Ce protocole de recherche décrit un flux de travail optimisé pour le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) du liquide céphalorachidien. En relevant les défis propres aux échantillons à faible biomasse, la méthode permet une détection robuste des agents pathogènes dans divers contextes de ressources, offrant une base polyvalente pour les applications de recherche sur les maladies neuro-infectieuses.
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Article de méthode
Séquençage métagénomique de nouvelle génération du liquide céphalorachidien pour la détection des agents pathogènes du système nerveux central
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le séquençage de nouvelle génération métagénomique (mNGS) s’est imposé comme un outil puissant pour la détection impartiale des agents pathogènes et le profilage transcriptionnel de l’hôte en milieu clinique et de recherche. Bien que son utilité pour diagnostiquer les infections du système nerveux central (SNC) soit de plus en plus reconnue, les échantillons de liquide céphalo-rachidien (LCR) posent des défis uniques en raison d’une faible abondance d’acides nucléiques et d’une faible susceptibilité à la dégradation. Cette étude présente un protocole optimisé basé sur la recherche pour les plateformes de séquençage Illumina, adapté au mNGS du LCR, couvrant la manipulation des échantillons, l’extraction d’acides nucléiques, la préparation de bibliothèques, le séquençage et l’analyse bioinformatique. Des approches de contrôle qualité, adaptables à des environnements à haute ou faible ressources, sont également proposées, y compris des alternatives à l’électrophorèse capillaire. Cette étude démontre la robustesse du protocole à travers deux cohortes représentatives : un flux de travail à haute profondeur basé sur NovaSeq et un flux de travail basé sur NextSeq soucieux des coûts. Dans ces cohortes, des agents pathogènes ont été détectés dans plus de 50 % des cas, soulignant le potentiel diagnostique de la méthode même avec des adaptations limitées en ressources. Ce protocole facilite la reproduction du mNGS du LCR, fournissant une base pour diverses applications dans la recherche et le diagnostic des maladies neuro-infectieuses.
Introduction
Le séquençage métagénomique de nouvelle génération (mNGS) est une technique moléculaire de plus en plus utilisée qui permet la détection d’un large spectre d’acides nucléiques au sein d’un échantillon environnemental ou hôtedonné 1. En amplifiant et en séquençant la grande majorité du matériel génétique d’un échantillon, le mNGS ne nécessite pas d’hypothèse préconçue sur les micro-organismes spécifiques qui pourraient être présents. La mNGS s’est révélée utile comme outil diagnostique dans divers contextes cliniques, tels que la détection d’agents pathogènes rares ou de manifestations atypiques de maladies
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Protocole
Ce protocole a été développé et testé à partir d’échantillons collectés dans le cadre d’études approuvées par le comité d’examen institutionnel de l’UCSF.
Figure 1 : Traitement des échantillons de séquençage de nouvelle génération métagénomique du liquide céphalorachidien (LCR) et flux de travail analytique pour la détection des agents pathogènes. Ce diagramme illustre les principales étapes des voies de labora....
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Résultats
Contrôle qualité des bibliothèques
Après extraction de l’ADN/ARN, la concentration mesurée de l’ADN extrait est généralement de 1 à 10 ng/μL. Cependant, la concentration de l’ARN extrait est souvent de l’ordre de pg/μL, et il est donc fréquemment indétectable par les spectrophotomètres. Après la préparation de la bibliothèque, les bibliothèques d’ADN et de cDNA purifiées et amplifiées sont généralement à une concentration de 0,5–10 ng/μL et 10–30 ng/μL, respectivement.......
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Discussion
Il existe des considérations importantes qui peuvent nécessiter des modifications de ce protocole, selon la profondeur de séquençage souhaitée, la plateforme de séquençage utilisée et la disponibilité d’équipements pour le contrôle qualité. Néanmoins, les deux cohortes représentatives présentées ici démontrent qu’une détection robuste des agents pathogènes est possible dans un large éventail de conditions expérimentales. Plus précisément, la cohorte B a démontré que, malgré plusieurs mes.......
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Déclarations de divulgation
M.R.W. reçoit des financements de recherche non liés de Roche/Genentech, Novartis et Kyverna Therapeutics et est fondateur et membre du conseil d’administration de Delve Bio Inc. Il a assuré des services de conseil auprès de Pfizer, Vertex Pharmaceuticals, Ouro Medicines et Indapta Therapeutics.
Remerciements
Cette étude a été financée par le Fogarty International Center des National Institutes of Health sous le numéro de D43TW009343. Nous tenons à remercier les nombreux chercheurs du Wilson Lab, de l’UCSF et du CZI qui ont contribué au développement et à l’optimisation des protocoles mNGS pour diverses applications de recherche au cours des dernières années.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Bande de tube PCR 0,2 mL | Eppendorf | 30124359 | |
| Tubes de liaison ADN de 1,5 mL | Eppendorf | 30108051 | |
| Tubes de verrouillage sécurisé de 1,5 mL | Eppendorf | 30120191 | |
| Mélange d’ARN Spike-In de l’ERCC | Thermo Fisher | 4456740 | |
| Réactifs D1000 à haute sensibilité | Agilent | 5067-5585 | |
| Invitrogen Collibri Library Amplification Master Mix | Thermo Fisher | A38539050 | |
| Mastercycler x50 | Thermo Fisher | 6311000010 | |
| NEBNext Multiplex Oligos pour Illumina | New England Biolabs | 7335S/L | |
| Kit de préparation de la bibliothèque ADN NEBNext Ultra II | New England Biolabs | E7645 | |
| NEBNext Ultra II Kit de préparation de la bibliothèque ARN pour Illumina | New England Biolabs | E7770 | |
| NextSeq 500/550 Kit haute sortie v2.5 (150 cycles) | Illumina | 20024907 | |
| NextSeq 550 | Illumina | N/d | |
| QIAseq FastSelect -rRNA HMR Kit | Quiagen | 334386 | |
| Qubit 1X dsDNA kit de test à haute sensibilité | Qubit | Q33230 | |
| Fluoromètre Qubit 4 | Thermo Fisher | N/D | |
| Quick-DNA/ARN Microprep Plus Kit & nbsp ; | Zymo | D7005 | |
| TapeStation 4150 | Agilent | G2992AA |
Références
- Chiu, C. Y., Miller, S. A. Clinical metagenomics. Nat Rev Genet. 20 (6), 341-355 (2019).
- Wilson, M. R., et al. Clinical metagenomic sequencing for diagnosis of meningitis and encephalitis. N Engl J Med. 380 (24), 2327-2340 (2019).
- Forbes, J. D., Knox, N. C., Ronholm, J.,....
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Réimpressions et autorisations
