Article de méthode

Isolement et culture des préadipocytes blancs et bruns à partir d’embryons de souris

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DOI :

10.3791/70101

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17 avril 2026

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1Laboratory Lille Neuroendocrinology, Lille Neuroscience & Cognition, University of Lille, Inserm, CHU Lille

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous présentons une approche nouvelle, robuste et reproductible pour isoler et cultiver des préadipocytes blancs et bruns à partir d’embryons de souris, en établissant une stratégie in vitro puissante pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires régissant l’engagement et la différenciation de la lignée des adipocytes, et fournissant un cadre pour étudier l’impact du développement du tissu adipeux.

Résumé

Le tissu adipeux joue un rôle central dans l’homéostasie métabolique, et ses propriétés sont façonnées lors du développement embryonnaire par la différenciation des adipocytes. Les préadipocytes embryonnaires représentent donc un modèle pertinent pour étudier les événements précoces dans la formation du tissu adipeux et la spécification de la lignée. Cet article décrit un protocole reproductible pour l’isolement et la différenciation in vitro des préadipocytes blancs et bruns isolés à partir d’embryons de souris au jour embryonnaire 15,5 (E15,5), un stade de développement au cours duquel les dépôts adipeux commencent à se former. La méthode fournit des indications détaillées pour la microdissection tissulaire, la digestion enzymatique, la culture primaire et les conditions de différenciation spécifiques à la lignée qui soutiennent la viabilité cellulaire et la maturation adipogénique. Les résultats représentatifs incluent l’accumulation de gouttelettes lipidiques et l’expression des marqueurs associés à la lignée, confirmant une différenciation réussie dans des conditions de culture définies. Grâce à cette approche, les préadipocytes embryonnaires peuvent être orientés vers les destins des adipocytes blancs ou bruns, permettant des analyses comparatives du calendrier du développement, des caractéristiques de lignée et des profils d’expression génique. Ce protocole offre un outil pratique et pertinent pour le développement afin d’étudier la formation du tissu adipeux et les mécanismes de programmation périnatale dans un cadre expérimental contrôlé.

Introduction

Le tissu adipeux joue un rôle central dans le maintien de l’homéostasie de l’ensemble du corps en régulant le stockage d’énergie, la signalisation endocrinienne et la thermogenèse adaptative, tout en interagissant de manière intensive avec les organes locaux et lointains 1,2,3. Deux grands types de tissu adipeux peuvent être distingués : le tissu adipeux blanc (WAT) et le tissu adipeux brun (BAT), qui diffèrent nettement par leur lignée cellulaire, leur fonction physiologique, leur répartition anatomique et leur activitémétabolique.

La WAT constitue le réservoir d’énergie primaire de l’organisme. Les adipocytes blancs sont très spécialisés pour le stockage lipidique et se caractérisent par la présence d’une seule grande gouttelette lipidique (LD) qui occupe la majeure partie de l’espacecytoplasmique 5. En revanche, le BAT est spécialisé dans la thermogenèse non tremblante. Les adipocytes bruns contiennent plusieurs petits LD et présentent une densité mitochondrialeélevée 3,6. La capacité thermogénique de BAT repose sur la protéine de découplage 1 (UCP1), une protéine interne de la membrane mitochondriale qui facilite la fuite de protons à travers la membrane7. En découplant la phosphorylation oxydative de la synthèse d’ATP, UCP1 dissipe le gradient de protons sous forme de chaleur, contribuant ainsi au maintien de la températurecorporelle 8. Compte tenu de leurs rôles divers, WAT et BAT ont suscité un intérêt considérable non seulement en tant que régulateurs clés et cibles thérapeutiques potentielles dans les maladies métaboliques, mais aussi en biologie développementale et évolutive, en immunologie et vieillissement, en raison de leurs interactions systémiques complexes etétendues 9,10. Les preuves accumulées indiquent également que la programmation métabolique fœtale est étroitement liée au développement du tissu adipeux, car les perturbations dans l’environnement intra-utérin peuvent influencer le nombre, la répartition et la fonction des adipocytes, prédisposant ainsi les individus à l’obésité et aux maladies métaboliques plus tard dansla vie 11.

Pour étudier la biologie du tissu adipeux, la disponibilité d’adipocytes matures est essentielle. Les systèmes de culture in vitro offrent un environnement contrôlé permettant d’évaluer des facteurs spécifiques influençant l’adipogenèse et la fonction des adipocytes. Plusieurs protocoles ont été mis en place pour l’isolement et la différenciation des adipocytes chez des souris adultes ou des petitsnouveau-nés 12, 13, 14, 15. Cependant, ces progéniteurs adipocytes peuvent différer des populations cellulaires d’origine qui donnent naissance à des tissus adipos au cours du développement. Chez la souris, les dépôts BAT sont les premiers à se développer lors de l’embryogenèse, offrant aux nouveau-nés une capacité thermogénique non tremblante, essentielle à l’adaptation au froid postnatal. Des dépôts d’adipocytes bruns peuvent être détectés dans la région interscapulaire dès le jour embryonnaire 14,5 (E14,5)16. Les LD commencent à se former à E15,5, et l’expression de l’UCP1 est initiée autour de E16,5. Chez l’embryon de souris, des préadipocytes du WAT inguinal (iWAT) sont également déjà présents à cestade 16.

Le protocole décrit ici se concentre sur les préadipocytes isolés à E15.5. Cette étape correspond à la période embryonnaire durant laquelle les cellules progénitrices initient la différenciation invivo 16, représentant ainsi les progéniteurs primaires qui donnent naissance à la WAT et à la BAT. En revanche, les progéniteurs adipogènes isolés à l’âge adulte ou néonatal peuvent déjà avoir été influencés par des facteurs environnementaux et sont susceptibles de présenter une plasticité plus limitée. Ainsi, l’utilisation de progéniteurs embryonnaires à E15.5 améliore la capacité à récapituler fidèlement le programme adipogénique in vivo , car ces cellules conservent un haut degré de plasticité développementale et sont plus enclines à suivre des trajectoires de différenciation physiologique. Cette approche suscite un intérêt particulier pour les questions de biologie du développement, notamment pour l’étude des effets des facteurs environnementaux sur la différenciation des préadipocytes pendant la période périnatale, fournissant un modèle précieux pour étudier comment les expositions précoces peuvent influencer le développement du tissu adipeux et les résultats métaboliques à long terme. Cependant, les utilisateurs doivent être prudents quant à cette spécificité de stade : la méthode est optimisée pour les embryons E15.5, et des écarts d’âge embryonnaire ou de précision de dissection peuvent impacter le rendement ou la viabilité cellulaire. De plus, la technique de microdissection nécessite de la pratique pour éviter la contamination par des tissus non adipos, notamment compte tenu de la petite taille des dépôts embryonnaires. Ce protocole résume toutes les étapes et procédures pour isoler, cultiver, amplifier et différencier les préadipocytes embryonnaires en adipocytes bruns et blancs matures.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été réalisées conformément aux réglementations locales et selon les directives définies par la directive du Conseil de l’Union européenne du 22 septembre 2010 (2010/63/EU) (APAFIS #2617-2015110517317420).

Tous les déchets biologiques et solutions enzymatiques doivent être manipulés et éliminés conformément aux directives et réglementations institutionnelles en matière de biosécurité pour les matières bio-dangereuses. Plus précisément :
- Déchets biologiques : collecter dans des contenants homologués pour bio-risques et les éliminer par autoclavage ou selon les directives du bureau de biosécurité de l’institution.
- Solutions enzymatiques : inactivent l’activité enzymatique résiduelle en ajoutant 10 % d’eau de Javel pendant 30 minutes et éliminent comme déchets chimiques selon la réglementation locale.
- Consommables contaminés (pointes de pipette, tubes, etc.) : à placer dans des sacs de biohazard et un autoclave avant leur élimination.
- Réactifs de fixation : éliminer comme déchets chimiques dangereux dans des contenants désignés.

Portez toujours des équipements de protection individuels appropriés lors de la manipulation des déchets.

1. Prélèvement d’embryons de souris

  1. Euthanasiez les souris enceintes (C57Bl/6J) conformément aux directives du Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnelles des Animaux.
  2. Désinfectez la zone abdominale des souris enceintes avec 70 % d’éthanol et réalisez une incision médiane pour exposer l’utérus.
  3. Incisez la cavité abdominale pour retirer les sacs vitellins contenant les embryons à E15.5 et placez-les dans une boîte d’agarose contenant du froid (4 °C) 1x PBS.
  4. Retirez la membrane externe de chaque sac vitellin et du placenta, puis coupez le cordon ombilical des embryons.
  5. Placez les embryons dans une nouvelle boîte d’agarose contenant du PBS froid 1x.
    REMARQUE : Bien que les structures du système nerveux central sous-jacentes à la perception consciente de la douleur ne soient pas pleinement développées à ce stade gestationnel, des nocicepteurs périphériques commencent à se former entre E13 et E15. Conformément aux directives institutionnelles de soins aux animaux, afin de minimiser les réactions nociceptives potentielles, nous recommandons cependant que les embryons soient euthanasiés par décapitation avant toute manipulation expérimentale.

2. Dissection des tissus adipos embryonnaires (Figure 1)

  1. Dissection du BAT interscapulaire (Figure 1A)
    1. Découpez un rectangle dans une plaque d’agarose à 5 % et placez l’embryon à l’intérieur pour l’immobiliser. Remplissez l’assiette avec du PBS froid 1x. Placez la boîte d’agarose avec l’embryon sous un microscope binoculaire.
    2. Retirez la peau à l’arrière de l’embryon.
    3. Disséquez la BAT interscapulaire à l’aide de pinces fines et de microciseaux.
    4. Séparez soigneusement le BAT du tissu environnant (tissu conjonctif et muscle) à l’aide de microciseaux pour obtenir un échantillon de BAT mesurant environ 4–6 mm x 2–3 mm.
    5. Placez le BAT dans un tube de 2 mL contenant 1 mL de glutamine F-12 (DMEM/F-12) à 100 U/mL de pénicilline/streptomycine (P/S) à froid (4 °C).
  2. Dissection de l’iWAT (Figure 1B)
    1. Placez l’embryon sur le côté (d’un côté puis de l’autre) sur la plaque d’agarose.
    2. Disséque l’iWAT à l’aide de pinces fines et de microciseaux.
    3. Séparez soigneusement l’iWAT des tissus environnants (tissu conjonctif et peau) jusqu’à obtenir deux dépôts mesurant environ 2–4 mm x 0,5–0,8 mm.
    4. Placez les deux échantillons de WAT dans un tube de 2 mL contenant 1 mL de glutamine DMEM/F-12 froide avec 100 U/mL de pénicilline/streptomycine (P/S).
      REMARQUE : Toutes les dissections doivent être réalisées sous un microscope binoculaire dans l’environnement le plus stérile possible, à l’aide d’outils préalablement désinfectés.

3. Digestion des tissus adipeux

  1. Retirez le DMEM/F12 avec une pipette et ajoutez dans les tubes 200 μL de glutamine DMEM/F12 avec 100 U/mL p/s, 0,2 % d’albumine sérique bovine (BSA), 0,5 U collagénase D et 0,5 U Dispase II.
  2. Coupez les tissus avec des microciseaux dans les tubes pour réduire autant que possible les morceaux de tissu et aider la digestion en pipettant 10 fois.
    REMARQUE : Les échantillons entièrement digérés doivent apparaître comme une suspension trouble sans amas de tissu visibles.
  3. Incubez à 37 °C (dans un bain-marie) pendant 15 minutes.
  4. Arrêtez la réaction en ajoutant 600 μL de glutamine DMEM/F-12 froid avec 100 U/mL de p/s, 20 % de sérum bovin fœtal (FBS). Resuspendez uniformément en pipettant 10 fois.

4. Culture cellulaire primaire

REMARQUE : À partir de cette étape, toutes les procédures doivent être effectuées dans des conditions strictement stériles dans un Cabinet de Sécurité Biologique (BSC) afin d’éviter toute contamination. Portez des gants stériles, une blouse de laboratoire et des lunettes de sécurité pour maintenir la stérilité et vous protéger contre les risques potentiels. Utilisez des plastiques jetables stériles, une technique aseptique, et assurez-vous que tous les réactifs et milieux sont stériles. Évitez le contact avec les surfaces non stériles pour éviter toute contamination.

  1. Placez les cellules sur des lames de puits et incubez-les dans des conditions standard (37 °C, 5 % CO2) pendant 1 h ; pour les plaques à 8 puits, mettez 200 μL/puits. Après l’incubation, vérifiez que les cellules ont adhéré en déplaçant doucement la plaque tout en observant au microscope.
    REMARQUE : À ce stade, différents échantillons de BAT ou WAT peuvent être regroupés dans un seul tube pour obtenir des cultures homogénéisées dans les différents puits (par exemple, pour tester l’effet d’un traitement sur des cultures similaires).
  2. Remplacer le milieu par de la glutamine dmem/f-12 préchauffée (37 °C) AVEC 100 U/mL de p/s, 10 % de FBS et incuber les cellules toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO2.
    REMARQUE : En changeant le milieu, les cellules mortes/non attachées et les fragments de tissu qui ne pouvaient pas être décomposés sont retirés, ne laissant que les cellules attachées.
  3. Traitement de différenciation (72 h)
    1. Pour la différenciation des adipocytes bruns, changez le milieu en utilisant de la glutamine préchauffée (37 °C) dmem/f-12 avec 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 125 nM d’indométhhacine, 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 1 nM triiodothyronine (T3), 1 μM de rosiglitazone, 1 μM de dexaméthasone et 850 nM d’insuline, puis incubez à 37 °C, 5 % deCO-2 pendant 72 heures.
    2. Pour la différenciation des adipocytes blancs, changez le milieu en utilisant de la glutamine DMEM/F-12 préchauffée avec 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 0,5 mM d’IBMX, 1 μM de dexaméthasone et 850 nM d’insuline, puis incubez à 37 °C, 5 % deCO-2 pendant 72 heures.
  4. Traitement d’entretien (toutes les 48 heures)
    1. Changez le milieu avec de la glutamine préchauffée (37 °C) DMEM/F-12 avec 100 U/mL p/s, 10 % FBS, 1 nM T3, 1 μM Rosiglitazone et 850 nM d’insuline. Renouvelez le substrat toutes les 48 heures.
      REMARQUE : Toutes les concentrations listées se réfèrent aux concentrations finales de travail des réactifs. Ajustez les volumes finaux de milieux de différenciation et d’entretien en fonction du nombre de puits à traiter, en utilisant 200 μL par puits comme volume standard pour les plaques à 8 puits.

5. Fixation et immunocoloration (Figure 2A)

  1. Aspirez le milieu et lavez les cellules avec du PBS froid 1x.
  2. Fixez les cellules 10 minutes avec du formaldéhyde froid à 4 % dans un PBS 1x.
  3. Lavez les cellules avec 1x PBS pendant 3 x 5 minutes.
  4. Perméabiliser les cellules avec 0,1 % de Triton dans 1x PBS pendant 10 minutes.
  5. Lavez les cellules avec 1x PBS pendant 3 x 5 minutes.
  6. Bloquez les sites non spécifiques avec 5 % de sérum d’âne normal (NDS) dans 1x PBS pendant 1 heure à température ambiante (RT).
    REMARQUE : Le choix des espèces pour le sérum bloqueant dépend de l’espèce chez laquelle les anticorps secondaires sont produits.
  7. Incuber des anticorps primaires dilués dans 5 % de NDS dans 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.
    REMARQUE : N’ajoutez pas d’anticorps primaires à l’un des puits — cela servira de témoin négatif.
  8. Lavez les cellules avec 1x PBS pendant 2 x 5 minutes.
  9. Lavez les cellules avec 5 % de NDS dans 1x PBS pendant 5 minutes.
  10. Incubez avec les anticorps secondaires, DAPI et Bodipy pendant 1 heure à la RT, protégés de la lumière.
  11. Lavez les puits avec 1 PBS pendant 3 x 5 minutes.
  12. Gardez les cellules à 4 °C dans le noir jusqu’à l’acquisition des images.

6. Cryoconservation des préadipocytes

REMARQUE : Il est possible d’arrêter la culture et de congeler les cellules avant ou après le processus de différenciation afin de les stocker et de les réutiliser pour des cultures cellulaires ultérieures.

  1. Préparez un milieu de congélation : 50 % FBS, 40 % DMEM/F-12 glutamine avec 100 U/mL p/s, 10 % de diméthéthyle sulfoxyde (DMSO).
    ATTENTION : Le DMSO est un produit chimique dangereux. C’est un irritant pour la peau et les yeux, il peut faciliter l’absorption d’autres substances toxiques par la peau, et peut causer des dommages s’il est inhalé ou ingéré. Manipulez toujours le DMSO à l’intérieur du BSC pour minimiser l’exposition et la contamination. Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié (gants stériles, blouse de laboratoire et lunettes de sécurité pour éviter tout contact). Évitez le contact cutané. En cas de contact, lavez-vous immédiatement avec beaucoup d’eau. Stockez le DMSO dans un contenant hermétiquement fermé à l’intérieur du BSC lorsqu’il n’est pas utilisé, et assurez-vous qu’il est correctement éliminé conformément aux protocoles de sécurité du laboratoire.
  2. Lavez les cellules avec du PBS préchauffé (37 °C) 1x.
  3. Ajoutez de la trypsine préchauffée (37 °C) à 0,05 % pour détacher chimiquement les cellules et incuber 5 minutes à 37 °C, 5 % de CO2. Vérifiez visuellement s’il y a un décollement cellulaire au microscope.
  4. Arrêtez la réaction en ajoutant 3 fois le volume de glutamine préchauffée (37 °C) DE DMEM/F-12 avec 100 U/mL p/s, 10 % FBS. Resuspendez uniformément.
  5. Centrifugeuse 7 min à RT, 300 × g et jetez le surnageant.
  6. Resuspendez les cellules dans 10 mL de milieu de congélation. Centrifugeuse 7 minutes à RT, 300 × g et jetez le surnageant, ne laissant qu’environ 3 mL.
    REMARQUE : Mesurez le volume exact pour calculer le nombre total de cellules après le comptage.
  7. Diluez un petit volume 1:2 avec du bleu de Trypan et comptez les cellules vivantes à l’aide d’une chambre de Neubauer.
  8. Ajustez le volume avec un milieu congelant pour obtenir 5 × 104 – 1 × 105 cellules/flacon (volume final : 1 mL/flacon).
  9. Transférez les flacons dans un récipient congelant (taux de refroidissement : -1 °C/min) et conservez à -80 °C toute la nuit.
  10. Transférer dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
    REMARQUE : Ce protocole permet une viabilité supérieure à 90 % après décongélation.
  11. Décongelez les cellules lorsque nécessaire en décongelant rapidement la fiole dans un bain-marie à 37 °C.
  12. Transférez le contenu du flacon à 4 mL de glutamine préchauffée (37 °C) DMEM/F-12 avec 100 U/mL p/s, 10 % FBS. Resuspendez uniformément en pipettant doucement de haut en bas 10 fois. Incubez toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO2.
  13. Remplacez le milieu par de la glutamine fraîche DMEM/F-12 par 100 U/mL P/S, 10 % de FBS et renouvelez toutes les 48 heures.
    REMARQUE : Il est crucial de procéder à ce changement de milieu pour éliminer les restes de DMSO, car une exposition prolongée peut compromettre la viabilité, la différenciation et la fonction cellulaire. Assurez-vous d’assurer un remplacement complet du milieu afin d’éviter les effets cytotoxiques.
  14. Poursuivez les expériences ou les cellules de passage lorsqu’elles atteignent 80 % de confluence.

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Résultats

Comme illustré à la Figure 1, les dépôts intacts de BAT et d’iWAT peuvent être isolés efficacement à partir d’embryons à E15.5. Bien que le BAT soit facilement détectable chez les embryons E15.5, la détection de l’iWAT peut nécessiter un entraînement. Dans les deux cas, il est essentiel de microdisséquer tous les tissus environnants après une dissection grossière afin d’éviter de cultiver d’autres types cellulaires.

Les premiers s...

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Discussion

La culture des préadipocytes a été largement décrite dans divers contextes expérimentaux. Cependant, les protocoles existants reposent principalement sur des tissus adultes ou des fibroblastes embryonnaires, et aucune méthode standardisée n’est actuellement disponible pour isoler et cultiver directement les préadipocytes embryonnaires à partir des tissus adipos en développement. L’étude de ces cellules est particulièrement importante, car elles représentent les populations authentiques d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Nous remercions Christian Duhem pour ses conseils. Nous reconnons le soutien de l’Institut national français de la santé et de la recherche médicale (INSERM). Le M.C-M était soutenu par l’ANR-23-CE13-0044. Le M.A a été soutenu par l’Institut Européen de Génomique pour le Diabète (EGID, ANR-10-LABX-0046), le Centre National de Médecine de Précision du Diabète (PreciDIAB, ANR-18-IBHU-0001) et le Conseil régional des Hauts-de-France (22005973). La figure 2 a été créée dans BioRender. Mayeuf-Louchart, A. (2026) https://BioRender.com/3pbzif1. SB a été soutenu par la subvention ANR-24-CHBS-0002.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3,5,3'-triiodothyronineSigma709719T3
3-isobutyl-1-méthylxanthine   ;SigmaI7018IBMX
AgaroseSigmaA0169
AlcoolVWR1.59010.0500
Anticorps anti-UCP1AbcamAB10983
Microscope binoculaireLeica  ; MZ9.5
Armoire de sécurité biologiqueThermo Scientific51022482BSC, HeraSafe KS Classe II Armoire de sécurité
BodipyInvitrogenD3922Excitation/Émission 493/504 nm
Albumine sérique bovineEuromedex04-100-812-CBSA
CentrifugeuseEppendorf5430 R
PincesFST (Allemagne en inox)
Colagnase DSigma11088882001
CryotubesSarstedt72.379
Plaques de culture (8 puits)Ibidi  ;80826
Plaques de culture (12 puits)Corning CastarCLS3513Plaque en polystyrène, fond plat, stérile
DexaméthasoneSigmaD2915
Dispase IISigma4942078001
DMEM/F12Gibco31331Ajout de glutamine
DMSOSigmaD2438
Anticorps anti-lapin de l’âneInvitrogenA32795Alexa Fluo Plus 647
Eppendorfs 1,5 mLEppendorf15625367
FBSGibcoA5256701
Formaldéhyde 37 %Thermo Scientific119690010
Récipient congelantThermo Scientific  ; 5100-0001
Hoechst  ;InvitrogenH3570
IncubateurThermo Scientific50116048Incubateur de CO2 Heracell 150i
IndométhhacineSigmaI7378
InsulineSigmaI9278
  ; microscope inversé équipé d’un 10 et times ; Objectif et illumination halogèneCarl Zeiss Axio Vert.A1
Souris C57BL/6JRivière Charles
MicrociseauxFST (Allemagne en inox)
NDSSigmaD9663
Chambre de NeubauerThermo Scientific10195580
PBS 10xGibco14200
PBS 1xGibco14190
Péniciline/StreptomicineGibco15140-122
Plaques de PetriSarstedt83.3902
Plaques qPCRThermo ScientificAB-0600
Sonde qPCR pour Fabp4Thermo Scientific4331182TaqMan essaie, Mm00445878_m1
Sonde qPCR pour PpargThermo Scientific4331182TaqMan essaie, Mm00440940_m1
Sonde qPCR pour Ucp-1Thermo Scientific4331182TaqMan essaie, Mm01244861_m1
Kit de transcription inversée & nbsp ;Thermo Scientific4368813Kit d’ADNc haute capacité
Kit d’extraction d’ARNOmega Bio-TekR6934-02E.Z.N.A. Kit total d’ARN II
RosiglitazoneSigmaR2408
Triton X-100Thermo ScientificA16046
Bleu de TrypanSigmaT8154
Trypsine-EDTAGibco25300054
Bain marieGrantSAP12  ;Capacité de 12 L

Références

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