Article de méthode

Évaluation fonctionnelle de la barrière épithéliale gingivale de la souris à l’aide de traçeurs fluorescents

DOI :

10.3791/70085

⸱

27 février 2026

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1Department of Physiology and Pathophysiology, Peking University School of Basic Medical Sciences, State Key Laboratory of Vascular Homeostasis and Remodeling, 2State Key Laboratory of Natural and Biomimetic Drugs, Peking University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’objectif de ce protocole est de fournir une approche standardisée pour évaluer quantitativement l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale murine en appliquant localement des dextrans marqués à la fluorescence de tailles moléculaires variées sur la surface gingive in vivo, suivies d’imagerie ex vivo à l’aide d’un système de microscopie à photon unique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La barrière épithéliale gingivale sert de défense de première ligne essentielle pour l’immunité orale et l’homéostasie. Une barrière épithéliale intacte empêche efficacement la pénétration des substances nocives depuis l’environnement buccal, tandis que sa perturbation est étroitement liée à la pathogenèse de maladies telles que la parodontite et le lichen plan oral. Ici, nous avons mis en place une méthode d’application topique pour évaluer l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale chez la souris. Premièrement, un mélange de dextrans marqués par fluorescence avec différents poids moléculaires (40 ou 70 kDa) dans un carboxyméthylcellulose de sodium à 2 % a été appliqué de façon topique sur la surface gingivale labiale de la région molaire. Après une période d’incubation de 30 minutes, le maxillaire était disséqué et fixé dans un support personnalisé pour une imagerie immédiate à l’aide d’un système de microscopie à photon unique. Cette approche permet de visualiser et de quantifier des traceurs de différentes tailles à travers les couches épithéliales, fournissant une lecture fonctionnelle de l’intégrité de la barrière épithéliale gingivale applicable aux études sur l’inflammation buccale, la cicatrisation des plaies et la modélisation des maladies.

Introduction

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La barrière épithéliale gingivale constitue une interface défensive critique dans la cavité buccale, préservant l’intégrité tissulaire en régulant sélectivement le transport des substances tout en empêchant l’invasionmicrobienne 1. Composée d’épithélium squameux stratifié interconnecté par des complexes de jonction étroite, cette structure dynamique contrôle précisément la perméabilité paracellulaire afin de restreindre la pénétration non sélective des micro-organismes, macromolécules etsolutés 2. Plusieurs facteurs peuvent compromettre l’intégrité de la barrière gingivale. La cavité buccale abrite la deuxième communauté microbienne la plus diversifiée du corps humain, avec plus de 700 espèces bactériennes colonisant les surfaces dentaires, les crevasses gingivales et la muqueusebuccale 3,4. Les cellules épithéliales tapissant les tissus gingivaux sont exposées de façon persistante à cet environnement microbiendense 5.

Les facteurs de virulence sécrétés par les agents pathogènes parodontaux (par exemple, Porphyromonas gingivalis), y compris les lipopolysaccharides, ont démontré qu’ils perturbent la fonction de la barrière épithéliale, déclenchant ainsi des réponses inflammatoires dans les tissus gingivaux et favorisant la progressionpathologique 6,7. Les médiateurs inflammatoires et les facteurs de stress mécanique aggravent encore la dysfonction de la barrière, augmentant la susceptibilité aux maladiesbuccales 8. Les probiotiques oraux peuvent aider à prévenir la maladie parodontale en favorisant la stabilité de la barrière épithéliale gingivale. Néanmoins, les interactions biologiques entre les micro-organismes et les cellules épithéliales gingivales dans la modulation de la fonction de la barrière restent largementinélucidées. Ainsi, le développement de méthodes fiables pour évaluer la fonction de la barrière épithéliale est d’une importance capitale.

La microscopie à balayage laser à photon unique, reconnue pour sa haute résolution et son système de détection établi, s’est révélée particulièrement précieuse pour l’examen d’échantillons de tissus ex vivo 10. Des méthodologies d’imagerie avancées améliorent significativement l’évaluation des propriétés de la barrière gingivale. La nature superficielle des tissus gingivaux, avec des cellules épithéliales situées à environ 100 μm de la surface, les rend parfaitement adaptés à ce type d’approches d’imagerie. Nos recherches ont mis en place une technique d’évaluation ex vivo utilisant des dextrans marqués par fluorescence de poids moléculaire variable comme traceurs de perméabilité paracellulaire. Combinée à la microscopie laser à photon unique, cette méthode permet une quantification précise de la fonction de la barrière épithéliale gingivale, fournissant des informations sur les mécanismes de la maladie parodontale et sur les interventions thérapeutiques potentielles.

Le protocole établi dans cette étude, combinant une administration localisée de traceurs à base de gel avec une imagerie ex vivo en trois dimensions, est spécifiquement optimisé pour relever les défis uniques liés à l’évaluation de la barrière épithéliale gingivale. Premièrement, les approches existantes d’injection intraveineuse de traceurs (Tableau 1) ne sont pas en mesure d’évaluer précisément la perméabilité des sites épithéliaux minuscules localisés aux agentsexternes 11. Deuxièmement, les approches histologiques traditionnelles nécessitent la décalcification et la coupe, ce qui perturbe l’architecture tissulaire et est laborieuse et chronophage12, 13, 14. En revanche, notre protocole utilise un gel hautement adhésif pour assurer une rétention efficace des traceurs sur la surface locale complexe. De plus, grâce à une image 3D, elle assure une quantification précise et non destructive de la profondeur de pénétration et de la distribution des traceurs au sein de l’épithélium gingival, préservant ainsi pleinement l’architecture spatiale du tissu. Par conséquent, cette méthode est particulièrement adaptée à l’évaluation spatiotemporelle à haute résolution de la fonction de la barrière épithéliale gingivale dans un environnement buccal complexe et confiné.

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Protocole

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Toutes les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d’éthique de la recherche animale du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin, et conformes au Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Publication NIH n° 85-23, révisée en 1996). Pendant le processus, les animaux expérimentaux ont été soigneusement traités afin de minimiser leur douleur et leur inconfort.

Les détails de chaque étape de travail pour l’évaluation de la perméabilité in vivo dans les épithélios gingivaux de souris sont décrits ci-dessous (Figure 1A). Nous avons ici donné un exemple de détection de la fonction de barrière épithéliale dans des modèles de parodontite murine induits par ligation et par Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis). Tout le personnel a reçu une formation complète au bien-être des animaux de laboratoire et à la technique aseptique.

1. Manipulation des animaux

  1. Tout au long de l’étude, les animaux domestiques sous des conditions standard sans agents pathogènes spécifiques (SPF) avec un cycle clair/obscur de 12 heures et fournissent nourriture et eau à volonté de manière arbitraire.
  2. Préparation et administration d’anesthésiques et de traceurs
    1. Maintenez des conditions stériles tout au long du protocole et utilisez des outils nettoyés à 75 % d’éthanol.
    2. Utilisez des souris mâles sauvages (WT) C57BL/6J dans la tranche adulte adulte de 8 à 10 semaines pour l’expérience. Divisez les souris en trois groupes : un groupe témoin (non traité) et deux groupes expérimentaux (modèles de parodontite chez P . gingivalis et ligation).
      REMARQUE : En groupe, il faut sélectionner des souris ayant un poids corporel et un âges d’une semaine similaires afin de réduire l’influence de l’âge et du poids sur la perméabilité épithéliale gingivale. Les modèles de parodontite musculée induite par ligature et P. gingivalis représentent des modèles couramment utilisés pour la parodontite chez la souris. Pour des protocoles de modélisation détaillés, consultez la littérature sur les modèles de parodontite murine induite par ligatureet 16 parodontite murine induits par la ligature et P. gingivalis.
    3. Sélectionnez des traceurs fluorescents avec des spectres non chevauchants, tels que le dextrane marqué FITC (40 kDa) ; FD40) et le dextrane marqué rhodamine B (70 kDa ; RD70), pour assurer une détection distincte des signaux à l’aide des filtres FITC et rhodamine correspondants.
    4. Diluez les traceurs. Pour suivre ce protocole, mélangez FD40 (1 g/L) et RD70 (1 g/L) dans un gel de carboxyméthylcellulose à 2 % et conservez à 4 °C.
    5. Injecter intrapéritonéalement 1,25 % de tribromoéthanol (200 mg/kg de poids corporel, 15-17 μL/g de poids corporel) pour anesthésier les souris.
      REMARQUE : Les solutions de tribromoéthanol sont sensibles à la lumière. L’alcool tert-amyle est un solvant organique inflammable, volatil et irritant. Toutes les procédures impliquant la préparation, la manipulation et l’administration doivent être effectuées dans une hotte chimique ou dans un endroit extrêmement bien ventilé, strictement éloigné de toute source d’allumage. Le personnel doit porter un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, comprenant des gants, des lunettes anti-éclaboussure chimiques et une blouse de laboratoire. Élimination des déchets : La solution de tribromoéthanol décheté, l’alcool tert-amyle et tous les matériaux contaminés (par exemple, seringues, pointes de pipette, gants) doivent être collectés et éliminés comme déchets chimiques dangereux, conformément strictement aux réglementations et protocoles de votre établissement concernant les produits chimiques inflammables et toxiques.
  3. Pendant l’anesthésie, maintenez la température corporelle centrale à 37 ± 0,5 °C à l’aide d’une bouillotte à rétroaction. Appliquez une pommade oculaire à l’yérthromycine pour éviter le dessèchement cornéen.
    REMARQUE : Fournir des soins appropriés à tous les animaux tout au long de l’étude.
  4. Après les interventions chirurgicales, assurez-vous que les animaux sont logés seuls sur une litière douce dans une cage de récupération chaude et calme jusqu’à ce qu’ils soient complètement déplacés. Surveillez les animaux deux fois par jour pendant 48 heures et ne les réintroduisez dans leur cage d’origine qu’après une récupération complète, selon la posture, l’activité et le comportement alimentaire normaux.
  5. Maintenez la cavité buccale ouverte avec un bâillon buccal et appliquez un mélange de 5 μL à 50 μL de deux traceurs paracellulaires ou plus avec des poids moléculaires différents localement à la surface gingivale labiale de la région molaire (Figure 1B). Laissez partir pendant 30 minutes. Si l’animal avale le mélange, réappliquez-le.
  6. Isolement du maxillaire
    1. Après 30 minutes d’application des traceurs de perméabilité, fixez les souris sur du carton, placez-les en position couchée, puis scotchez leurs membres.
    2. Après fixation, ouvrez la cavité buccale pour isoler le maxillaire. Retirez doucement les tissus environnants et rincez soigneusement l’échantillon avec du PBS.
    3. Placez le maxillaire sur une lame en verre, avec de l’argile à modeler positionnée de chaque côté pour faciliter le montage sécurisé d’une toile de couverture sur l’échantillon.

2. Installation du microscope à photon unique

  1. Positionnez soigneusement le maxillaire disséqué de la souris sur le porte-échantillon conçu sur mesure, afin d’assurer une position stable pour l’imagerie.
  2. Acquiescer les images à l’aide d’un microscope à photon unique vertical équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 25×/NA 1.0, en se concentrant sur la région de support montée sous le maxillaire.
    REMARQUE : Les signaux de fluorescence doivent être visibles immédiatement après le retrait du gel traceur.

3. Imagerie maxillaire

  1. Commencez l’imagerie immédiatement après avoir sélectionné la région d’intérêt sur la surface buccale de la deuxième molaire du maxillaire.
  2. Acquérir des images en pile Z d’une taille de pas de 1 μm, en partant de la surface gingivale du maxillaire jusqu’à une profondeur de 100 à 200 μm, pour une reconstruction tridimensionnelle (3D).
  3. Réaliser des imageries en série Z pour évaluer la perméabilité de la barrière épithéliale dans le maxillaire. Configurez les paramètres logiciels dans le logiciel référencé comme suit :
    1. Dans le menu Fichier, créez un nouveau dossier et attribuez-lui un nom descriptif pour le jeu de données.
    2. Dans l’onglet Acquisition , réglez le format XY à 512 × 512 avec une résolution de 0,99 μm/pixel.
    3. Réglez le facteur Zoom à 1.
    4. Régler les longueurs d’onde d’excitation à 488 nm (FD40) et 561 nm (RD70), avec des fenêtres d’émission de 500-550 nm et 570-620 nm, respectivement.
      REMARQUE : Les valeurs de gain ont été fixées respectivement à 50 (488 nm) et 60 (561 nm).
    5. Pour la série Z et l’imagerie 3D, sélectionnez le mode acquisition ND. Réglez le pas Z à 1 μm (ajustez si besoin).
  4. Une fois les paramètres configurés, sélectionnez le mode Live pour visualiser la zone gingivale dans les canaux de fluorescence individuels et fusionnés à l’intérieur de la fenêtre d’imagerie.
  5. Cliquez sur Exécuter maintenant pour commencer l’acquisition après la configuration des paramètres.

4. Mesure de la perméabilité

  1. Divisez l’intensité de fluorescence de FD40 et RD70 en différents canaux. Aucune soustraction en arrière-plan n’est requise ; fusionner les tranches de l’axe Z. Ensuite, utilisez le logiciel ImageJ pour calculer l’intensité de fluorescence afin d’évaluer la perméabilité et d’indiquer la fonction de barrière épithéliale.
    1. Cliquez sur Fichier et sélectionnez Ouvrir pour ouvrir l’image du maxillaire prise au microscope à photon unique.
    2. Allez dans le menu Image et changez le type d’image en format 8 bits pour analyse.
      REMARQUE : Les images capturées par des microscopes à fluorescence et des systèmes confocaux sont généralement au format RVB et ne peuvent pas être utilisées directement pour la mesure de l’intensité de fluorescence. Ils doivent être divisés en chaînes individuelles ou des images monochromes doivent être directement importées.
    3. Ouvrez le menu Analyser , choisissez Définir Mesures, et cochez Surface, Mean et IntDen. Confirmez en cliquant sur OK.
    4. Sélectionnez le canal à analyser et ajustez le seuil : Aller à Image | Ajuster | Seuil. Le système applique automatiquement une valeur et un algorithme par défaut, utilisant généralement le rouge pour indiquer certaines régions.
      REMARQUE : Comme les images fluorescentes présentent généralement des fonds noirs, sélectionnez également l’option Fond sombre .
    5. Définir les paramètres de mesure : Va dans Analyser et sélectionne Ensemble de mesures. Dans la boîte de dialogue, vérifiez Valeur grise moyenne et Limite jusqu’au seuil. Enfin, cliquez sur OK.
      REMARQUE : Il est recommandé de vérifier l’étiquette d’affichage afin que le nom de l’image apparaisse dans la table des résultats, ce qui facilite l’identification du groupe expérimental.
    6. Effectuer la mesure : Sélectionnez l’outil Sélections à main levée. Utilisez le curseur pour tracer manuellement et précisément le contour de la région du signal fluorescent du côté du tissu gingival. Cliquez sur Analyser | Mesurez. Le tableau des résultats apparaîtra, où IntDen représente l’intensité de fluorescence.
  2. Copiez les résultats dans un tableau Excel pour les calculs et importez pour les graphiques.
  3. Calcul de l’intensité relative de fluorescence : D’abord, calculez l’intensité moyenne de fluorescence du groupe témoin. Ensuite, divisez la valeur d’intensité de fluorescence de chaque groupe expérimental par la moyenne du groupe témoin pour obtenir l’intensité relative de fluorescence.

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Résultats

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Selon le protocole standardisé, le maxillaire de la souris contenant les tissus gingivaux était monté sur un support conçu sur mesure (Figure 1C). L’examen microscopique a révélé des signaux de fluorescence verts (FD40) et rouges (FD70) dans la gengive, démontrant la perméation des traceurs à travers la barrière épithélienne. Après avoir identifié la région d’intérêt sous la lentille oculaire, les images étaient acquises à l’aide du logiciel. Dans le groupe ...

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Discussion

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L’épithélium gingival sert de barrière physique essentielle contre l’invasion bactérienne, tandis que les micro-organismes oraux présentent une double capacité régulatrice, soit en perturbant l’intégrité de la barrière avec des facteurs de virulence, soit en favorisant son entretien. Ces interactions biologiques déterminent finalement l’homéostasie tissulaire ou la progression de lamaladie 17,18. Sur cette base, nous avons dévelo...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

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Cette étude a été financée par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 32030010, 31972908, 81991500, 81991502).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
40 kDa FITC-labeled dextranSigma Aldrich78331
70 kDa rhodamine B-labeled dextranSigma AldrichR9379
Blunt tissue separation nickelBejinghuabo CompanyNZW28
carboxymethylcelluloseMREDAM049898
Seringue stérile à usage uniqueZhiyu Company1 mL
Logiciel ImageJNational Institutes of Health
MicrotubesAxygenMCT-150-C1,5 mL
Logiciel d'image NIS-Elements ARNikon
Tampon phosphate 1xServicebioG4207-500
Microscope monophoton Nikon A1 MP+Nikon
Ciseaux à tissusBejinghuabo CompanyM286-05

Références

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Mots-clés

Gingival Epithelial BarrierFluorescent TracersOral ImmunityBarrier IntegrityMouse GingivaSingle Photon MicroscopyDextran TracersOral InflammationWound HealingDisease Modeling

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