Protocole pour l’étude de la régulation par Honokiol de la signalisation transformante du facteur de croissance bêta 1/SMAD dans les modèles de photovieillissement cutané induits par l’ultraviolet A

Résumé

Ce protocole étudie si l’honokiol améliore le photo-vieillissement induit par les UVA chez les fibroblastes dermiques humains et la peau de souris en activant la voie TGF-β1/Smad et en réduisant l’expression de MMP.

Résumé

L’Honokiol (HNK), un composant clé dérivé de Magnolia officinalis, a le potentiel de traiter les maladies de la peau. À l’heure actuelle, l’impact et le mécanisme d’action de la HNK sur les photodégâts cutanés induits par les ultraviolets A (UVA) sont incertains. Un modèle de dommages photo-vieillissants des cellules HDF et de la peau de souris sans poils a été construit par induction UVA. L’impact de la HNK sur la viabilité des cellules HDF normales et des cellules HDF induites par les UVA a été examiné via le test de viabilité cellulaire. Les niveaux de SOD, GSH, CAT et MDA dans les cellules HDF ont été mesurés à l’aide de différents kits, et les niveaux de ROS ont été mesurés à l’aide de DCFH-DA et de dihydroethidium. La coloration SA-β-galactosidase et TUNEL a détecté la sénescence et l’apoptose dans les cellules HDF, et la cytométrie en flux a évalué la progression du cycle cellulaire. Les lésions histopathologiques de la peau ont été évaluées par coloration pathologique. De plus, l’immunofluorescence et le Western blot ont été utilisés pour évaluer les niveaux de protéines associées à la voie de la voie TGF-β1/Smad en Ki67, du collagène, de la métalloprotéase matricielle (MMP) et du TGF-β1/Smad. Le traitement par HNK (2,5-10 μM) n’a eu aucun effet négatif sur la viabilité normale des cellules HDF mais a atténué les lésions cellulaires HDF induites par les UVA, réduisant le stress oxydatif et l’apoptose. Les UVA induisaient la sénescence des cellules HDF, provoquaient un arrêt de la phase S, une régulation à la baisse de Ki67, une diminution de la teneur en collagène et une augmentation de l’expression de MMP, tandis que HNK atténuait efficacement ces anomalies induites par les UVA. De plus, les UVA provoquaient des rides plus profondes, une diminution de la teneur en eau et de collagène, et une augmentation de l’épaisseur épithéliale dans la peau de la souris, tandis que l’injection sous-cutanée de HNK atténuait les lésions pathologiques des tissus cutanés et augmentait la teneur en eau et en collagène. De plus, le HNK a activé la voie TGF-β1/Smad, et l’inhibiteur TGF-β1 SB431542 altéré l’effet protecteur du HNK contre les dommages du photo-vieillissement dans les cellules HDF. En conclusion, le HNK a le potentiel d’être un médicament pour atténuer les dommages du photo-vieillissement en réduisant l’expression de MMP via l’activation de la voie TGF-β1/Smad, inhibant ainsi le photo-vieillissement induit par les UVA dans les cellules HDF et la peau de souris.

Introduction

Le processus de vieillissement cutané est complexe et divisé en deux formes principales : le vieillissement naturel et le^{photo-vieillissement 1}. Des études indiquent que jusqu’à 80 % à 90 % du vieillissement cutané est causé par des facteurs exogènes de l’environnement (par exemple, les rayons ultraviolets, la pollution de l’air), dont le photo-vieillissement à long terme induit par les rayons ultraviolets a les effets les plus^{graves 2,3}. Le rayonnement ultraviolet est divisé en UVC, UVB et UVA. Comme l’UVC ne peut pas pénétrer la couche d’ozone, les recherches actuelles sur le photo-vieillissement se concentrent sur les UVA (320-400 nm) et UVB (280-320 nm)^4,5,6. Comparé aux UVB, les UVA ont une énergie plus faible, mais ils sont plus pénétrants, traversant l’épiderme et pénétrant profondément le derme, ce qui est une cause importante du vieillissement sévère de^{la peau.} Des études antérieures ont montré que les dommages causés par l’irradiation UVB de 57 mJ^{/cm 2} et 20 UVA J^{/cm 2} aux cellules HaCaT sont^{comparables à 8}. Le photo-vieillissement de la peau provoque des changements dans la fonction et la structure de la peau, se manifestant spécifiquement par un affaissement des tissus de surface cutanée, un approfondissement des rides, une perte de collagène et l’apparition d’une couleur grise visible à l’œil nu ; Dans les cas graves, une variété de lésions bénignes précancéreuses et de tumeurs peuvent^{apparaître 9,10}. Avec l’augmentation de la recherche sur le vieillissement et l’anti-âge, les risques sanitaires liés au photovieillissement sont devenus l’une des préoccupations sanitaires les plus importantes dans le monde. Il est donc crucial d’étudier les processus physiopathologiques sous-jacents aux dommages du photo-vieillissement induits par les UVA, en vue de développer de nouvelles options thérapeutiques pour leur traitement.

Extrait de Magnolia officinalis, une plante médicinale traditionnelle chinoise, l’Honokiol (HNK) est un composé bioactif important avec la formule chimique de C₁₈H_{18O 2}¹¹. HNK présente diverses activités pharmacologiques, et son groupe hydroxyle phénolique est très sensible à l’oxydation et possède de forts effets antioxydants et de récupération des radicaux^{libres 12}. De plus, le HNK présente des effets pharmacologiques antibactérien, anti-inflammatoire, antiviral, antitumoral, antidépresseur, neuroprotecteur et anti-prématuré^{de l’insuffisance ovarienne} 13,14,15,16. Le HNK oral a été jugé essentiellement sûr dans des études animales et cliniques, et aucun effet indésirable significatif n’a été^{identifié 17, 18, 19}. Des études récentes ont montré que le HNK prévient le cancer de la peau induit par les^{UVB 20}, et inhibe la réponse inflammatoire cutanée induite par les UVB ainsi que l’hyperméthylation^{de l’ADN 21}, suggérant son utilisation potentielle dans le traitement des affections cutanées. Comparé aux agents anti-photo-âge largement utilisés, notamment la vitamine C et le resvératrol, le HNK possède des propriétés distinctes et supérieures : sa structure lipophile confère une meilleure perméabilité transdermique que la vitamine^{C hydrophile 22} ; et il présente une photostabilité et une biodisponibilité in vivo supérieures à celles du^{resvératrol 23}. Ces résultats précliniques soutiennent l’idée que le HNK possède un potentiel translationnel prometteur en tant que candidat sûr et efficace pour les produits de soin de la peau et les interventions cliniques contre les photodégâts cutanés induits par les ultraviolets. Cependant, l’impact du traitement HNK sur les dommages du photo-vieillissement cutanés causés par les UVA n’a pas encore été rapporté.

Le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) est une cytokine multifonctionnelle cruciale pour la croissance et le développement cellulaire, la réparation et la régénération des tissus, ainsi que la croissance et le développement des cellules, tissus et^{organes 24,25}. Il a été démontré que TGF-β1 transmet des signaux à la cellule principalement à travers des membres de la famille des protéines Smad, conduisant à la régulation spécifique de la transcription des gènes cibles en aval. Lorsque la signalisation TGF-β1 est activée, elle entraîne la phosphorylation de Smad2 et Smad3^26,27. Des études récentes ont montré un lien fort entre la voie TGF-β1/Smad et la fibrose cutanée et le^{photo-vieillissement 28,29}. Il a été rapporté que la cible mammifère de la rapamycine active la voie TGF-β1/Smad dans les tissus cutanés des rats, ce qui favorise à son tour la synthèse des céramides, essentiels pour conserver l’humidité cutanée et maintenir la barrière^{cutanée 30}. Notamment, il a été rapporté que le HNK a modulé la voie TGF-β1/Smad dans les cellules stellées hépatiques, ce qui, à son tour, a atténué la fibrose^{hépatique 31}. Ainsi, des modèles cellulaires et murins de lésion du photo-vieillissement induit par les UVA ont été établis, avec un traitement HNK de 2,5 à 10 μM dans les cellules HDF et une intervention HNK de 5 mg/kg ou 10 mg/kg chez des souris sans poils, afin d’explorer les effets du HNK sur les dommages du photo-vieillissement et son rôle potentiel dans la modulation de la voie TGF-β1/Smad. Cette étude visait à développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les photolésions cutanées induites par les UVA.

Protocole

Toutes les expériences de culture cellulaire ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles de biosécurité et menées dans des conditions de laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Des expériences sur les animaux ont été réalisées après approbation du Comité d’éthique animale du 988e hôpital de la Force logistique conjointe de soutien de l’Armée populaire de libération chinoise (numéro d’approbation : 2023-089).

Toutes les procédures expérimentales ont été menées en stricte conformité avec les directives institutionnelles et nationales pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. À la fin de l’expérience, les souris ont été euthanasiées par overdose de pentobarbital sodique (100 mg/kg, injection intrapéritonéale). Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale lors des procédures d’hébergement, de traitement et d’échantillonnage. Les réactifs, produits chimiques, équipements et logiciels utilisés dans le protocole sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Culture cellulaire et traitement

1. Cultivez des fibroblastes dermiques humains (HDF) dans un milieu de culture de fibroblastes. Maintenir les cultures à 37 °C dans un environnement saturé d’humidité avec 5 % de_CO2.
2. Remplacer le milieu de culture tous les 3 jours, et passer le HDF à un ratio de 1:3 lors de la confluence.
3. Irradiez du HDF avec des lampes UVA (spectre d’émission : 320-400 nm) à une dose de 5 J/^{cm 2}.
4. Reconstituez avec un miel frais immédiatement après 30 minutes d’irradiation UVA. Répétez l’irradiation UVA une fois par jour pendant 8 jours^{consécutifs 32}.
5. Traiter la HDF avec 2,5, 5, 10, 20 ou 40 μM HNK pendant 24 h ou 48 h dans les expériences de dépistage^{de dose 33}. Traiter la HDF avec 2,5, 5 ou 10 μM HNK pendant 24 heures, suivie d’une irradiation UVA (5 J/^{cm 2}) lors des expériences suivantes.
6. Exposer le HDF à 10 μM de HNK pendant 4 heures, puis incuber avec un inhibiteur de TGF-β1 à 10 μM SB431542 pendant 24 heures, et enfin irradier avec UVA (5 J/cm²) dans le groupe HNK+SB431542.

2. Évaluation de la viabilité cellulaire

1. Inoculez le HDF dans des plaques de culture cellulaire à 96 puits à une densité de 1×^{10 4} cellules/puits.
2. Après différents traitements, ajoutez 10 μL de réactif de sel tétrazolique soluble à 10 % dans l’eau à chaque puits pour un volume final de 100 μL par puits, puis incubez les cellules à 37°C pendant 1,5 h dans l’obscurité.
3. Mesurez les valeurs OD450 des cellules à l’aide d’un lecteur de microplaques.

3. Détermination des niveaux de superoxyde de dismutase (SOD), de malondiadéhyde (MDA), de catalase (CAT) et de glutathion (GSH)

1. Lavez le HDF avec 1 mL de PBS pré-refroidi (0,01 M, pH 7,4), ajoutez une solution de préparation d’échantillons SOD de 200 μL (provenant du kit d’analyse SOD) pour lyser les cellules sur glace pendant 15 minutes.
2. Centrifugez le lysat à 8000 × g pendant 5 minutes à 4 °C, puis collectez le surnageant comme échantillon de test.
3. Utilisez un kit de test protéique BCA (acide bicinchoninique) pour déterminer la concentration protéique du surnageant, et ajustez l’échantillon à 50 μg de protéines totales dans un volume de 50 μL.
4. Mélangez l’échantillon de protéine de 50 μg avec le tampon SOD pour obtenir un volume de réaction final de 200 μL, puis incubez le mélange à 37 °C pendant 30 minutes dans l’obscurité, puis mesurez la valeur OD450.
5. Prenez le même surnageant lysat cellulaire utilisé pour le test SOD, mesurez les niveaux de CAT, GSH et MDA à l’aide des kits de test respectifs.

4. Mesure des niveaux cellulaires de ROS

1. Traiter les cellules HDF présentant différentes conditions, rincer deux fois avec 500 μL PBS, et bien mélanger avec une sonde fluorescente de 500 μL d’espèces réactives d’oxygène de 10 μM, puis incuber à 37 °C pendant 20 minutes à l’écart de la lumière.
2. Centrifugez à 1000 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour collecter les cellules, puis rincez deux fois avec 500 μL PBS.
3. Resuspendez les cellules dans un milieu de culture cellulaire de 500 μL, puis analysez la coloration par cytométrie en flux.
4. Enregistrer l’intensité de fluorescence à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux, puis calculer les niveaux de ROS en fonction de l’intensité de fluorescence : un ROS plus élevé correspond à une fluorescence verte plus forte.

5. Coloration β-galactosidase (SA-β-galactosidase) associée à la sénescence

1. Semez le HDF dans des plaques de culture cellulaire à 6 puits à une densité de 1×^{10 6} cellules/puits et cultivez jusqu’à l’adhérence. Après différents traitements, lavez le HDF une fois avec 2 mL de PBS.
2. Ajoutez 1 mL de fixateur colorant β-galactosidase dans chaque puits, puis incubez les cellules à température ambiante avec un fixateur pendant 15 minutes.
3. Lavez les cellules 3 fois avec 2 mL de PBS, ajoutez 1 mL de solution de coloration à chaque puits, puis incubez à 37°C toute la nuit dans l’obscurité.
4. Observez et photographiez les cellules au microscope optique (les cellules sénescentes paraissent bleues).

6. Analyse du cycle cellulaire

1. Ensemencer la HDF en plaques à 6 puits à 1×10⁶ cellules/puits ; après différents traitements, rince les cellules deux fois avec 2 mL de PBS.
2. Centrifugez à 1000 × g pendant 5 minutes à température ambiante pour collecter les cellules, ajoutez 1 mL d’éthanol à 70 % (fixateur cellulaire), puis mélangez doucement en pipettant. Placez les cellules fixes dans un réfrigérateur à 4°C pendant 12 heures.
3. Préparez 500 μL par échantillon de solution de coloration cellulaire en mélangeant du iodure de propidium (PI, concentration finale 50 μg/mL) et de RNaseA (concentration finale 200 μg/mL) dans PBS. Exposez les cellules à 500 μL de solution colorante, incubez dans l’obscurité à 37°C pendant 30 minutes.
4. Évaluer l’intensité de fluorescence à l’aide de la cytométrie en flux. Effectuer une analyse du cycle cellulaire à l’aide d’un cytomètre en flux.

7. Teinture TUNEL

1. Exposez les cellules HDF de différents groupes de traitement à 1 mL de paraformoldéhyde à 4 % et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.
2. Ajoutez 1 mL de PBS contenant 0,3 % de Triton X-100 aux cellules et faites éclore à température ambiante pendant 5 minutes.
3. Lavez les cellules deux fois avec du PBS, puis ajoutez une solution de test TUNEL de 500 μL goutte dans les gouttes pour couvrir uniformément les cellules. Incuber à 37°C dans le noir pendant 1,5 heure.
4. Ajoutez 200 μL de solution de coloration DAPI pour recouvrir les cellules, puis incubez à l’écart de la lumière pendant 10 minutes à 25 °C.
5. Scellez les cellules avec un support de maintien du signal de fluorescence, puis observez-les et photographiez-les au microscope à fluorescence (les cellules TUNEL-positives montrent une fluorescence verte).

8. Coloration par immunofluorescence

1. Séminez les cellules HDF de différents groupes de traitement en plaques à 12 puits. Une fois que la densité cellulaire atteint 50 % à 60 %, exposez les cellules à 1 mL de paraformoldéhyde à 4 % et incubez à température ambiante pendant 25 minutes.
2. Ajoutez 1 mL d’albumine sérique bovine (BSA) à 5 % goutte par goutte pour bloquer la surface cellulaire, puis faites éclore à température ambiante pendant 30 minutes.
3. Ajoutez 500 μL d’anticorps primaires Ki67 (1:300), collagène I (1:100), métalloprotéinase matricielle (MMP)-1 (1:50) ou MMP-3 (1:100) goutte à goutte, et incubez à 4°C pendant la nuit.
4. Le lendemain, incubez les cellules avec 500 μL d’anticorps secondaire marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) (1:100) à 37°C de la lumière pendant 1 heure.
5. Ajoutez 200 μL de solution de coloration DAPI pour recouvrir les cellules, incubez à l’abri de la lumière pendant 10 minutes, observez au microscope à fluorescence, puis analysez avec un logiciel d’analyse d’image (les cellules positives au collagène I et MMP-1 présentent une fluorescence rouge, les cellules positives Ki67 et MMP-3 montrent une fluorescence verte).

9. ELISA

1. Ajoutez 100 μL de surnageant de culture cellulaire HDF dans des puits de plaques de kit MMP-1 ou MMP-3 ELISA, et incubez à 37°C pendant 2 heures.
2. Lavez les puits 3 fois avec 200 μL de PBS, puis ajoutez 100 μL de l’anticorps correspondant à chaque puits et incubez à 37 °C dans l’obscurité pendant 1 heure.
3. Rincez les puits 3 fois avec 200 μL de tampon de lavage (fourni dans le kit), secouez l’excès de solution, puis incubez les échantillons avec 100 μL de streptavidine-HRP pendant 30 minutes à 37°C dans l’obscurité.
4. Après avoir rincé avec du PBS, ajoutez 100 μL de substrats A et B selon les instructions du kit et faites éclore à 37°C dans le noir pendant 10 minutes.
5. Ajouter 50 μL de solution de terminaison, bien mélanger, évaluer la valeur OD₄₅₀ à l’aide d’un lecteur de microplaques, et calculer la concentration.

10. Construction de modèles de souris par dommages liés au photo-âge

1. Femelles SKH1 de qualité SPF (15-20 g, 4-5 semaines) à 22 °C avec une humidité de 55 % à 60 %, permettant un accès autonome à la nourriture et à l’eau. Désinfectez régulièrement les installations, y compris les récipients alimentaires, les bouteilles d’eau et les goulins à boire.
2. Assignez aléatoirement les souris au groupe témoin (n=6) et au groupe modèle (n=18). Souris du groupe modèle irradié avec UVA à 0,35 J/^{cm 2} pendant 8 semaines³⁴ ; Des souris du groupe témoin en maison dans le même environnement sans irradiation UVA.
3. Divisez les souris du groupe modèle également en 3 sous-groupes (n=6 chacun).
4. Administrez deux fois par semaine des injections sous-cutanées de HNK à 5 mg/kg ou 10 mg/kg en volume de 100 μL à deux sous-groupes lors de l’irradiation UVA (enregistrés respectivement dans le groupe HNK à 5 mg/kg et au groupe HNK à 10 mg/kg). Administrez des injections sous-cutanées de 100 μL de solution saline deux fois par semaine au troisième sous-groupe lors de l’irradiation UVA (enregistré comme groupe UVA).
5. Évaluer la formation des rides cutanées et la teneur en eau après une modélisation^{réussie 35}.
6. Euthanasiez les souris avec du pentobarbital sodique (100 mg/kg) intrapéritonéalement, puis prélève des tissus cutanés dorsaux pour d’autres expériences.

11. Mesure du contenu en collagène I de la peau

1. Collectez 50 mg de tissus cutanés dorsaux de souris, broyez-les soigneusement dans de l’azote liquide, puis lissez-les à l’aide de 500 μL de tampon de lyse RIPA pré-refroidi pendant 30 minutes sur glace.
2. Centrifugez le lysat à 8000 × g pendant 5 minutes à 4 °C, collectez le surnageant et mesurez la teneur en collagène à l’aide d’un kit de test peptidique pro-collagène I C selon les instructions du fabricant.

12. Coloration de l’hématoxyline et de l’éosine (HE)

1. Fixez les tissus cutanés de souris dans 10 mL de paraformel à 4 % à température ambiante pendant 24 heures, déshydratez-les dans de l’éthanol en gradient (50 %, 75 %, 95 %, 100 %, chacun pendant 5 minutes), insévez dans la paraffine, puis coupez en tranches de 4 μm.
2. Faites cuire les tranches à 65°C pendant 8 heures, déparaffinez dans le xylène deux fois pendant 10 minutes chacune, puis réhydratez-les dans de l’éthanol gradient à température ambiante.
3. Colorez les tranches avec une solution d’hématoxyline pendant 8 minutes, rinçez avec de l’eau du robinet courante pendant 1 minute, différenciez avec une solution différenciante pendant 30 s, et colorez à l’éosine pendant 1 minute à température ambiante.
4. Déshydratez les tranches colorées dans de l’éthanol dégradé, transparent en xylène, scellez avec un support de montage, puis observez au microscope (le noyau cellulaire apparaît bleu-violet, tandis que le cytoplasme, les fibres de collagène et les érythrocytes apparaissent roses, à des degrés divers).

13. Coloration de Masson

1. Colorez les sections de paraffine des tissus cutanés de souris à l’aide du kit de coloration Masson^{trichrome 36}. Déparaffinez les sections de paraffine dans le xylène deux fois pendant 10 minutes chacune, ajoutez la solution colorante à l’hématoxyline de fer Weigert, et colorez pendant 10 minutes.
2. Différenciez avec une solution de différenciation à l’éthanol acide pendant 30 secondes, rinçez avec de l’eau du robinet courante pendant 5 minutes, puis colorez avec une solution de coloration Ponceau-fuchsine goutte par goutte pendant 10 minutes à température ambiante. Effectuez un bleu inversé avec la solution bleue de Masson, puis rinçez à l’eau distillée pendant 1 minute.
3. Préparer une solution de travail acide faible au rapport d’eau distillée : solution acide faible (fournie dans le kit) = 2:1 ; Ajoutez 1 mL de solution acide faible de travail goutte dans les gouttes et lavez pendant 30 s à température ambiante.
4. Versez l’excès de liquide, ajoutez 1 mL de solution acide phospholybdique goutte à goutte, puis traitez pendant 2 minutes à température ambiante. Ajoutez 1 mL de la solution acide faible de travail en drop-à-goutte, puis lavez pendant 30 s.
5. Versez l’excès de liquide, ajoutez 1 mL de solution colorante au bleu aniline goutte dans la goutte et teignez pendant 1 minute. Ajoutez 1 mL de solution acide faible de travail goutte dans la goutte et lavez pendant 30 secondes.
6. Déshydrate rapidement dans 95 % d’éthanol pendant 2 secondes. Déshydrate dans de l’éthanol absolu deux fois, 10 secondes à chaque fois.
7. Après séchage, dégagez les sections au xylène et montez avec de la gomme neutre. Observez la distribution des fibres de collagène dans chaque groupe au microscope (les fibres de collagène apparaissent bleues, tandis que les fibres musculaires, cytoplasmes et érythrocytes sont rouge vif, et les noyaux cellulaires apparaissent nettement bleu-noir).

14. Mesure des niveaux de ROS dans les tissus cutanés

1. Prenez des sections congelées de tissu cutané de souris (préparées dans la 1 heure suivant l’excision), étalez 1 mL de solution nettoyante goutte à goutte sur toute la surface de la section, puis laissez-la reposer à température ambiante pendant 10 minutes.
2. Secouez la solution de lavage, puis ajoutez 1 mL de sonde d’espèces réactives d’oxygène à 10 μM goutte par goutte pour recouvrir uniformément les sections ; Incubez à 37 °C de la lumière pendant 30 minutes.
3. Rincez les sections deux fois avec du PBS, ajoutez des bâtons de couverture, et observez à l’aide d’un microscope à fluorescence (les zones ROS-positives présentent une fluorescence rouge ; plus le niveau ROS est bas, plus le signal de fluorescence rouge est faible).

15. Tests d’indicateurs biochimiques

1. Collectez le sérum pour souris et préparez les réactifs de détection selon les instructions des kits de test correspondants.
2. Mesurez les activités de l’aspartate transaminase (AST) et de l’alanine transaminase (ALT) dans le sérum de souris à l’aide des kits respectifs.
3. Déterminez les niveaux d’urée sanguine en azote (BUN) et en créatinine (CRE) dans le sérum de souris à l’aide des kits respectifs.

16. Western blot

1. Collectez 50 mg de tissu ou 1×10⁶ cellules, lisez les échantillons sur de la glace pendant 30 minutes à l’aide d’un tampon de lyse RIPA de 200 μL pour obtenir des protéines.
2. Centrifugez à 8000 × g pendant 5 minutes à 4 °C et collectez le surnageant. Évaluez la teneur en protéines dans les cellules et les tissus à l’aide du kit de dosage de concentration en protéines BCA.
3. Effectuer l’électrophorèse des protéines échantillons sur un gel SDS-PAGE à 12 %, et transférer les protéines séparées vers les membranes PVDF à 4 °C.
4. Bloquez les membranes PVDF avec 5 % de BSA pendant 3 heures à température ambiante. Rincez les membranes avec TBST (contenant 20 mM de Tris-HCl, 150 mM de NaCl et 0,1 % de Tween-20) 3 fois, puis incubez toute la nuit à 4°C avec des anticorps primaires : P53 (1:1000), P21 (1:1000), P16 (1:100), collagène I (1:1000), cycline A2 (1:500), kinase dépendante de la cycline 2 (CDK2, 1:1000), MMP-1 (1:500), MMP-3 (1:1000), TGF-β1 (1:1000), Smad2 (1:1000), Smad3 (1:1000), p-Smad2 (1:1000) ou p-Smad3 (1:1000).
5. Le deuxième jour, lavez les membranes avec TBST 3 fois, puis incubez avec 1 mL d’IgG anti-lapin de chèvre (1:10000) à température ambiante pendant 2 heures. Appliquez 500 μL du réactif à chimiluminescence améliorée (ECL) de façon uniforme sur les membranes, puis scannez-les à l’aide d’un système d’imagerie en gel.
6. Effectuer une analyse de la valeur grise à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Exprimez le niveau d’expression relatif comme le rapport entre sa valeur grise et celle de GAPDH.

17. Analyse statistique

1. Pour les tests cellulaires in vitro , toutes les expériences sont répétées indépendamment trois fois (n=3, réplications biologiques).
2. Pour les expériences animales in vivo , 6 souris sont incluses par groupe (n=6), ce qui respecte les principes 3R pour le bien-être et l’éthique des animaux de laboratoire.
3. Tous les résultats sont exprimés en moyenne ± écart-type. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique. La normalité des données a été testée à l’aide du test de Shapiro-Wilk.
4. Pour les données distribuées normalement, utilisez l’ANOVA unidirectionnelle pour la comparaison multi-groupes, suivie du test post-hoc de Tukey pour les comparaisons par deux entre groupes. Pour les données non distribuées normalement, appliquez le test de Kruskal-Wallis non paramétrique. P< 0,05 indique une différence significative.
5. Générez des graphiques à l’aide d’un logiciel de graphique.

Résultats

Le HNK atténue les dommages causés par le stress oxydatif dans les cellules HDF par les UVA
Les impacts de diverses concentrations de traitement par HNK pendant 24 h ou 48 h sur la viabilité des cellules HDF ont été examinés par test de viabilité cellulaire afin de déterminer la concentration et la durée du traitement appropriées. Les résultats ont montré que 2,5, 5 et 10 μM de HNK n’affectaient pas significativement la viabilité des cellules HDF normales après 24 ou ...

Discussion

La lumière ultraviolette est un facteur environnemental qui nuit aux cellules et aux organismes. Des études antérieures ont rapporté que les UVA, avec leur grande puissance de pénétration, sont le principal type de lumière ultraviolette atteignant la^{surface de la Terre 38}. Les fibroblastes sont des cellules fonctionnelles importantes du derme, et leur vieillissement peut directement ou indirectement entraîner le vieillissement de la peau³⁹....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Kit d’évaluation d’activité ALT	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	P2711M	Kit de détection d’activité de la transaminase à l’alanine
Kit d’analyse CRE Amplex Red	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0291S	Kit de détection de créatinine
Milieu de montage anti-décoloration	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	P0126	Milieu de montage pour la conservation du signal de fluorescence
Kit d’analyse d’activité AST	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	P2715S	Kit de détection d’activité de l’aspartate transaminase
Kit de test protéique BCA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	P0012	Kit de détermination de la concentration en protéines
BSA	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	V900933	réactif bloquant pour la liaison non spécifique
Kit de test BUN	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0574S	Kit de détection d’azote d’urée sanguine
Kit de test CAT	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0051	Kit de détection d’activité de catalase
Réactif CCK-8	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	96992	Solution d’essai de viabilité cellulaire, qui est un sel tétrazolique soluble dans l’eau
Anticorps CDK2	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA5-79024	anticorps principal pour la détection de CDK2
Agent chimiluminescent ECL	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, États-Unis	HY-K1005	Réactif de détection chimioluminescence améliorée
Anticorps du collagène I	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA1-26204	anticorps primaire pour la détection du collagène I
Anticorps de la cycline A2	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA5-34682	anticorps primaire pour la détection de la cycline A2
Solution de coloration DAPI	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	D9542	Colorant nucléaire
Sonde fluorescente DCFH-DA	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, États-Unis	HY-D0940	Sonde fluorescente des espèces réactives d’oxygène
Solution de différenciation	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	C0161s	Réactif pour l’étape de différenciation de l’hématoxyline
Sonde dihydroethidium	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0063	Sonde d’espèces réactives de l’oxygène
Milieu de culture de fibroblastes	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Chine	SNPM-H342	Milieu de culture complet pour la croissance des fibroblastes
IgG anti-lapin marqué FITC pour la chèvre	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	F-2765	Anticorps secondaire marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC)
Cytométrie en flux	BD biosciences, San Jose, CA, États-Unis	BD FACSCaliburTM	Cytomètre à débit
Logiciel FlowJo	BD biosciences, San Jose, CA, États-Unis	v10.8	Logiciel d’analyse de cytométrie en flux
Microscope à fluorescence	Leica, Heidelberg, Allemagne	DM IL A DIRIGÉ	Microscope pour l’imagerie à fluorescence
Anticorps GAPDH	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA1-987	Anticorps de contrôle interne pour la normalisation des protéines
Système d’imagerie gel	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	iBright CL1500	Système d’imagerie pour la détection des protéines
chèvre anti-lapins IgG	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	31460	Anticorps secondaire pour l’immunodétection
Logiciel Graphpad Prism 9.0	GraphPad Software, San Diego, CA, États-Unis	Prism 9.0	Logiciels de graphisme
Kit de test GSH	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0053	Kit de détection de contenu en glutathion
Kit de coloration HE	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	C0105S	Kit de coloration histologique pour l’analyse morphologique tissulaire
HNK	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, États-Unis	HY-N0003	Honokiol, composé bioactif
Fibroblastes dermiques humains	Sunncell Biotechnology Co., Ltd., Wuhan, Hubei, Chine	SNP-H342	Cellules primaires de fibroblastes de la peau humaine
Logiciel IBM SPSS Statistics 26.0	IBM Corporation, Armonk, NY, États-Unis	IBM SPSS Statistiques 26.0	Logiciel d’analyse statistique
Logiciel ImageJ	Wayne Rasband, Institut national de la santé mentale, États-Unis	Version 1.54H	Logiciels d’analyse d’images
Anticorps Ki67	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	MA5-14520	Anticorps primaire pour la détection des marqueurs de prolifération cellulaire
Microscope optique	Leica, Heidelberg, Allemagne	DM3000	Microscope optique pour l’imagerie en champ clair
Kit de coloration trichrome Masson	Solarbio, Pékin, Chine	G1340	Kit de coloration du collagène et des tissus conjonctifs
Kit de test MDA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0131S	Kit de détection du niveau de malondiadéhyde (marqueur de peroxydation lipidique)
Lecteur de microplaques	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, États-Unis	1410101	Instrument de mesure d’absorption pour les tests à base cellulaire
Anticorps MMP-1	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA5-27210	anticorps primaire pour la détection de la métalprotéinase-1 de la matrice
Kit MMP-1 ELISA	Biotechnologie liée aux enzymes, Shanghai, Chine	ml038199	détection quantitative de MMP-1 dans des échantillons biologiques
Anticorps MMP-3	Abcam, Cambridge, MA, États-Unis	AB52915	Anticorps primaire pour la détection de la métalprotéinase matricielle-3
Kit MMP-3 ELISA	Biotechnologie liée aux enzymes, Shanghai, Chine	ml105322	détection quantitative de MMP-3 dans des échantillons biologiques
Gomme neutre	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	C0173	Milieu de montage
Anticorps P16	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	PA5-20379	Anticorps primaire pour la détection de la protéine P16
Anticorps P21	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	MA5-14949	Anticorps primaire pour la détection de la protéine P21
Anticorps P53	Abcam, Cambridge, MA, États-Unis	ab131442	Anticorps primaire pour la détection de la protéine P53
paraformoldéhyde	Solarbio, Pékin, Chine	P1110	Réactif de fixation cellulaire et tissulaire
PI	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	ST512	Iodure de propidium pour la coloration de l’ADN dans l’analyse du cycle cellulaire
Kit de test peptidique pro-collagène I C	TAKARA, Tokyo, Japon	MK101	Kit de détection de synthèse de collagène
Anticorps p-Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	44-244G	anticorps primaire pour la détection de Smad2 phosphorylée
Anticorps p-Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	44-246G	anticorps primaire pour la détection de Smad3 phosphorylée
Membranes PVDF	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	88520	Membrane de transfert protéique pour le Western Blotting
Tampon de lyse RIPA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	P0013B	Tampon d’extraction protéique pour les lysats cellulaires et tissulaires
RNaseA	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	ST579	ribonucléase pour l’élimination de l’ARN lors de la coloration de l’ADN
Kit de coloration SA-&bêta ;-galactosidase	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	C0602	Kit de détection de sénescence cellulaire
SB431542	MedChemExpress, Monmouth Junction, NJ, États-Unis	HY-10431	TGF-& bêta ; 1 inhibiteur de la voie de signalisation
Gels SDS-PAGE	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	WG1403BX10	Gels de polyacrylamide pour l’électrophorèse des protéines
Souris sans poils SKH1	Vitalriver, Pékin, Chine		Modèle animal pour les études de photo-vieillissement cutané
Anticorps Smad2	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	51-1300	anticorps primaire pour la détection de Smad2
Anticorps Smad3	Invitrogen, Carlsbad, CA, États-Unis	51-1500	anticorps primaire pour la détection de Smad3
Kit d’analyse SOD	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	S0101S	Kit de détection de l’activité de superoxyde dismutase
TGF-& bêta ; 1 anticorps	Abcam, Cambridge, MA, États-Unis	ab215715	anticorps primaire pour TGF-& bêta ; 1 Détection
Triton X-100	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	X-100	Détergent non ionique pour la perméabilisation des membranes cellulaires
Solution de test TUNEL	Beyotime Biotechnology, Shanghai, Chine	C1086	Réactif de détection d’apoptose pour la fragmentation de l’ADN
Xylène	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, États-Unis	247642	Solvant organique pour la déparaffinisation tissulaire