Ce protocole décrit une méthode d’extraction acide-solvant en deux phases pour isoler les acides gras à chaîne courte à partir d’échantillons fécales de souris à faible apport sans dérivation.
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Article de méthode
Extraction des acides gras à chaîne courte à partir des excréments de souris en utilisant une méthode acide-solvant en deux phases
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cet article décrit un protocole pour extraire les acides gras à chaîne courte (SCFA) à partir d’échantillons fécaux de souris à faible apport en utilisant une stratégie d’extraction acide-solvant en deux phases. La méthode est conçue pour des apports fécaux individuels d’environ 20 à 50 mg et utilise de l’acide chlorhydrique dilué et de l’acétate d’éthyle pour permettre la séparation des phases sans dérivation. Le protocole comprend l’homogénéisation fécale, l’acidification, le partitionnement des solvants organiques et la centrifugation à basse température, et peut être réalisé à l’aide d’équipements de laboratoire standards couramment disponibles dans les laboratoires de recherche. Après extraction, les SCFA conviennent à une analyse en aval par des plateformes systématiques basées sur la chromatographie gazeuse. L’exécution réussie du protocole est indiquée par la détection de pics de SCFA clairement résolus à des temps de rétention caractéristiques au-dessus du bruit de fond, comme démontré pour les SCFA fécaux majeurs tels que l’acétate, le propionate et le butyrate provenant d’échantillons individuels de souris. Ce protocole répond à un défi procédural courant dans les études sur les petits animaux en fournissant un flux de travail standardisé pour l’extraction de SCFA fécale à partir de matériel échantillon limité tout en maintenant la compatibilité avec les flux de travail analytiques courants.
Introduction
Ce protocole a été développé pour permettre l’extraction d’acides gras à chaîne courte (SCFA) à partir d’échantillons fécaux de souris à faible apport, dans un format compatible avec l’analyse systématique basée sur la chromatographie gazeuse (GC). Les SCFA sont des acides gras organiques volatils contenant moins de six atomes de carbone, incluant principalement l’acide acétique, l’acide propionique et l’acide butyrique, produits par le microbiote intestinal par la fermentation de fibres alimentairesindigestibles 1. La quantification de ces métabolites à partir de souris individuelles est fréquemment nécessaire dans les études sur les petits animaux où le matériel fécal est limité, et où les échantillons sont liés à des phénotypes comportementaux, métaboliques ou physiologiques 2,3,4,5,6. Un flux de travail d’extraction pratique et à faible entrée est donc nécessaire pour soutenir les conceptions expérimentales reposant sur des mesures SCFA par animal.
Les approches existantes pour l’analyse SCFA fécale présentent plusieurs contraintes méthodologiques. La quantification des SCFA dans des échantillons fécaux reste analytiquement difficile en raison de leur volatilité, de leur faible abondance et de la complexité des matricesbiologiques 7. Les flux de travail standards nécessitent souvent des étapes de dérivation, de grands volumes d’échantillons et des équipements spécialisés tels que la manipulation automatisée des liquides, des plateformes d’homogénéisation spécialisées ou les colonnes d’extraction en phasesolide 8, 9, 10, 11. Ces exigences peuvent limiter l’accessibilité et la scalabilité, en particulier dans les études chez la souris où la production fécale par animal est minimale et où l’échantillonnage longitudinal ou spécifique au génotype estcourant 12,13,14. En conséquence, il subsiste un manque méthodologique pour les protocoles permettant l’extraction SCFA à partir de petits apports fécaux sans dérivation, tout en restant compatibles avec les flux de travail standards de chromatographie en phase gazeuse.
Le protocole décrit ici répond à cette lacune en employant une stratégie d’extraction acide-solvant en deux phases utilisant de l’acide chlorhydrique dilué et de l’acétate d’éthyle. Le flux de travail comprend l’homogénéisation fécale, l’acidification, le partitionnement des solvants organiques et la centrifugation à basse température, et est conçu pour fonctionner avec de petites masses fécales d’entrée. Contrairement aux flux de travail basés sur la dérivatisation qui nécessitent des étapes supplémentaires de modification chimique ou des plateformes spécialisées de préparation d’échantillons, ce protocole permet l’extraction directe des SCFA dans un format compatible avec l’analyse de routine basée sur GC utilisant un équipement de laboratoire standard2.
Cette méthode est destinée aux études nécessitant l’extraction de SCFA à partir de quantités limitées de matières fécales de souris, en particulier lorsque des mesures individuelles sont nécessaires ou lorsque la disponibilité des échantillons limite la conception expérimentale. Il convient à l’analyse basée sur la GC des SCFA courants (C2–C6) dans des échantillons fécaux, mais n’est pas conçu pour des applications nécessitant une détection dépendante de la dérivé, une quantification ultra-trace au-delà de la sensibilité au GC, ou l’évaluation des concentrations systémiques de SCFA.
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Protocole
Le Comité permanent sur les animaux du Mass General Brigham (MGB), Boston, MA, États-Unis, a approuvé le protocole animalier précédent, conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés. Ce protocole respecte les directives et règlements des National Institutes of Health. Ce manuscrit a été élaboré selon les directives d’ARRIVE. Le diagramme protocolaire est illustré à la Figure 1, et les matériaux requis sont listés dans le tableau des matériaux.
Figure 1 : Schéma du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
1. Collecte et préparation des échantillons fécaux
- Prélever des échantillons de selles fraîches (~30 mg) dans des tubes de microcentrifuge séparés de 1,5 mL. Notez la masse fécale exacte pour chaque échantillon afin de permettre une normalisation précise des concentrations de SCFA.
REMARQUE : Assurez-vous que la prélèvement inclut des fioles, des gants et une pince à épiler propres pour chaque échantillon. Toute verrerie et instruments doit être autoclavé avant utilisation. Ce protocole a été validé pour des masses d’entrée fécale d’environ 20 à 50 mg par échantillon, avec ~30 mg utilisés comme entrée représentative. Les volumes d’extraction sont maintenus constants dans cette fourchette. - Placez et étiquetez le nombre nécessaire de fioles centrifugeuses correspondant aux échantillons.
- Préparez de l’acide chlorhydrique dilué (0,5 M ; pH 1–2) en ajoutant lentement du HCl concentré (12 M, grade réactif ACS) à de l’eau ultrapure.
ATTENTION : Le HCl est corrosif ; Elle peut provoquer de graves brûlures à la peau, aux yeux et aux voies respiratoires. Dangereux à inhaler. - Dégelez les échantillons à température ambiante pendant 30 à 45 minutes, ou jusqu’à ce qu’ils soient complètement décongelés.
2. Homogénéisation et acidification des échantillons
- Ajoutez 255 μL de la solution de 0,5 M HCl à chaque fiole de centrifugeuse.
- Prenez un flacon neuf et remplissez-le de 70 % d’éthanol pour nettoyer une pince à épiler. Nettoyez la pince en la trempant dans l’éthanol puis en les séchant sur un essuie-tout propre.
ATTENTION : L’éthanol est inflammable et peut irriter la peau et les yeux ; L’inhalation de vapeurs peut provoquer des vertiges. - Préparez un bain d’éthanol pour les pilons en les plaçant dans un récipient et en remplissant le contenant à 70 % d’éthanol jusqu’à ce que tous les pilons soient complètement immergés.
- Récupérez le bon échantillon dans la boîte d’échantillons. Retirez le couvercle du flacon et retirez un échantillon (~ 30 mg) de matières fécales.
- Placez les échantillons fécaux dans les fioles centrifugeuses correspondantes.
- Une fois tous les échantillons placés dans les fioles de centrifugeuse appropriés, retirez un pilon du bain d’éthanol. Séchez le pilon avec un essuie-tout propre.
REMARQUE : Utilisez un nouveau pilon pour chaque échantillon. - Utilisez les pilons pour écraser et dissoudre correctement les échantillons de fèces, voir Figure 2. Broyez l’échantillon fécal jusqu’à obtenir une suspension visuellement homogène, sans fragments solides visibles.
Figure 2 : Broyage des échantillons fécaux à l’aide d’un pilon. Les excréments fraîchement collectés sont broyés pour obtenir une consistance uniforme lors de l’analyse SCFA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
- Placez les pilons usagés dans une boîte vide pour les laver plus tard.
- Faites le vortex des échantillons à l’aide d’un mélangeur à vortex de type impulsion à vitesse maximale pendant 10 s, avec les tubes fermement bouchés.
REMARQUE : Assurez-vous que les fioles de centrifugeuse sont bien bien couvertes pour éviter que le mélange ne se renverse de façon appropriée.
3. Extraction SCFA et séparation de phase
- Centrifugez les échantillons à 16 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C, en assurant un bon équilibrage de la centrifugeuse.
- Après avoir démarré la centrifugeuse, identifiez les nouvelles fioles correspondant aux échantillons. Retirez les échantillons de la centrifugeuse une fois la centrifugation terminée.
- Réglez la pipette de 200 μL à 120 μL. Prélevez soigneusement 120 μL du surnageant aqueux après centrifugation, en évitant de perturber la pellete. Transférez le surnageant dans les fioles centrifugeuses nouvellement étiquetées et jetez la pastille.
- Ajouter une quantité égale (120 μL) d’acétate d’éthyle dans les fioles nouvellement étiquetées avec le liquide surnageant. Répétez cela pour tous les échantillons.
ATTENTION : L’acétate d’éthyle est inflammable et peut irriter la peau, les yeux et le système respiratoire. Évitez d’inhaler des vapeurs et de prolonger les contacts. - Ramène les échantillons à nouveau à la centrifugeuse. Assurez-vous que la centrifugeuse est bien équilibrée et que le couvercle du rotor est bien fixé. Faites tourner à 2 374 × g pendant 20 minutes à 4 °C.
- Après centrifugation, prélever soigneusement 120 μL de la phase organique supérieure sans perturber la phase aqueuse inférieure. Transférez le surnageant extrait contenant SCFA dans de nouveaux flacons centrifugeuses étiquetés.
REMARQUE : Le volume collecté peut être inférieur à 120 μL. Si une émulsion est présente à l’interface, prolongez la centrifugation ou refroidissez les échantillons sur de la glace jusqu’à obtenir une séparation de phase claire. Des échantillons vierges procéduraux traités en parallèle sans matières fécales peuvent être inclus comme étape optionnelle de contrôle qualité pour évaluer les niveaux de fond des SCFA introduits par les réactifs ou la manipulation. - Examinez les fioles précédentes pour vous assurer que la couche inférieure n’a pas été accidentellement relevée.
REMARQUE : Les étapes impliquant l’ajout d’acide et la manipulation des solvants organiques doivent être effectuées rapidement, en gardant les tubes bouchés autant que possible, afin de minimiser les pertes de volatilisation ou d’évaporation.
4. Manipulation et stockage des extractions
- Localisez et étiquetez correctement une boîte d’extraction, puis placez les échantillons extraits à l’intérieur.
REMARQUE : Les échantillons peuvent être mis en pause en toute sécurité après la collecte de la phase organique en conservant les extraits à −20 °C pendant jusqu’à 24 heures dans des tubes fortement bouchés, puis transférés à −80 °C pour un stockage à plus long terme. - Placez la boîte dans un congélateur à -80 °C en attendant l’analyse SCFA.
REMARQUE : Comme l’acétate d’éthyle et le SCFA sont très volatils, les échantillons extraits doivent être analysés rapidement après stockage à −80 °C. Un stockage prolongé à long terme peut compromettre l’intégrité de l’échantillon.
5. Analyse en chromatographie en phase gazeuse
- Analysez les SCFA extraits par GC à l’aide d’une colonne capillaire en silice fusionnée avec une phase stationnaire d’acide gras libre à des débits de 30, 300 et 20 mL/min pour l’hydrogène, l’air et l’azote, respectivement. Injectez une aliquote de 1 μL de l’extrait organique pour analyse.
- Pour les applications quantitatives, intégrer des normes internes et des procédures d’étalonnage (par exemple, acide 2-éthylbutyrique) comme décritprécédemment 2.
REMARQUE : Des réglages détaillés spécifiques à chaque instrument sont fournis dans les méthodesréférencées 14.
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Résultats
Le protocole ci-dessus aura permis d’extraire des aliquotes SCFA de 120 μL correspondant au nombre d’échantillons fécaux dont elles ont été extraites. L’exécution réussie du protocole d’extraction est indiquée par la présence de pics SCFA clairement résolus à des temps de rétention caractéristiques avec une intensité de signal supérieure au bruit de fond. Lorsqu’il est réalisé comme décrit, le protocole fournit des profils SCFA fécaux adaptés à une comparaison quantitative en aval entre ...
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Discussion
Ce protocole comprend plusieurs étapes critiques qui garantissent une extraction efficace et reproductible des SCFA à partir d’échantillons fécaux de souris de petit volume. Le protocole utilise un système d’extraction acide-solvant en deux phases utilisant des volumes définis d’acide chlorhydrique dilué et d’acétate d’éthyle, adapté aux propriétés physicochimiques des SCFAs en tant qu’acides organiques faibles de faible poids moléculaire. L’acidification déplace les SCFA en forme proton...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Remerciements
Nous remercions chaleureusement le soutien financier accordé à cette étude par les National Institutes of Health via R21AG065606 et R21AG08176 accordé à Yiying Zhang, ainsi que le soutien de la Borten Family Foundation et le don de la famille Tang à Yiying Zhang.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Centrifuge | ThermoFisher | 75003424 | "Sorvall Legend Micro 21R Microcentrifuge" |
| Centrifuge vials | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Microtube Rack | Millipore Sigma | HS29025F-5EA | |
| Ethyl acetate | ThermoFisher | 022912.K2 | HPLC Grade, ≥99.5% |
| Green pestles | Fisher Scientific | 50-189-9195 | |
| HCl | Fisher Scientific | SA49 | ACS Certified (10 N, solution de stockage); dilué à 0,5 M pour utilisation |
| 1000 µL pipette | USA Scientific | 7110-1000 | |
| 1000 µL pipette tips | USA Scientific | 1111-2821 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | Grade de biologie moléculaire, solution à 70% |
| 200 µL pipette | USA Scientific | 7100-2200 | |
| 200 µL pipette tips | USA Scientific | 1110-1800 | |
| Pinces | ThermoFisher | 046638.KT | |
| Vortex | Fisher scientific | 50-136-7909 | "Research Products International Corp VORNADO Miniature Vortex Mixer, Purple Cup" |
Références
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Réimpressions et autorisations
