque côté du crâne, légèrement dorsale et antérieure aux conduits auditifs. Serrez les barres d’oreilles et assurez-vous que le crâne de la souris est bien fixé en appliquant une pression douce sur le dessus de la tête.
5. Préparez le cuir chevelu pour l’incision.
   1. Coupez ou rassez les poils sur le dessus de la tête de la souris jusqu’à ce qu’ils soient courts. Appliquez du gel dépilant sur le dessus de la tête de la souris et laissez reposer environ une minute. Retirez le gel restant avec un coton tige-t-eau propre.
   2. Répétez la 2.5.1 si nécessaire jusqu’à ce que tous les poils du dessus de la tête aient été enlevés.
   3. Désinfectez la peau sur le dessus de la tête en appliquant de la bétadine (solution 10 % de povidone-iode) suivie d’une solution à 70 % d’éthanol.
6. Exposez le crâne.
   1. Incision le long de la ligne médiane du crâne, s’étendant de la part légèrement postérieure de la lambda à légèrement antérieure de la veine rhinale rostrale.
      REMARQUE : La veine rhinale rhostrale est le vaisseau sanguin qui se trouve sur la face dorsale du cerveau, entre le bulbe olfactif et le cortex préfrontal.
   2. Coupez et retirez la peau rasée autour des côtés de cette incision pour former une coupure en forme de goutte qui expose les os pariétaux, l’extrémité antérieure de l’os intrapariétal et la portion des os nasaux qui se trouve devant la veine rhinale rostrale (Figure 2H).
   3. Nettoyez doucement la surface du crâne avec une solution saline à 0,9 % et un coton-tige propre.
7. Nivelez le crâne.
   1. Localiser l’endroit où la veine rhinale rostrale rejoint la suture sagittale. Marquez ce point avec une lame de scalpel stérile.
   2. Insérez un foret en carbure #92 dans la perceuse stéréotaxique et montez la perceuse sur le cadre stéréotaxique. Utilisez le manipulateur stéréotaxique pour positionner la pointe de la perceuse sur la surface du crâne au point marqué et mettre à zéro les coordonnées X, Y et Z de la foreuse.
   3. Nivellez la hauteur du crâne en mesurant une profondeur Z au point marqué et -8,25 mm postérieure à celui-ci. Le lacet du crâne est nivelé en mesurant la distance latérale entre le point marqué et la position -8,25 postérieure. Roulis à niveau en mesurant la profondeur Z aux positions ±2,0–2,5 mm à partir de la ligne médiane aux positions -2,0, -4,5 et -7,0 mm par rapport au point marqué.
8. Réaliser des craniotomies et des duratomies.
   1. Remplacez la mèche par une mèche en carbure #76 ou #78. Mettre le foret à zéro à la position marquée à la jonction de la suture sagittale, de la veine rhinale rostrale et de la surface du crâne.
   2. Déplacez la foreuse aux coordonnées A/P et M/L de chaque région cérébrale (Tableau 1). À chaque site, percez une craniotomie et retirez soigneusement la dure-mère à chaque craniotomie à l’aide d’une pointe vide de seringue de 27G ou moins.
9. Injectez le virus.
   1. Tirez les micropipettes en verre de façon à ce que leur extrémité s’effille d’au moins 7 mm et ait une ouverture de pointe de 10 à 30 μm.
      REMARQUE : Redémarrez les étapes 2.9.2–2.9.12 si la micropipette contient des bulles d’air après l’une des étapes suivantes.
   2. Remplissez une pointe de micropipette en verre vide avec de l’huile minérale. Insérez et fixez la pointe de la micropipette dans l’injecteur de nanolitre. Utilisez l’interface injecteur nanolitre pour éjecter autant d’huile minérale que possible de la micropipette.
   3. Montez l’injecteur nanolitre sur le cadre stéréotaxique. Découpez un petit morceau de feuille de cire de paraffine et placez-le sur la tête de la souris.
   4. Pipeter 1 μL du mélange du virus jRCaMP1b :GCaMP6f sur la cire de paraffine. Abaissez la pointe de l’injecteur en nanolitre pour que la pointe en verre de la micropipette soit dans le mélange viral et remplissez la micropipette avec le virus en utilisant l’interface de l’injecteur.
   5. Répétez 2.9.4 jusqu’à ce que tous les virus utilisés aient été transférés à l’injecteur de nanolitres (Tableau 1). Retirez et jetez la cire de paraffine dans un contenant à déchets biohazard.
   6. Placez la pointe de la micropipette injectrice à la position indiquée à la jonction de la suture sagittale, de la veine rhinale rostrale et de la surface du crâne.
   7. En commençant par le site d’injection le plus ventral au plus dorsal (Tableau 1), déplacez la pointe de la micropipette vers chaque site, abaissez-la pour toucher la surface du cerveau, et zérez la position Z sur le cadre stéréotaxique.
   8. À chaque site, abaissez la pointe de la micropipette dans le cerveau jusqu’à ce qu’elle atteigne 0,1 mm ventral par rapport au site d’injection. Ensuite, soulevez la pointe de la micropipette de 0,1 mm jusqu’au site d’injection final. Laissez le tissu environnant se déposer autour de la pointe de la micropipette pendant 30 secondes.
   9. À l’aide de l’interface injecteur nanolitre, injectez 300 nL du mélange viral 1:1 jRCaMP1b :GcaMP6f à un taux de 1 à 2 nL/s pour disperser le mélange au site d’injection actuel.
   10. Laissez la pointe de la micropipette rester au point d’injection au moins 5 minutes après la fin de l’injection. Soulevez lentement la pointe de la micropipette hors du cerveau pour réduire le risque de propagation dorsale du virus le long de la trajectoire d’injection.
   11. Après injection du mélange viral 1:1 jRCaMP1b :GcaMP6f à chaque site, utilisez l’interface d’injection nanolitres pour remettre le plongeur de l’injecteur nanolitre à sa position initiale. Retirez la micropipette et jetez-la dans un contenant à déchets pour objets tranchants biologiques.
   12. Si nécessaire, répétez les étapes 2.9.2–2.9.11 pour chaque région cérébrale ciblée pour l’expression de GRAB-DA1m. À chaque site ciblé, injectez 150 nL au lieu des 300 nL utilisés pour le mélange viral.
10. Implantez un réseau multifibre.
    1. Fixez le réseau multifibre au cadre stéréotaxique en utilisant tout attachement pouvant maintenir le réseau multifibre par les broches de la cheville pour le maintenir stable pendant l’implantation (Figure 2I).
    2. Ajustez la position de l’ensemble multifibre de sorte que chaque fibre s’aligne avec le centre de sa craniotomie respective et que la plus longue fibre repose à la surface du cerveau. Réglez le manipulateur stéréotaxique à cet endroit et abaissez lentement le réseau multifibre jusqu’à ce qu’il soit 0,25 mm au-dessus de la position D/V de l’injection virale la plus profonde (Table1, Figure 2J).
    3. Placez un plat de mélange froid sur de la glace et ajoutez 1 cuillère de poudre de ciment, 4 gouttes de base liquide et 1 goutte de catalyseur. Mélangez pendant 20 s.
       REMARQUE : Répétez cette étape chaque fois que du ciment liquide est utilisé et qu’il en faut plus.
    4. Utilisez une seringue et une aiguille de 23–31 G pour transférer du ciment liquide dans l’espace entre le réseau multifibres et le crâne.
    5. Appliquez du ciment liquide à l’aide d’un applicateur en plastique fin ou d’une aiguille à seringue pour recouvrir complètement les quatre côtés de la matrice multifibres, en construisant une forme pyramidale à partir du crâne (Figure 2K). Laissez sécher le ciment pendant au moins 15 minutes.
    6. Suture la peau ensemble le long de l’incision afin de ne pas exposer le crâne.
11. Laissez la souris récupérer.
    1. Réduisez la concentration d’isoflurane à 0.
    2. Transférez la souris du cadre stéréotaxique à un coussin chauffant et attendez que la souris soit alerte et ambulante avant de la remettre dans sa cage.
    3. Laissez la souris récupérer pendant au moins deux semaines avant de commencer les expériences.

3. Imagerie calcique multisite et bicolore (Figure 1C)

1. Configurez le dispositif d’acquisition de données (DAQ).
   1. Connectez le GND au port AGND au-dessus du port Ch7 à l’aide d’un fil électrique.
   2. Connectez le DIO0 au port Ch0 à l’aide d’un fil électrique.
2. Connectez le système de photométrie au DAQ.
   1. Connectez l’extrémité du connecteur Baby Neill Constant (BNC) d’un câble BNC divisé (connecteur BNC à une extrémité, fils électriques rouge et noir à l’autre) à l’entrée du système de photométrie. Connectez l’extrémité du connecteur BNC d’un autre câble BNC divisé au port de sortie du système de photométrie.
   2. Prenez le câble BNC divisé connecté au port d’entrée du système de photométrie et connectez son extrémité du fil rouge au port DIO1 du DAQ. Prenez le câble BNC divisé connecté au port de sortie du système de photométrie et connectez son extrémité du fil rouge au port Ch1 du DAQ.
   3. Connectez les fils de terre noirs des deux câbles BNC divisés au port DAQ GND.
3. Synchronisez les caméras de comportement et de photométrie.
   1. Enchaînez plusieurs caméras comportementales pour des enregistrements simultanés du comportement sous plusieurs angles.
      1. Connectez la sortie opto-isolée (broche 4, fil blanc) de la caméra de comportement primaire à l’entrée non isolée de la caméra secondaire (broche 1, fil vert) avec une résistance de 3,3 KΩ. Connectez la sortie 3,3 V de la caméra principale (broche 3, fil rouge) à la même résistance de 3,3 KΩ et au Ch2 du DAQ.
      2. Connectez la sortie opto-isolée de chaque caméra secondaire à sa sortie 3,3 V à l’aide d’une résistance de 3,3 KΩ.
      3. Connectez la masse de la caméra principale (broche 6, fil marron) à la masse de chaque caméra secondaire. Connectez tous les fils de masse de la caméra au port DAQ AGND au-dessus du port Ch2 et à la masse de sortie du système de photométrie.
4. Configurez les paramètres de la caméra comportementale à l’aide du logiciel d’imagerie associé.
   1. Réglez le « taux d’acquisition » à 45 Hz et le gain à 1.
   2. Réglez le temps d’exposition à 2998 μs, la limite inférieure à 100 μs, et la limite supérieure à 150000 μs.
      REMARQUE : « Acquisition Frame Rate » peut ne pas être la fréquence d’images réelle qui sera capturée. Selon le temps d’exposition et la bande passante de données demandée, cette valeur peut devoir être réglée au-dessus de la fréquence d’imagerie finale. Si nécessaire, ajustez la « Fréquence d’Acquisition » de sorte que la « Fréquence d’images résultante » affichée soit de 40 Hz.
5. Configurez le logiciel DAQ (Fichier supplémentaire 7).
   1. Dans le logiciel DAQ, ajoutez le DAQ en tant que « Périphérique » et basculez vers le « Panneau de configuration ».
   2. Dans l’onglet « Channels », sous « Analog Input », activez les canaux 0–2. Sous « Digital », activez le canal 0.
      REMARQUE : Ch0 correspond au signal logique transitor-transiteur (TTL), Ch1 au système de photométrie, et Ch2 aux caméras en chaîne.
   3. Sous « Analog Input », nommez le canal 0 « TTL », le canal 1 « Photometry_system » et le canal 2 « Behavior_cameras » qui signifie « Transitor-Transistor Logic ». Sous « Digital », nom canal 0 « TTL_trigger ».
   4. Dans l’onglet « Détenteurs », mets les déclencheurs en mode manuel. Dans l’onglet « Taux d’échantillonnage », réglez la fréquence d’échantillonnage à 350 Hz.
   5. Passez au « Panneau d’affichage » et mettez les fenêtres « Strip », « Scalar » et « Output » dans l’interface graphique.
6. Configurez le logiciel système de photométrie (Fichier Supplémentaire 8).
   1. Développer un flux de travail dans le logiciel de codage visuel pour accepter une impulsion TTL de 5 V afin de déclencher les enregistrements et d’économiser l’horodatage pour chaque image, les émissions de fluorescence pour les canaux rouge et vert de chaque fibre, ainsi que la vidéo brute, comme indiqué dans le manuel du système de photométrie.
   2. En utilisant le nœud pour le système de photométrie dans le flux de travail, assurez-vous que le système est configuré pour enregistrer des images alternées de LED de 560, 470 et 415 nm à 120 Hz pour un taux d’images fonctionnel de 40 Hz.
      REMARQUE : Cette approche de multiplexage par division temporelle (TDM) traite le chevauchement spectral entre GCaMP et RCaMP en séparant temporellement leur excitation, garantissant que chaque indicateur est excité indépendamment sur des images consécutives. Le système d’enregistrement utilisé ici utilise des filtres d’émission passe-bande optimisés (canal vert : 500–530 nm ; canal rouge : >580 nm passe-long) qui minimisent encore davantage la diaphonie spectrale en limitant les photons détectés aux longueurs d’onde principalement émises par chaque indicateur. La longueur d’onde isosestique de 415 nm excite à la fois GCaMP et RCaMP de manière égale, mais produit des changements de fluorescence dépendants du calcium minimes, fournissant un signal de contrôle des artefacts de mouvement. Ensemble, l’excitation TDM et le filtrage spectral garantissent que les trames 470 nm capturent principalement l’activité GCaMP (Figure 3A), les trames 560 nm captent principalement l’activité RCaMP (Figure 3B), et les images 415 nm fournissent des signaux de référence indépendants du calcium pour la correction du mouvement.
7. Effectuer des enregistrements photométriques in vivo .
   1. Obtenez une souris ayant subi des injections virales et une implantation de réseaux multifibres comme indiqué à l’étape 2.
   2. Nettoyez les surfaces de connexion du cordon de brassage et de la matrice multifibre implantée avec de l’éthanol et un coton-tige-coton. En utilisant le nœud du système de photométrie dans le flux de travail de codage visuel et un photomètre, on réglait chacun des niveaux de puissance LED 415, 470 et 560 pour fournir environ 1,2 mW d’éclairage via le cordon de brassage.
   3. Appliquez du gel d’indexation sur la surface de connexion du cordon de brassage. Alignez le cordon de remordage sur le réseau multifibre implanté de la souris avec les goupilles de la matrice, puis faites glisser le cordon jusqu’à ce qu’il soit à fleur de surface du réseau multifibre implanté.
   4. Serrez les vis du cordon de brassage pour fixer le réseau multifibre dans le cordon de brassage. Laissez la souris s’habituer avant de commencer les expériences (Figure 2L–M).
   5. Définissez les noms des fichiers.
      1. Pour chaque caméra comportementale, appuyez sur le bouton cercle rouge « enregistrer » pour ouvrir sa fenêtre d’enregistrement dans le logiciel caméra comportementale et spécifiez son nom de fichier.
      2. Ouvrez le logiciel DAQ, cliquez sur le bouton engrenage et allez dans « options de journalisation », puis spécifiez le nom du fichier.
      3. Cliquez sur le nœud « PhotometryWriter » du flux de travail de codage visuel du système de photométrie pour spécifier le nom du fichier.
   6. Dans les fenêtres d’enregistrement du logiciel de caméra de comportement, cliquez sur « démarrer l’enregistrement » pour chaque caméra. Ensuite, appuyez sur le bouton lecture dans le flux de travail de codage visuel du système de photométrie, puis appuyez sur enregistrer dans le logiciel DAQ.
   7. Cliquez sur l’interrupteur TTL pour commencer l’enregistrement synchrone sur toutes les caméras.
   8. Fin de l’enregistrement.
      1. Cliquez sur l’interrupteur TTL pour mettre fin aux enregistrements synchrones de la caméra
      2. Appuyez sur le bouton stop dans le flux de travail de codage visuel du système de photométrie, « arrêtez l’enregistrement » dans les fenêtres d’enregistrement du logiciel de la caméra de comportement.
   9. Répétez les étapes 3.7.5–3.7.8 jusqu’à la fin des expériences, puis déconnectez la souris.
      REMARQUE : Après des expériences, les flux de données de photométrie et de caméra comportementale peuvent être alignés avec du code personnalisé à l’aide de la sortie du logiciel DAQ. Plus précisément, (1) le changement de tension TTL indique le moment d’apparition et de décalage TTL, (2) les changements de tension de comportement de la caméra indiquent quand l’obturateur s’ouvre et se ferme pour capturer chaque image de vidéo, et (3) le changement initial de tension du système photométrique enregistré sur le DAQ peut être comparé au temps d’ouverture TTL et aux horodatages de la caméra photométrique produits par le logiciel de codage visuel pour déterminer les horodatages de la caméra photométrique.

4. Traitement des données (Figure 1D, Fichier supplémentaire 9)

1. Pré-traitement des données d’imagerie calcique.
   1. Dé-entrelacer les images de données d’imagerie calcique pour créer des flux distincts de signal enregistrés en réponse aux LED de 415 nm, 470 nm et 560 nm.
   2. Utilisez l’algorithme adaptatif iterativement repondéré des moindres carrés pénalisés (airPLS)⁴⁴ pour corriger la dérive de base.
   3. Calculer ΔF/F en utilisant :
      
      REMARQUE : La période de référence doit être une époque stable avant la manipulation expérimentale (par exemple, avant l’introduction d’un partenaire social). Si la période de référence est trop courte (<2–3 min) ou présente de fortes fluctuations pouvant être contaminées par des artefacts de mouvement, envisagez de normaliser en utilisant la fluorescence moyenne sur toute la session au lieu d’une période de référence restreinte.
2. Correcte pour les artefacts de mouvement (Figure 4A).
   1. Utiliser une approche basée sur la régression, bien que des méthodes alternatives soient adaptées (voir Tableau 2)
   2. Signaux Z-score ΔF/F utilisant la médiane pour normaliser la magnitude du signal à travers les régions :
      
   3. Appliquez la régression Lasso avec régularisation L1. Le lasso (opérateur de réduction absolue et de sélection minimale) effectue la sélection automatique des caractéristiques en réduisant les coefficients des prédicteurs non informatifs vers zéro.
      1. Effectuer une recherche en grille à travers les paramètres de régularisation (α = 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1, 10, 100). La recherche en grille identifie l’équilibre optimal entre complexité du modèle et surapprentissage. Cette étape peut être entièrement automatisée grâce aux routines de validation croisée disponibles dans les bibliothèques standard d’apprentissage automatique (par exemple, scikit-learn en Python).
      2. Pour la photométrie bicolore (notre approche recommandée), utilisez tous les canaux de contrôle isosbestiques disponibles à 415 nm sur les 12 régions d’enregistrement comme prédicteurs (voir Figure 4B–C et Résultats pour la justification). Pour la photométrie monocolore (GCaMP seulement ou RCaMP uniquement), restreignez la matrice prédictrice uniquement au signal isosbestique provenant de la même fibre que le signal calcium corrigé.
      3. Sélectionnez le modèle qui minimise l’erreur quadratique moyenne entre le signal prédit et celui observé.
   4. Soustrayons la composante de mouvement prédite du signal pour obtenir l’activité corrigée.
3. Lissez le signal à l’aide d’un filtre Savitzky-Golay avec une fenêtre de 725 ms.

Résultats

Pour enregistrer simultanément à partir de jusqu’à 12 régions cérébrales SBN, nous avons construit un réseau multifibre personnalisable suivant le protocole ci-dessus. Après la récupération de l’opération, les souris ont été enregistrées lors d’interactions sociales (Figure 5). Pour toutes les expériences, les souris mâles du sujet CD1 étaient autorisées à interagir avec des souris Balb/c mâles dans leur cage domestique. Nous avons utilisé des souris Vgat-Cre pour exprimer jRCaMP1b⁴⁰ dans des neurones GABAergiques de manière dépendante de Cre dans 11 régions cérébrales SBN, GCaMP6f³⁹ dans des cellules non GABAergiques de manière excluant^{Cre 45} dans les mêmes régions cérébrales, et GRAB-DA1m³³ dans le noyau accumbens⁴² (Tableau 1). Une confirmation histologique du ciblage des fibres se trouve dans nos publications^{antérieures 42,43}. Ici, nous avons cherché à tester la performance de différentes méthodes de correction des artefacts de mouvement. Plus précisément, nous avons comparé l’efficacité de l’utilisation de : (1) un filtre médian seul ; (2) Régression lasso avec régularisation L1 utilisant uniquement des signaux isosbestiques à fibres égales (approche à prédicteur unique)¹¹ et (3) Régression lasso utilisant des signaux isosbestiques de toutes les fibres comme prédicteurs (approche multi-prédictrice^)41,42 (Figure 4A). De manière cruciale, les méthodes basées sur Lasso corrigent le signal brut en utilisant le signal fluorescent indépendant de l’activité généré en réponse à la LED à fréquence isosestique (415 nm), tandis que le lissage du filtre médian ne prend pas en compte le signal indépendant de l’activité.

Nous avons évalué la correction de mouvement à l’aide de deux mesures différentes : le bruit absolu à haute fréquence et le jitter. Le bruit haute fréquence a été défini comme l’écart-type de la première dérivée du signal, qui reflète l’ampleur des fluctuations rapides du signal. Le jitter a été défini comme le coefficient de variation de la dérivée du signal, qui reflète la magnitude de la variabilité du signal d’une trame à l’autre par rapport à la moyenne de la dérivée du signal. Nous avons constaté que les deux approches basées sur le lasso (prédicteur unique et multi-prédictor) surpassaient nettement le filtre médian en termes de réduction du bruit et du jitter à haute fréquence, la correction multi-prédicteur surpassant légèrement la correction à un seul prédicteur (Figure 4C–D ; Bruit haute fréquence, n=414 pour 23 signaux répartis sur 18 sessions d’enregistrement : test de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001 ; tests post-hoc de Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni : régression lissée vs régression à site unique ***p < 0,001, régression lissée vs multi-sites***p < 0,001, Régression monosite vs multisite **p = 0,0073 ; Jitter : test de Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001 ; tests post-hoc de Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni : régression lissée vs régression à site unique ***p < 0,001, régression lissée vs multi-site ***p < 0,001, Régression à site unique vs multisite ***p = 0,0006). Plus précisément, l’approche multi-prédicteur (utilisant toutes les isosestiques de fibre) a montré des bénéfices pour les signaux en canal rouge (RCaMP) : 5 des 12 signaux rouges ont montré un bruit résiduel significativement inférieur à la correction à un seul prédicteur (n = 18 enregistrements/région). Pour le jitter, le BNST (test t, t = 5,42, ***p < 0,001), le POA (test t, t = 2,68, *p = 0,011), l’AH (test t, t = 2,66, *p = 0,012) et le PAG (test U de Mann-Whitney, U = 279, ***p < 0,001) ont montré une supériorité multi-prédictrice. Pour le bruit à haute fréquence, le BNST (test U de Mann-Whitney, U = 285, ***p < 0,001), POA (test U de Mann-Whitney, U = 292, ***p < 0,001), AH (test t, t = 7,10, ***p < 0,001), PAG (test t, t = 13,72, ***p < 0,001) et LHb (test t, t = 5,47, ***p < 0,001) ont montré une supériorité multi-prédictif. Les signaux à canal vert (GCaMP) n’ont montré aucune différence significative entre les deux approches Lasso dans les 12 régions, que ce soit pour les métriques de gigue ou de bruit haute fréquence (toutes p>0,05, pour la liste complète des tests statistiques voir Tableau 3). Cela suggère que pour la photométrie bicolore, l’intégration d’informations isosbestiques transversales améliore la correction du mouvement pour les signaux rouges, probablement parce que les isosbestiques à canal vert fournissent des informations de mouvement plus nettes. Ces données démontrent que la correction des artefacts de mouvement utilisant des méthodes de régression basées sur l’isosbestique surpasse largement les approches de filtrage simples, la régression multi-canal offrant des avantages spécifiques pour les enregistrements bicolores.

Figure 1. Enregistrement à partir du Social Behavior Network utilisant la photométrie multisite à fibre bicolore. (A) Représentation schématique de la manière de construire un réseau multifibre. (B) Représentation schématique du flux de travail chirurgical. (C) Représentation schématique d’expériences d’imagerie calcique bicolore. (D) Exemple d’utilisation d’un signal isosbestique pour calculer un signal corrigé de mouvement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2. Images des interventions clés pour la fabrication et la chirurgie. (A) Cordon de brassage fabriqué prêt à être utilisé pour l’enregistrement. (B) Réseau multifibre placé dans un support stéréotaxique personnalisé avec la mèche de 0,25 mm x 5,5 mm placée au-dessus d’un trou traversant de fibre. (C) Réseau multifibre avec tous les trous traversants de la fibre dégagés et écrous hexagonals collés. (D) Fendre une fibre à l’aide d’un graveur de fibre. (E) Réseau multifibres avec toutes les fibres collées et placées sur une rondelle de polissage personnalisée. (F) Vue agrandie de la façon d’aligner et de visser le connecteur du cordon de brassage à la matrice multifibre. (G) Réseau multifibre entièrement construit avec des goupilles de baguette collées en place. (H) Souris fixée à un cadre stéréotaxique avec incision sur le cuir chevelu réalisée pour exposer le crâne. (I) Réseau multifibre fabriqué attaché à un manipulateur stéréotaxique pour manœuvrer le réseau multifibre pendant la chirurgie. (J) Vue agrandie de l’ensemble multifibre en train d’être descendu dans le cerveau. (K) Réseau multifibre entièrement abaissé et fixé au crâne avec du ciment dentaire. (L) Réseau multifibre sur un animal qui est solidement connecté au cordon de brassage avant l’enregistrement. (M) Vue dézoomée de l’animal en cage avec un cordon de brassage connecté avant et/ou pendant l’enregistrement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3. Séparation spectrale. Exemples de traces montrant une diaphonie spectrale minimale entre indicateurs calciques. Les signaux GCaMP6f (bleus) montrent une activation robuste lors de l’excitation à 470 nm mais une réponse négligeable à une excitation à 560 nm. Les signaux jRCaMP1b (rouge) présentent le motif inverse avec une forte activation à partir de 560 nm mais une réponse minimale à une illumination de 470 nm. (A) Enregistrer simultanément les signaux GCaMP6f et jRCaMP1b avec un éclairage uniquement de 470 nm. (B) Identique à (a), mais avec un éclairage uniquement à 560 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4. Comparaison des différentes méthodes pour le traitement du signal multifibre. (A) Schéma représentant la correction multi-site basée sur la régression du signal photométrique. Cette approche implique des étapes de traitement séquentielles par lesquelles tous les signaux isosbestiques disponibles à 415 nm sont mappés linéairement à chaque signal dépendant du calcium. Les composantes du mouvement prédite sont soustraites de ce signal pour produire la lecture finale de l’activité. Signaux ΔF/F à score z provenant de deux signaux présentant une forte présence d’artefacts de mouvement. (B) De haut en bas : signal isossestique provenant du même canal fibre/imagerie représentant des artefacts de mouvement, signal RCaMP (à gauche) ou GCaMP (à droite) uniquement lissé (filtré à médiane, vert), même signal à fibre/canal d’imagerie corrigé par régression (cyan), signal multi-fibres corrigé par régression (bleu). (C) Gauche : Score moyen de bruit à haute fréquence pour chaque signal enregistré (n = 21 sessions). Le bruit à haute fréquence est calculé comme l’écart-type de la première dérivée de chaque signal. Les scores de bruit sont affichés pour 1) un signal corrigé par la ligne de base mais non corrigé (gris), 2) un signal corrigé par la ligne de base et filtré par la médiane (rose), 3) un signal corrigé par régression de base et par fibre unique avec lissage Savitsky-Golay (cyan), et 4) un signal corrigé par régression de base et multi-fibres avec lissage Savitsky-Golay (bleu). Centre : Pourcentage moyen de bruit éliminé en utilisant uniquement le lissage, la régression à fibre unique ou multi-fibres, agrégé sur les 23 signaux. Le pourcentage de bruit éliminé est calculé comme la fraction de bruit de haute fréquence résultant d’une correction par rapport au niveau global de bruit dans le signal brut corrigé de base. Les données sont rapportées comme moyenne ± SEM (test de Kruskal-Wallis, H = 501,9420, p < 0,001 ; tests post-hoc Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni : régression lissée vs monosite ***p < 0,001, Régression lissée vs Multi-site ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site **p = 0,0073). À droite : Pourcentage de signaux où le bruit à haute fréquence est statistiquement différent après une correction basée sur la régression entre une seule fibre et une multi-fibre, séparée par type de signal. Pour chacun des 23 signaux, les niveaux de bruit après correction à site unique ont été comparés à ceux après correction multi-sites en utilisant soit des tests t indépendants (s’ils sont normalement distribués), soit des tests Mann-Whitney U (alternative non paramétrique). Les segments bleus indiquent des signaux où la correction multi-site a entraîné un bruit significativement moindre que la correction à site unique (p < 0,05). Les segments gris indiquent des signaux sans différence significative entre les méthodes de correction. Les segments cyan indiquent des signaux où une correction sur un seul site a entraîné un bruit significativement moindre. E : Vgat- GCaMP6f. DA : ATTRAPE-DA. I : Vgat+ jRCaMP1b. (D) Identique à (C) mais représentant la variabilité de trame à image (jitter), calculée comme la dérivée du coefficient de variation de chaque signal (test de Kruskal-Wallis, H = 495,6685, p < 0,001 ; tests post-hoc de Mann-Whitney U avec correction de Bonferroni : régression lissée vs monosite ***p < 0,001, régression lissée vs multi-site ***p < 0,001, Single-site vs Multi-site ***p = 0,0006). Pour la liste complète des tests statistiques et des résultats, voir le Tableau 3. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5. Présentation multisite de photométrie à fibre bicolore. Des signaux représentatifs issus de plusieurs types d’indicateurs enregistrés simultanément lors du comportement social (test résident-intrus, époque d’entrée de l’intrus). Les traces montrent des GCaMP6f non normalisés et soustraits de la ligne de base mais non corrigés par les artefacts de mouvement (neurones Cre-négatifs), jRCaMP1b (neurones GABAergiques Vgat-Cre+) et GRAB-DA1m (capteur de dopamine dans le noyau accumbens) sur les sites du réseau de comportement social chez le même animal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1. Coordonnées virales et longueurs de fibres pour chaque Réseau Comportemental Social ciblé Région du Cerveau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2. Comparaison des méthodes de correction des artefacts de mouvement pour la photométrie à fibres multi-sites. Principes sous-jacents, cas d’usage optimaux, avantages et limites des méthodes suivantes de correction d’artefacts de mouvement : régression linéaire simple, régression Lasso avec régularisation L1 (utilisant une approche multi-prédictrice), modélisation générative bayésienne, scaling basé sur la fréquence, et moindres carrés itératifs reponderés. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3. Détails et résultats des tests statistiques utilisés dans la Figure 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Dossier supplémentaire 1. Fichier d’impression 3D pour le connecteur de patchcord.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2. 3D fichier d’impression pour connecteur de câble sans trous traversants.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 3. 3D fichier d’impression pour l’accessoire de perçage stéréotaxique.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 4. Plan personnalisé du puck de polissage.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 5. 3D fichier d’impression pour la matrice de photométrie multisite ciblant 12 sites SBN.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 6. 3D fichier d’impression pour une matrice de photométrie multisite sans trous traversants ciblant les sites.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 7. Fichier de configuration DAQ pour le logiciel DAQ.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 8. Fichier de codage visuel pour le système de photométrie.Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 9. Le code Python utilisé dans le protocole Step 4 et pour les comparaisons d’artefacts de mouvement corrigé. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La photométrie des fibres est une technique utile et économique pour enregistrer l’activité calcique des populations provenant des régions cérébrales profondes ou de types cellulaires spécifiques chez l’animal^{en mouvement libre 3}. L’enregistrement simultanément de plusieurs régions cérébrales permet à l’utilisateur de comparer la dynamique entre régions ou projections lors d’un comportement naturaliste ou des préparations fixes^{à la tête 5,7,12}. Ici, nous détaillons des méthodes pour enregistrer en deux couleurs à partir de jusqu’à 12 régions cérébrales à travers le « réseau comportemental social » subcortical, en utilisant un réseau de fibres sur mesure et un système de caméras commercialement disponible. Ci-dessous, nous discutons des étapes clés de la mise en œuvre de cette méthode, des modifications potentielles et des stratégies de dépannage, ainsi que de son importance et de ses limites par rapport aux approches existantes.

Le protocole comporte trois phases majeures. Premièrement, la fabrication de réseaux multifibres et de cordons de patch nécessite que des pièces imprimées en 3D soient percées sur mesure aux coordonnées stéréotaxiques, suivies d’une insertion, d’un polissage et d’un contrôle qualité de la fibre pour garantir une efficacité de transmission de la lumière de ≥75 %. Un alignement précis du forage (tolérance de ±0,03 mm) et un polissage approfondi sont essentiels. Les pannes courantes incluent une faible efficacité de transmission de la lumière (<75 %) et des trous de fibre bloqués. La faible efficacité résulte généralement de taches sur les fibres lors de la défension ou d’un polissage inadéquat. Les solutions incluent la vérification de chaque extrémité de fibre sans défaut sous microscopie en champ clair avant l’insertion (étape 1.1.6.2), le repolissage en utilisant la progression complète du grain (6 μm → 0,01 μm, étape 1.1.6.1), et la garantie que la lame du couperet en fibre est bien tranchante. Pour améliorer le débit, les laboratoires peuvent mettre en place des modifications de flux de travail telles que des gabarits de découpe de fibres personnalisés utilisant des étapes de translation de précision ou des systèmes de découpe au laser (étape 1.2.4). Les fabricants commerciaux d’impression 3D disposant de systèmes de haute précision peuvent réduire les besoins de forage manuel (étapes 1.1.3–1.1.4, étape 1.2.3), bien que la précision dimensionnelle puisse varier d’un lot à l’autre.

Deuxièmement, l’implantation chirurgicale implique le nivellement du crâne (tolérance ±0,03 mm), des injections virales à 11–12 sites, et l’implantation par réseau multifibres suivie d’une fixation au ciment. La précision du ciblage est compromise lorsque le nivellement du crâne dépasse la tolérance. Cela peut être atténué en mesurant la hauteur à plusieurs points antérieur-postérieurs espacés de 8,25 mm et en mesurant le roulis à ±2,0 à 2,5 mm de position latérale, tout en veillant à ce que les barres d’oreilles stabilisent complètement le crâne. Les bulles d’air dans les micropipettes par injection virale empêchent une délivrance précise et nécessitent de reprendre la préparation de la micropipette (étape 2.9). Lors de l’implantation de réseaux multifibres, évitez le contact du ciment avec les extrémités des fibres en construisant des pyramides de ciment à partir de la surface du crâne vers le haut (étapes 2.10.3–2.10.5) et laissez un temps de séchage suffisant (≥15 min).

Troisièmement, l’enregistrement et le traitement des données impliquent la synchronisation de la caméra via un système DAQ, la calibration de l’alimentation des LED (0,1 mW sortie/fibre, 1,2 mW en sortie/câble 12 fibres), et le prétraitement du signal avec des commandes isosbestiques. Le pipeline de correction de mouvement introduit ici utilise la régression Lasso, qui convient bien aux configurations de prédicteurs multi-canaux car il réduit automatiquement les prédicteurs non informatifs vers zéro, ne conservant que ceux qui contribuent de manière significative à la correction des artefacts. Cette propriété le rend particulièrement avantageux pour la photométrie bicolore : en incluant les signaux isosbestiques des canaux rouge et vert comme prédicteurs, Lasso exploite sélectivement les canaux contenant une information de mouvement réelle, offrant une réduction du bruit significativement meilleure des signaux des canaux rouges (RCaMP) comparée à la correction sur la même fibre seule (Figure 4C–D). Parce que Lasso identifie automatiquement les prédicteurs les plus informatifs, il est fortement recommandé d’utiliser tous les canaux isosbestiques disponibles comme entrée. Cela dit, la régression de Lasso est l’une des plusieurs méthodes de correction valides ; les alternatives incluent la modélisation générative^{bayésienne 46}, l’échelle basée sur la fréquence⁴⁷, et les moindres carrés itératifs répondérés (IRLS⁾⁴⁸, qui produisent probablement une réduction comparable des artefacts, avec des directives d’implémentation fournies dans le Tableau 2. Une mauvaise qualité du signal persistante malgré un prétraitement optimisé indique probablement des problèmes matériels ou chirurgicaux, et les étapes 1 à 2 doivent être revisitées

Au-delà de ces considérations procédurales, la photométrie bicolore introduit des défis techniques supplémentaires liés à la séparation spectrale. Un point crucial en photométrie bicolore est la gestion du chevauchement spectral entre les indicateurs calciques verts et rouges. Bien que l’élimination complète de la diaphonie spectrale soit difficile en raison du chevauchement des spectres d’émission de GCaMP et RCaMP, notre approche de multiplexage temporel avec excitation LED entrelacée (470 nm pour GCaMP, 560 nm pour RCaMP, 415 nm isosbestique) et des filtres d’émission passe-bande optimisés atténue considérablement ce problème. En pratique, on observe une diaphonie minimale : une stimulation à 470 nm provoque une activité négligeable dans le canal rouge, et inversement pour une stimulation à 560 nm dans le canal vert (Figure 3). Les chercheurs préoccupés par le chevauchement spectral résiduel peuvent optimiser davantage leurs systèmes en sélectionnant des filtres d’émission passe-bande étroite avec une séparation spectrale maximale en fonction de leurs combinaisons d’indicateurs spécifiques.

Comparée à d’autres approches pour les enregistrements neuronaux à grande échelle, la photométrie à fibre multisite bicolore sur mesure offre de nombreux avantages significatifs. Premièrement, alors que la photométrie à fibre^{unique 1,2,3}, les enregistrements extracellulaires^{contemporains 4,6} ou les approches d’imagerie^{corticale 8,9} sont limitées à une seule ou à un ensemble spatialement contraint de régions cérébrales (par exemple, à la surface corticale), le design personnalisé d’impression 3D que nous partageons ici permet de cibler jusqu’à 12 régions cérébrales n’importe où dans le cerveau avec des fibres optiques de 200 μm. En comparaison, les ferrules multifibres commerciales ^5,7 ne supportent que des fibres optiques de 100 μm et sont également limitées à un ensemble limité de régions cérébrales directement ventrales à l’array linéaire de la virole. En ce qui concerne le ciblage et l’enregistrement à partir de régions cérébrales spécifiques, le principal compromis est entre le diamètre de la fibre et le champ de vision du système photométrique. Les réseaux multifibres imprimés en 3D équipés de fibres de 200 μm enregistrent depuis une plus grande surface à chaque site comparé aux viroles multifibres disponibles dans le commerce. Dans le protocole actuel, le champ de vision de la caméra du système de photométrie limite l’enregistrement à 12 fibres optiques à 200 μm. Cette contrainte peut être surmontée en réduisant le diamètre de la fibre à 100 μm pour jusqu’à 60 fibres ou en construisant un système de photométrie personnalisé avec un objectif de caméra plus grand.

Enfin, cette plateforme personnalisable de photométrie multisite à fibre bicolore a été utilisée pour suivre longitudinalement la dynamique de l’activité neuronale de deux populations neuronales génétiquement distinctes sur 11 à 12 régions cérébrales. En utilisant une stratégie d’exclusion Cre-in/Cre exprimant RCaMP dépendante de Cre et GCaMP excluant Cre parmi les populations de SBN dans une souris Vgat-cre, l’expérience agressive et l’observation ont montré qu’elles favorisent des schémas partagés de dynamiques d’activité à l’échelle du SBN lors de futures interactions sociales^{défensives 42}. En utilisant la même stratégie virale chez une souris Esr1-cre pour enregistrer à partir des neurones exprimant et non exprimant des récepteurs alpha des récepteurs d’œstrogène, des schémas de comportement social spécifiques à un territoire étaient associés à un rescaling rapide et sensible aux hormones d’un code d’action sociale à l’échelle du SBN, augmentant l’activité associée au comportement dans le territoire^{d’origine 43}. Ces différences spécifiques au territoire dans le comportement et l’encodage en réseau nécessitent une testostérone circulante chez les souris mâles. Bien que ces études aient utilisé une approche virale et une seule lignée de Cre, de futures études pourront élargir ces méthodes avec des approches virales intersectionnelles, des indicateurs de calcium exprimés génétiquement ou des rapporteurs fluorescents de neuromodulateurs et de neuropeptides.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mèche de forage #76	Ville de la Mèche de Forage	#76
Mèche de forage #78	Ville de la Mèche de Forage	#78
Mèche de forage #92	Ville de la Mèche de Forage	#92
0,01 & mu ; Feuilles de polissage M Grit	ThorLabs	LFCF2
Mèches de 0,25 mm x 5,5 mm	Ville de la Mèche de Forage	Produit personnalisé	Mèche de forage de 0,25 x 5,5 mm, contacté l’entreprise pour construire
1 & mu ; Feuilles de polissage M Grit	ThorLabs	LF1D
12 patchord à branchement fibre	Lentille dorique	CustomBBP(12)_200/220/3000-0.37 _5m_SMA-12xCL_LAF
200 & mu ; Fibre optique m	ThorLabs	FT200UMT
3 & mu ; Feuilles de polissage M Grit	ThorLabs	LF3D
30 & mu ; Feuilles de polissage M Grit	ThorLabs	LF30D
6 & mu ; Feuilles de polissage M Grit	ThorLabs	LF6D
Suture absorbable	Ethicon	J421H
Documentation des moindres carrés pénalisés adaptatifs iteratifs	Google	N/A	https://code.google.com/archive/p/airpls/
Goupilles à chevilles en acier allié	McMaster-Carr	98381a983
Caméras comportementales	Teledyne FLIR	Blackfly S
Bonsaï	Fondation du logiciel Bonsai	Version 2.9.0
Microscope à champ clair	Leica	ES2
Pinces pour bouledogues	FineScienceTools	18038-45
DAQ	Calcul de mesure	DAQ série MC USB-200
Logiciel DAQ	Calcul de mesure	DAQami
Drill	Kopf Instruments	Perceuse stéréotaxique modèle 1911
Couperet à fibre	ThorLabs	XL411/CLVB
Système de photométrie à fibres	Neurophotométrie	FP3002
Manuel du système de photométrie à fibre	Neurophotométrie	N/A	Manuel de l’appareil d’hébergement de page web : https://neurophotometrics.com/documentation
Graveur à fibres	ThorLabs	S90C
Décapeuse à fibres	ThorLabs	T10S13
Pinces fines	FineScienceTools	11252-00
Ciseaux fins	FineScienceTools	14084-08
Vis d’entraînement G5	Open Ephys Production Site	OEPS-7105
Tournevis G5	Open Ephys Production Site	OEPS-7121
GCaMP6f	Laboratoire de neuroingénierie virale PNI	EF1a-Cre out-GCaMP6f-WPRE-hGHpA
GRAB-DA	Addgene	hSyn-GRAB_DA1m-WPRE-hGHpA
Bouillotte	Fournitures médicales habiles	HTP-1500
Système de chauffage	Kent Scientific	RT-0515
Isoflurane	Covetrus	29405
jRCaMP1b	Addgene	pAAV.Syn.Flex.NES-jRCaMP1b.WPRE.SV40
Écrous hexagonals en laiton M0.6	MetricScrews.us	21614
Réactifs et outils de ciment métabond	Parkell	S380
Impressions 3D à la résine MicroFine de type ABS	ProtoLabs	Produit personnalisé	Voir les fichiers de codes supplémentaires 1-3, 5, 6
Injecteur nanolitres	Société scientifique Drummond	Nanoject II	Injecteur à nanolitres
Feuilles de cire Parrafin	Amcor	Film polyvalent de laboratoire ParaFilm M
Pipetter	ThermoFisher Scientific	4641310N
Pulturage de la Puck	Atelier mécanique du département de physique de l’Université de Princeton	Produit personnalisé	Voir Fichier de code supplémentaire 4
Compteur de puissance	ThorLabs	PM100D
Pommade optique Puralube	Dechra	P1490-1
Python	Fondation Python Software	N/A
Tube en plastique souple pour cordon de remordage	McMaster-Carr	3774N4
SpinView	Teledyne FLIR	Version 1.25.0.52	Logiciel d’imagerie qui contrôle les caméras de comportement
Cadre stéréotaxique	Kopf Instruments	Modèle 1900
Documentation TMAC	N/A	N/A	Code TMAC : https://github.com/Nondairy-Creamer/tmac
Tubulure pour cadre stéréotaxique	Saint-Gobain	E-3603
Vaporisateur	Kent Scientific	Vaporisateur VetFlo