Évaluation colorimétrique de l’activité de la déodinase 1 chez les microsomes hépatiques humains à l’aide de la réaction de Sandell-Kolthoff

Résumé

Ce protocole décrit une méthode colorimétrique permettant d’évaluer de manière fiable l’influence des substances chimiques sur l’activité de la déiodinase 1 (DIO1) dans les microsomes hépatiques humains en utilisant la réaction de Sandell-Kolthoff. Elle inclut des critères d’acceptation prédéfinis et des indicateurs statistiques de performance, et soutient les efforts continus en vue de l’inclusion des lignes directrices de l’OCDE.

Résumé

Cette méthode permet d’identifier les substances testées qui inhibent l’activité de la DIO1 et peuvent ainsi interférer avec l’homéostasie de l’hormone thyroïdienne. Le protocole présenté décrit une méthode colorimétrique non radioactive pour évaluer les effets des substances testées sur l’activité enzymatique de la Déiodinase 1 (DIO1) dans les microsomes hépatiques humains. Le test est basé sur la réaction de Sandell-Kolthoff (SK), qui quantifie l’iodure libéré lors de la déiodination de la triiodothyronine inverse (rT3) en diiodothyronine (T2). Le cérium jaune (IV) est réduit en cérium incolore (III) en présence d’iodure, permettant une détection photométrique à 415 nm. Dans cette configuration standardisée, la concentration de cérium (IV) est réglée à 40 mM afin d’améliorer la stabilité et la robustesse du signal dans les conditions décrites. Pour garantir la fiabilité et la reproductibilité des essais, un système de contrôle complet est inclus : 6-propyl-2-thiouracil (article de référence), aurothioglucose (contrôle positif), 1-thio-β-D-glucose sel sodique (témoin négatif) et 1 % de diméthyle sulfoxyde (contrôle par solvant). Le protocole comprend un test de mesure de distance pour déterminer les concentrations de test appropriées, la standardisation de l’activité de libération d’iodure spécifique par lot microsome, ainsi qu’un test structuré d’interférence chimique en l’absence de microsomes, avec une évaluation de suivi optionnelle sans dithiothréitol (DTT) pour identifier les artefacts dépendants de la DTT. Le test DIO1-SK convient aux études de dépistage à débit moyen à élevé et aux études de toxicologie mécanistique. Sa robustesse, sa scalabilité et son applicabilité aux microsomes humains en font un outil précieux pour étudier les perturbations endocriniennes. Ce protocole soutient les efforts de validation réglementaire.

Introduction

Les perturbateurs endocriniens (DE) sont des substances chimiques qui interfèrent avec la régulation hormonale et provoquent par conséquent des effets indésirables chez^{l’humain 1,2}. Les déodidinases (DIO) sont des enzymes associées à la membrane, la sélénocystéine étant un résidu clé dans leurs sites actifs. Cette famille d’enzymes comprend trois isoformes distinctes (DIO1, DIO2 et DIO3), qui modulent collectivement les concentrations d’hormones thyroïdiennes circulantes (TH) et régissent leur disponibilité tissulaire spécifique au sein des cellules³. La thyroxine (T4), qui agit comme prohormone, et la triiodothyronine (T3), forme active, jouent des rôles essentiels dans la régulation de la dépense énergétique, de la croissance, des processus de développement et de la thermorégulation dans^{l’organisme 4}. Les isoformes DIO diffèrent par les caractéristiques de leur spécificité du site de désiodation, leurs propriétés cinétiques et leurs préférences de substrat³. DIO1 est la principale isoforme de la déiodinase dans le foie adulte et présente une forte affinité substrat pour la triiodothyronine inverse (rT3) et les iodothyronines sulfatées, tandis que DIO2 utilise préférentiellement T4 et rT3, et DIO3 agit principalement sur T4 et T3. L’utilisation de microsomes hépatiques humains et de rT3 comme substrat permet une détection sélective de l’activité de DIO1, minimisant ainsi les interférences d’autres isoformes. Bien que les conséquences précises de l’inhibition de la DIO1 induite par une substance restent à être pleinement élucidées, les preuves issues de mutations génétiques humaines affectant la DIO1 démontrent clairement que la DIO1 peut perturber le système hormonal^{thyroïdien 5}. En conséquence, il est crucial de disposer de méthodes robustes et reproductibles pour étudier l’inhibition de DIO1.

L’objectif de la méthode présentée est de quantifier l’activité de DIO1 in vitro en utilisant une approche colorimétrique non radioactive basée sur la réaction de Sandell-Kolthoff (SK). DIO1 catalyse la conversion de rT3 inverse en T2, un processus qui entraîne la libération d’ions iodure. La réaction SK permet une détection sensible de l’iodure libéré, permettant de déterminer l’activité de libération d’iodure (IRA) comme mesure directe de l’activité du DIO1. Cet essai permet de détecter les effets inhibiteurs des substances testées sur DIO1, soutenant la toxicologie mécanistique, le dépistage ou la prise de décision réglementaire. Il est particulièrement pertinent pour étudier l’inhibition de la DIO1 comme événement moléculaire déclencheur des voies de conséquences indésirables conduisant à une perturbation thyroïdienne, comme le soulignent les efforts internationaux de validation tels que ceux coordonnés par EURL ^{ECVAM 6,7}. La méthode a été initialement développée en^{2012 8,9} et optimisée^{davantage en 6,7} en réponse au besoin croissant de tests in vitro robustes, reproductibles et évolutifs, pouvant être intégrés dans des batteries de test pour le dépistage endocrinien, notamment dans le contexte du métabolisme des hormones thyroïdiennes. Récemment, l’application de configurations analogiques SK pour le filtrage ¹⁰ moyen à haut débit¹¹ a été publiée, démontrant la large applicabilité de l’approche SK.

Même si l’essai DIO1-SK mesure indirectement l’activité de DIO1 en quantifiant les produits IRA plutôt que TH, il offre plusieurs avantages par rapport à d’autres techniques. Contrairement aux méthodes qui reposent sur des substrats^{radiomarqués 12} ou la quantification par spectrométrie de masse des hormones thyroïdiennes appauvries^{ou formées 13}, la réaction SK fournit une lecture simple, évolutive et rentable en mesurant la libération d’iodure à 415^{nm 14}. Bien que les méthodes LC-MS/MS avec extraction en phase solide (SPE-LC-MS/MS) offrent une grande spécificité et sensibilité pour quantifier rT3 et T2, elles nécessitent une instrumentation coûteuse et sont moins adaptées à un criblage à haut débit. En revanche, le test DIO1-SK peut être mis en œuvre en laboratoire standard et a été prévalidé pour une utilisation avec des microsomes hépatiques humains, démontrant une grande reproductibilité et prédictivité ^6,7. Dans une étude comparative, les résultats de la réaction SK, en particulier la libération d’iodure, ont été directement comparés à la quantification des métabolites de l’hormone thyroïdienne (rT3 et T2) à l’aide de SPE-LC-MS/^{MS 15}. Les résultats ont révélé une forte concordance entre les deux approches à travers une gamme de substances testées et de puissances d’inhibition. Pour toutes les substances testées, les variations de l’activité de libération d’iodure (IRA) mesurées par la réaction SK reflétaient de près les modifications des niveaux de rT3 et T2 déterminées par spectrométrie de masse. Cela a renforcé la validité de l’affichage SK comme substitut de l’activité DIO1. Ces analyses comparatives confirment que le test SK offre une alternative robuste et fiable aux techniques analytiques plus complexes, et que la libération d’iodure peut être mesurée avec confiance pour évaluer l’inhibition de DIO1 in vitro.

Cependant, la méthode SK présente certaines limites à prendre en compte : elle est susceptible aux interférences de substances contenant soit de l’iodure libre en impuretés, soit libérant de l’iodure de manière non enzymatique, soit réagissant avec des composants du test tels que le dithiothréitol (DTT). La DTT est incluse comme cofacteur réducteur pour maintenir la compétence catalytique de la déiodinase en soutenant la régénération de la sélénocystéine en site actif dans son état réduit lors du renouvellement. Parce que la DTT est un réducteur puissant, certaines substances d’essai (ou impuretés) peuvent subir des réactions redox qui peuvent influencer la lecture colorimétrique et, dans certains cas, entraîner des artefacts de test dépendants de la DTT sans lien avec la libération enzymatique d’iodure. De telles interférences peuvent entraîner des résultats faux négatifs pour l’inhibition de DIO1, car l’iodure mesuré peut ne pas provenir de la conversion enzymatique de rT3. Ainsi, bien que le test SK soit adapté au dépistage de routine et à la plupart des substances testées, le LC-MS/MS pourrait être utilisé pour la confirmation chaque fois qu’une interférence d’essai est suspectée ou pour des substances aux propriétés chimiques complexes.

Le test DIO1-SK est actuellement en préparation pour être inclus comme guide de test de l’OCDE dans un projet international PEPPER (plateforme public-privée pour la validation des méthodes de caractérisation des perturbateurs endocriniens), qui souligne son importance croissante pour les applications réglementaires et l’harmonisation internationale des stratégies de test des perturbateurs endocriniens. Le test peut être intégré dans des batteries d’essais in vitro complètes, soutenant à la fois l’évaluation de la sécurité chimique et les investigations mécanistiques sur les perturbations^{endocriniennes 16}. Combinés à des tests traitant d’événements clés supplémentaires le long de la voie des effets indésirables thyroïdiens, ils contribuent à une compréhension plus complète des mécanismes de perturbation des hormones thyroïdiennes.

De plus, la scalabilité et la grande reproductibilité du protocole le rendent parfaitement adapté au criblage à débit moyen à élevé. C’est essentiel pour évaluer un grand nombre de substances lors du développement de médicaments et dans le milieu académique, comme récemment^{démontré 11}. Les chercheurs intéressés par l’inhibition de DIO1, que ce soit pour le dépistage, la toxicologie mécanistique ou la prise de décision réglementaire, bénéficieront d’un test robuste, accessible et polyvalent. La validation de cette méthode en fera un outil standard pour la recherche sur la perturbation du système hormonal thyroïdien et pour l’évaluation de la sécurité chimique.

Protocole

REMARQUE : Avant d’effectuer l’essai principal, une série d’étapes préparatoires est essentielle pour garantir la précision, la reproductibilité et la validité du test DIO1-SK. Ces activités de pré-essai incluent la fonte de plaques filtrantes remplies de résine à échange d’ions, essentielles pour une séparation efficace et la minimisation des interférences de fond dans la réaction SK. La réaction de Sandell-Kolthoff est régulièrement standardisée en utilisant des courbes étalons à iodure pour surveiller les changements systématiques et maintenir la qualité des tests. L’activité des microsomes hépatiques humains est mesurée pour déterminer la capacité de libération d’iodure spécifique par lot, assurant ainsi une performance enzymatique cohérente à travers les expériences. Ensemble, ces étapes fournissent une base solide pour le travail principal d’analyse et l’évaluation des données ultérieurs, soutenant la génération de résultats reproductibles et interprétables.

1. Travail de pré-assay

1. Préparation des tampons et des réactifs
   1. Préparez tous les tampons et solutions en stock à l’avance comme décrit dans le Tableau 1. Stockez les aliquotes comme indiqué pour garantir la stabilité et la reproductibilité.
   2. Le jour de l’analyse, préparez le substrat fraîchement pour chaque assiette de 96 puits. Pour une plaque à 96 puits, combinez 5,75 mL de tampon HEPES/EDTA (50 mM HEPES, 2,16 mM EDTA, pH 7,0), 0,5 mL de 1 M DTT décongelé, et 10 μL de 6 mM rT3 (dissous dans le DMSO). Mélangez doucement et gardez le substrat sur de la glace jusqu’à utilisation.
2. Préparation de la référence
   1. Préparez une solution de ^10-1 M de 6-PTU de référence dans un solvant approprié (par exemple, DMSO) fraîchement le jour de la réalisation de l’essai.
   2. Préparez une dilution 1:10 de ce stock en_{diH 2}O (RI-C8) pour atteindre une concentration de DMSO de 10 % et préparez une série de dilutions à partir de ce stock en 10 % de DMSO en_{diH 2}O comme décrit dans le tableau 2.
3. Préparation du contrôle positif
   1. Préparez une solution de ^10-2 M de l’aurothioglucose témoin positif dans un solvant approprié (par exemple, DMSO) et conservez-la jusqu’à 6 mois à 4 °C.
   2. Le jour de l’analyse, diluez le stock à ^10-3 M dans_{diH 2}O pour atteindre une concentration de DMSO de 10 % de DMSO.
4. Préparation du témoin négatif
   1. Préparez une solution de 10 ^{à 2} M de sel sodique témoins négatif 1-Thio-β-D-glucose fraîchement le jour de la réalisation du test.
   2. Le jour de l’analyse, diluez le stock à ^10-3 M dans_{diH 2}O pour atteindre une concentration de DMSO de 10 % de DMSO.
      REMARQUE : Prenez toujours les précautions de sécurité appropriées, notamment lors de la manipulation de produits chimiques dangereux tels que l’arsénite de sodium et l’acide sulfurique. Tous les réactifs doivent être préparés avec de l’eau déionisée et stockés selon les recommandations du fabricant. Le mélange de substrat, une fois préparé, et l’aliquote DTT décongelée sont destinés à un usage unique le jour du test et ne doivent pas être recongelés.
5. Moulage de la résine d’échange ionique
   1. Utilisez un récipient rectangulaire transparent approprié pour la préparation.
   2. Ajoutez environ 250 g (ou la quantité désirée) de résine échangeuse d’ions dans un grand récipient et lavez. Laver en ajoutant 10 % d’acide acétique ; Laissez reposer la suspension en résine pendant 10 minutes.
   3. Après avoir laissé la suspension se stabiliser pendant 10 minutes, inclinez-la légèrement et aspirez le surnageant. Lavez-le au moins 5 fois au total ou jusqu’à ce qu’aucune couleur ne s’infiltre dans le solvant.
   4. Après la dernière étape de lavage, ajoutez 10 % d’acide acétique afin qu’il représente environ 50 % du volume total.
   5. Inclinez le récipient de façon à ce que la résine se déplace d’un côté et stabilisez le récipient en position inclinée. Attends ~10 minutes que les phases se séparent.
   6. Placez une plaque filtrante à 96 puits au-dessus d’une plaque à 96 puits de profondeur et ajoutez 100 μL d’acide acétique à 10 % dans chaque puits de la plaque filtrante à 96 puits.
   7. Coupez les pointes utilisées pour la fonte de résine à une hauteur de ~1 cm pour élargir l’ouverture à l’extrémité et coulez 300 μL de résine échangeuse d’ions dans chaque puits de la plaque filtrante à 96 puits.
      REMARQUE : Les embouts utilisés dans notre travail ont un volume maximal de 1 200 μL et peuvent être fixés à des pipettes multicanales.
   8. Éluer l’acide acétique en centrifugant dans une plaque de puits de 96 profondeurs avec 100 à 200 × g dans une centrifugeuse avec un rotor basculant pour les plaques micro-titrées pendant 1 minute. Vérifiez si la résine est répartie uniformément sur la plaque.
   9. Scellez la plaque avec une feuille de plastique imperméable et conservez à 4 °C pendant un maximum de 6 mois.
      REMARQUE : Les constituants de la résine échangeuse d’ions sont connus pour affecter la réaction SK s’ils ne sont pas correctement éliminés. Le surnageant retiré peut être utilisé directement dans la réaction SK (utiliser 50 μL d’échantillon surnageant, ajouter 50 μL de cérium, et enfin 50 μL de solution d’arsénite) et peut être comparé à un échantillon d’acide acétique à 10 % (contrôle à blanc) afin d’assurer un lavage complet des composants.
6. Standardisation de la réaction de Sandell-Kolthoff
   1. Préparez des dilutions d’iodure à partir d’une source d’iodure respective (par exemple, solution standard d’iodure) avec des concentrations recommandées de 1 500, 1 000, 750, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 10, 5 et 1 nM en utilisant un étalon d’iodure correspondant en_{diH 2}O.
   2. Ajoutez 50 μL de_{diH 2}O pur en contrôle et 50 μL des dilutions d’iodure préparées sur une plaque de 96 puits en triple comme décrit dans la disposition de la Figure 1.
   3. Ajoutez 50 μL de solution de cérium de 40 mM à tous les puits et commencez la réaction en ajoutant 50 μL de solution d’arsenite de 25 mM à tous les puits.
   4. Dès que possible après l’ajout de la solution d’arsénite, mesurez l’absorption à l’aide d’un lecteur de plaques à 415 nm (±2 nm) en enregistrant la densité optique (OD) chaque minute pendant 21 minutes, ainsi que l’OD initial.
   5. Évaluer les résultats tels que décrits à la section 4.
      REMARQUE : Habituellement, un fond de ΔOD_21min > 0,3 dans le contrôle_{diH 2}O pur nécessitera une attention et une investigation approfondie des causes sous-jacentes (par exemple, contamination dans le lot As ou Ce, faible qualité de l’eau).
7. Évaluation de l’activité des microsomes
   1. Préparez la concentration la plus élevée (RI-C8) de l’élément de référence (6-PTU) comme décrit à l’étape 1.2.
   2. Préparez les six dilutions de microsomes décrites dans le tableau 3 et le mélange de substrat tel que décrit dans le tableau 1.
   3. Ajoutez 10 μL d’une dilution de solvant à 10 % (v/v) en_{diH 2}O (par exemple, 10 % de DMSO en_diH2O) et 10 μL de ^10-2 M 6-PTU (RI-C8) dans une plaque à 96 puits en triple exemplaire, comme décrit dans la disposition des plaques à la Figure 2.
   4. Ajoutez 40 μL de dilutions microsomiques en_{diH 2}O (ce qui donne 20, 10, 5, 2,5, 1,25, 0,68 et 0 μg de protéine microsomale par puits) à la plaque à 96 puits comme illustré dans la disposition de la plaque.
      REMARQUE : Les fournisseurs fournissent généralement la concentration de protéine microsomale. Sinon, des méthodes standard de quantification des protéines peuvent être utilisées, bien que nous ne les ayons pas appliquées dans cette étude.
   5. Ajoutez 50 μL de substrat fraîchement préparé à chaque puits et scellez la plaque avec une feuille de plastique imperméable.
   6. Placez la plaque à 96 puits sur un shaker dans un incubateur (37 °C à 850 tr/min) et écouvez pendant 2 heures.
   7. Après le temps d’incubation, mettez la plaque sur la glace pour arrêter la réaction.
   8. Effectuez l’échange ionique de manière analogue à l’étape 2.2.
   9. Transférer des quantités appropriées d’échantillon du puits profond obtenus lors de l’étape d’échange ionique vers une nouvelle plaque de 96 puits pour mesurer les dilutions non diluées (50 μL d’échantillon), 1:2 (25 μL d’échantillon + 25 μL d’acide acétique à 10 %) et 1:4 (12,5 μL d’échantillon + 37,5 μL d’acide acétique à 10 %).
   10. Évaluer les résultats décrits à la section 4 et déterminer le facteur de dilution pour les échantillons à 10 % d’acide acétique ainsi que la concentration de protéine microsomale qui conduit encore aux valeurs ΔOD_21min -BG les plus élevées possibles dans la réaction de Sandell-Kolthoff sans atteindre le plateau de saturation.
       REMARQUE : Habituellement, une libération d’iodure de_{ΔOD 21min} > 0,5 est facilement réalisable dans les dilutions 1:4 ou 1:2 d’acide acétique des 20 μg de protéine microsomale par échantillon de puits, et cela varie généralement autour d’un_{ΔOD 21min} de 1. Des concentrations plus élevées de protéines microsomales ne sont pas recommandées, car elles augmentent la liaison de fond et non spécifique lors de l’analyse. Il est recommandé de répéter la mesure d’une série de dilution de 6 PTU en utilisant la concentration de microsome déterminée et le facteur de dilution pour confirmer le résultat.
8. Évaluation de la solubilité des items testés
   1. Dissoudre l’élément testé à 100 mM ou 200 mg/mL dans un solvant approprié (par exemple, DMSO) à température ambiante. Mélangez ou faites un vortex et vérifiez visuellement la dissolution (microscope).
   2. Si ce n’est pas dissous, sonicez jusqu’à 5 minutes puis vérifiez à nouveau. Si elle n’est pas encore dissoute, chauffez à 37 °C jusqu’à 60 minutes puis vérifiez.
   3. Si elle est insoluble, diluez davantage ou préparez un nouveau fond à une concentration plus faible et répétez la procédure. Si le DMSO n’est pas adapté, essayez l’eau ou l’éthanol comme solvants alternatifs.
   4. Une fois dissous, préparez une dilution 1:10 en_{diH 2}O (solvant à 10 %) et répétez l’évaluation (mélange, sonication, chauffage selon les besoins).
   5. Pour simuler les conditions de l’essai, préparez une dilution d’un test de 1 % dans le tampon de test et répétez le test de solubilité.
9. Préparation des items de test et mesure de distance
   1. Préparez la solution de stock test à la concentration soluble la plus élevée dans un solvant approprié (de préférence DMSO), comme déterminé lors de l’évaluation de la solubilité à l’étape 1.8.
   2. Pour le test de mesure de distance, préparez huit dilutions d’éléments de test par étapes consécutives de dilution 1:10 (v/v) en utilisant la solution d’origine et 10 % de DMSO en_{diH 2}O.
   3. Effectuez le test de mesure de distance pour estimer le profil d’inhibition de l’élément testé en effectuant les étapes décrites à la section 2. Si l’élément du test montre une inhibition de ≥25 % à n’importe quelle concentration, ajustez la plage de concentration pour les essais finaux afin d’inclure au moins trois concentrations dans la plage d’inhibition linéaire et deux concentrations en dessous de 10 % d’IRA, si applicable.
   4. Si l’élément testé montre une inhibition de <25 % dans toutes les concentrations testées, réutilisez la même série de dilution pour les essais finaux. Dans ce cas, le test de radiogondométrie peut être considéré comme l’un des trois essais indépendants requis.
      REMARQUE : Effectuez au moins deux, idéalement trois, expériences indépendantes pour chaque élément de test afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats. Si une autre dilution est choisie pour mieux couvrir la plage d’activité, une déviation du rapport de dilution 1:10 est autorisée. Le seuil de 25 % dans cette stratégie de test (voir les étapes 1.9.3 et 1.9.4) distingue les effets des items de test des témoins négatifs, tenant compte de la variabilité de l’activité de base tout en offrant une marge de sécurité supplémentaire. Ce seuil assure une classification fiable des profils inhibiteurs.

Figure 1 : Disposition des plaques pour la courbe standard à iodure. Cette figure montre la disposition des plaques à 96 puits utilisée pour générer la courbe standard de l’iodure. Les puits contiennent des dilutions sérielles d’iodure allant de 1 nM à 1 500 nM, ainsi que des contrôles_diH2 uniquement en O.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Disposition des plaques pour la titration des protéines microsomales et les tests d’articles de référence. Cette figure présente la disposition des plaques à 96 puits pour la titration des protéines microsomales et les tests par inhibiteurs de référence (6-PTU). Les rangées contiennent des quantités croissantes de protéine microsomale par puits, avec ou sans 6-PTU.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Réalisation du test DIO1–SK

1. Incubation du microsome avec l’item test
   1. Préparez l’élément de référence tel que décrit à l’étape 1.2, ainsi que le contrôle positif et négatif, comme décrit aux étapes 1.3 et 1.4. Préparez les éléments de test avec des concentrations appropriées en suivant le protocole décrit aux étapes 1.8 et 1.9.
   2. Préparez le mélange de substrat comme décrit dans le tableau 1 et préparez une suspension de microsome dans la concentration protéique prédéfinie selon l’étape 1.7 en diluant soigneusement une solution de microsome décongelée et aliquotée dans_{diH 2O}. Conservez la suspension de microsome sur la glace jusqu’à ce que nécessaire soit nécessaire pour l’incubation.
   3. En suivant la disposition des plaques illustrée dans les figures 3 et 4 (si plus de deux items d’essai sont évalués simultanément), ajoutez 10 μL de concentrations d’éléments de référence, contrôle positif et négatif, contrôle des solvants (solvant à 10 % (v/v) dans_{diH 2}O) et concentrations des items de test dans les puits.
   4. Ajoutez 40 μL de suspension à microsome à tous les puits. Ajoutez 50 μL du substrat fraîchement préparé aux échantillons.
   5. Scellez la plaque avec une feuille de plastique imperméable et placez-la sur un shaker dans un incubateur (37 °C à 850 tr/min) pendant 2 heures ; Placez la plaque après l’incubation sur la glace pour arrêter la réaction.
   6. Placez la plaque sur la glace après l’incubation pour arrêter la réaction.
      REMARQUE : La plaque peut être stockée sur la glace jusqu’à la mesure afin de préserver l’intégrité de l’échantillon. La première plaque d’essai contient huit concentrations de l’élément de référence, tandis que chaque plaque supplémentaire le même jour ne contient que la plus forte concentration de l’élément de référence, laissant plus d’espace pour des éléments de test supplémentaires si nécessaire.
2. Séparation via des plaques filtrantes à 96 puits remplies de résine échangeuse d’ions
   1. Placez une plaque filtrante préparée remplie de résine à échange d’ions à 96 puits, telle que préparée à l’étape 1.5, sur une plaque de 96 puits de profondeur et ajoutez 150 μL d’acide acétique à 10 % dans chaque puits de la plaque filtrante de 96 puits remplie de résine échangeuse d’ions pour humidifier la résine dans les colonnes.
   2. Éluvez l’acide acétique en centrifugant dans la plaque de puits utilisée de 96 profondeurs avec 100 à 200 × g dans une centrifugeuse avec un rotor basculant pour les plaques micro-titrées pendant 1 minute.
   3. Remplacez la plaque de puits usagée de 96 profondeurs par une nouvelle de 96 de profondeur.
   4. Ajoutez 133 μL d’acide acétique à 10 % dans chaque puits de la plaque incubée à 96 puits de l’étape 2.1.6 et secouez brièvement la plaque pour mélanger les solutions.
   5. Transférez 175 μL des échantillons préparés à l’étape précédente sur la plaque filtrante à 96 puits remplie de résine échangeur d’ions, en maintenant la disposition initiale de la plaque.
   6. Faites passer les échantillons à travers la résine et dans la plaque de puits de 96 de profondeur en centrifugant (100–200 × g) dans une centrifugeuse avec un rotor basculant pour les plaques micro-titrées pendant 1 minute. Retirez la plaque filtrante remplie de résine échangeuse d’ions à 96 puits.
      REMARQUE : La plaque de puits de 96 profondeurs contenant des échantillons peut être scellée avec une feuille de plastique imperméable et conservée à 4 °C pendant au moins 3 mois. Cela permet des mesures supplémentaires en cas d’erreurs manuelles/techniques ou de modifications du facteur de dilution lors de la réaction ou de la mesure de Sandell-Kolthoff les jours suivants.
3. Réaction Sandell-Kolthoff
   1. Selon le facteur de dilution déterminé des échantillons dans l’acide acétique à 10 % pour le lot de microsomes utilisé (voir étape 1.7), ajouter 50 μL de l’échantillon non dilué ou suffisamment dilué sur une nouvelle plaque à 96 puits.
   2. Ajoutez 50 μL de solution de cérium de 40 mM (préparée comme décrit dans le Tableau 1) à tous les puits et commencez la réaction en ajoutant 50 μL de solution d’arsénite de 25 mM (préparée comme décrit dans le Tableau 1) à tous les puits.
   3. Dès que possible après l’ajout de la solution d’arsénite, mesurez l’absorption à l’aide d’un lecteur de plaques à 415 nm (±2 nm) en enregistrant la densité optique (OD) chaque minute pendant 21 minutes, ainsi que l’OD initial.

Figure 3 : Disposition des plaques pour le test parallèle de deux items testés. Disposition des plaques à 96 puits pour tester deux items testés en triple mesure sur plusieurs concentrations, ainsi que des répliques des contrôles négatifs, positifs, solvants et de l’élément de référence. Utilisé comme première plaque de test de la journée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Disposition des plaques pour les essais parallèles de trois items testés. Disposition de plaques à 96 puits pour tester trois items testés en triple exemplaire sur plusieurs concentrations, avec des répliquations des témoins négatifs, positifs et solvants. L’élément de référence n’est inclus qu’à sa concentration la plus élevée, car il est entièrement testé sur la première plaque (voir Figure 3). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Tests d’interférences (microsomes ± et ± DTT)

1. Préparez la concentration la plus élevée (RI C8) de l’élément de référence (6 PTU) comme décrit à l’étape 1.2 et préparez la solution de stock et les dilutions de l’article test (concentration maximale de l’article de test incluse).
2. Préparez la suspension de microsome à la concentration définie par puits (voir étape 1.7) en diluant soigneusement des microsomes décongelés et aliquotés dans_{diH 2O}. Gardez la suspension de microsome sur glace jusqu’à utilisation.
3. Préparez deux mélanges de substrats : le mélange standard avec la TDT décrit dans le Tableau 1, et un mélange de substrats par défaut identique sans la DTT (en omettant uniquement la DTT).
4. Distribuez dans les puits désignés d’une plaque de 96 puits selon la Figure 5 : 10 μL d’IR C8, 10 μL de DMSO à 10 % (v/v) en_{diH 2}O (contrôle du solvant), et 10 μL de chaque dilution de l’élément testé.
5. Ajouter 40 μL de suspension de microsomes à des puits désignés « avec microsomes » et 40 μL de_{diH 2}O à des puits désignés « sans microsomes », selon la Figure 5.
6. Sur la glace, ajoutez 50 μL de substrat avec DTT aux puits désignés « avec DTT » et 50 μL du substrat sans DTT aux puits désignés « sans DTT » (Figure 5).
7. Scellez la plaque avec une feuille de plastique imperméable et étouffez sur un shaker dans un incubateur (37 °C, 850 tr/min) pendant 2 heures.
8. Après l’incubation, placez la plaque sur de la glace pour arrêter la réaction.
9. Effectuer la séparation par échange d’ions et la quantification de l’iodure via la réaction SK comme décrit aux étapes 2.2 et 2.3, et évaluer les résultats tels que décrits à la Section 4.
   REMARQUE : Cette configuration à plaque unique (Figure 5) teste la concentration la plus élevée d’éléments testés en parallèle avec sans microsomes et avec versus sans TDT afin de distinguer l’activité enzymatique DIO1 des artefacts de test. Une augmentation de l’IRA de ≥20 % dans les puits sans microsomes indique une interférence SK (libération/lecture d’iodure indépendante de DIO1), et la substance est classée comme « non applicable dans le test SK DIO1 » et exclue de l’analyse. Les différences entre les conditions DTT et sans TDT aident à identifier la libération d’iodure dépendante de la DTT comme mécanisme d’interférence supplémentaire.

Figure 5 : Disposition des plaques pour les essais d’interférence. Cette figure montre la disposition des plaques à 96 puits pour les tests d’interférence, où les éléments testés, l’élément de référence et le contrôle des solvants sont testés avec ou sans microsomes, en présence de la TDT, ainsi que sans microsomes et sans la présence de la DTT. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. Évaluation des données

1. Évaluation de l’activité de DIO1
   1. Déterminer les valeurs_{ΔOD 21 min} en soustrayant les valeurs de 21 min de tous les échantillons à partir des valeurs initiales mesurées (0 min) :
      
   2. Déterminez les valeurs ΔOD-BG en soustrayant la moyenne des valeurs_{ΔOD 21min} des 10 contrôles inhibitus 3 M 6-PTU (RI) des valeurs_{ΔOD 21min} de tous les échantillons :
      
   3. Normaliser les valeurs de l’élément test aux valeurs de contrôle du solvant respectives en divisant les valeurs ΔOD_21min-BG TI par la moyenne des valeurs_{ΔOD 21min} -_BG SC du solvant contrôle (SC) concerné, générant ainsi des valeurs d’activité de libération d’iodure (IRA) en %.
      
   4. Tracez les valeurs IRA des différentes concentrations des items de test dans un logiciel de statistiques, avec les valeurs IRA sur l’axe y (linéaire) et les concentrations des items test sur l’axe x (logarithmique).
   5. Utilisez un algorithme d’ajustement de courbe pour visualiser une relation concentration-réponse (par exemple, « [Inhibiteur] versus réponse — pente variable (quatre paramètres) » dans un logiciel statistique de choix. « Haut » représente la réponse maximale, « Bottom » représente la réponse la plus basse, et « HillSlope » décrit la pente de la courbe :
      
   6. Déterminez l’IC₅₀ de l’élément de référence et, le cas échéant, de l’élément testé.
   7. Calculez le coefficient de variance (CV) de l’estimation log IC₅₀ de l’élément de référence en % :
      
   8. Calculez l’IRA du contrôle négatif normalisé au contrôle du solvant en % :
      
   9. Calculez l’IRA du contrôle positif normalisé au contrôle du solvant en % :
      
   10. Calculez le facteur z :
       
   11. Pour vérifier la validité de l’expérience, comparez les valeurs calculées aux critères d’acceptation du tableau 4.
       REMARQUE : Tous les critères doivent être atteints pour obtenir une analyse valide.
   12. Classez les items de test en inhibiteurs complets, partiels ou non-inhibiteurs en fonction de leur inhibition maximale et des valeurs IC₅₀ , comme résumé dans le tableau 5.

Résultats

La figure 6 donne un aperçu du flux de travail du test DIO1-SK ainsi que des étapes clés de normalisation nécessaires pour établir avec succès la méthode en laboratoire. Le flux de travail (Figure 6A) résume les phases séquentielles du test, incluant l’utilisation de microsomes hépatiques humains, l’incubation avec des éléments de test et des témoins, l’extraction d’iodure par séparation par échange d’ions, et la quantification colorimétrique de l’iodure via la réaction de Sandell–Kolthoff (SK). La figure 6B met en lumière la stratégie de normalisation qui sous-tend la performance robuste et les résultats valides, incluant (i) la standardisation de la réaction SK, (ii) le test d’activité microsome spécifique à chaque lot, (iii) l’évaluation de la solubilité et les tests d’interférence, (iv) un test de mesure de distance, et (v) l’ajustement des concentrations des items testés en fonction de la première exécution valide du test.

Un élément central de cette stratégie est le test d’activité microsomale spécifique à chaque lot, car les lots de microsomes hépatiques humains peuvent différer considérablement dans leur activité de désiodation rT3, nécessitant la détermination d’une concentration enzymatique appropriée pour chaque nouveau lot avant un test de substance de routine.

Cette stratégie de test par étapes est essentielle pour la mise en œuvre : ce n’est qu’après vérification de la performance de base du test (contrôles, comportement de réaction SK et activité microsomeuse) et la standardisation des conditions de test que l’analyse de substances peut être censée produire des profils d’inhibition valides et interprétables.

Figure 6 : Flux de travail et étapes de standardisation du test DIO1 SK. (A) Le flux de travail illustre l’utilisation des microsomes hépatiques humains, la configuration de la plaque à 96 puits, l’incubation avec des éléments de test et des témoins, l’extraction d’iodure et la quantification colorimétrique via la réaction SK. Chaque étape est représentée séquentiellement pour mettre en évidence les phases principales de l’analyse. (B) Les étapes de normalisation incluent la standardisation de la réaction de Sandell-Kolthoff, les tests d’activité microsomiques spécifiques à chaque lot, l’évaluation de la solubilité et les tests d’interférence, l’analyse de distance, et l’ajustement des concentrations des items testés sur la base de la première exécution valide de l’analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

S’appuyant sur le cadre de workflow et de normalisation montré à la Figure 6, la Figure 7 illustre comment les laboratoires déterminent une concentration microsomale appropriée (et une dilution post-échange d’ions) afin d’obtenir une plage dynamique suffisante tout en maintenant une réponse d’inhibition sigmoïdale pour l’inhibiteur de référence. À la Figure 7A, la ΔOD21min-BG augmente avec l’augmentation des protéines microsomales et dépend de la dilution post-échange ionique (non diluée, 1:2, 1:4). La dilution qui produit le plus haut ΔOD21min-BG tout en maintenant une réponse sigmoïdale est sélectionnée pour les expériences suivantes (exemple montré : dilution 1:2). Dans la Figure 7B, les courbes d’inhibition 6-PTU sont comparées entre les quantités de protéines microsomales afin d’identifier la concentration protéique la plus faible qui donne encore une courbe sigmoïdale (exemple montré : 5 μg de protéine/puits), équilibrant ainsi la sensibilité avec le fond.

Il est important de noter que cette étape d’optimisation doit être réalisée par chaque laboratoire lors de la mise en œuvre de la méthode, car la concentration protéique requise dépend de l’activité du lot microsome utilisé, nécessitant une standardisation spécifique à chaque lot de la concentration enzymatique.

Figure 7 : Activité microsomale et inhibition par 6-PTU. (A) Le graphique montre l’augmentation de l’activité à mesure que le signal Sandell-Kolthoff corrigé par fond (BG) (ΔOD_{21 min} n- BG) avec des quantités croissantes de protéine microsomale par puits (log10[μg protéine/puits]), testé à des dilutions non diluées, 1:2 et 1:4. La plus grande dilution avec la valeur_{ΔOD 21 min}– BG la plus élevée, ainsi qu’avec une forme sigmoïde, sera utilisée pour les expériences futures. Dans ce cas, c’est la dilution 1:2. (B) Courbe concentration-réponse de l’inhibiteur de référence 6-propyl-2-thiouracil (6-PTU) montrant l’activité de libération d’iodure (IRA en %) tracée par rapport à log10[concentration (M)] à différentes charges protéiques microsomales (protéines 5, 7,5 et 10 μg/puits). Les valeurs IRA sont normalisées au solvant témoin. Les points de données des deux graphes représentent la moyenne ± écartage de trois réplications techniques (puits) par condition issues d’un test représentatif d’activité microsomique. Les courbes ont été ajustées par régression non linéaire à l’aide d’un modèle logistique à quatre paramètres (« pente variable ») (inhibiteur vs. réponse). La plus petite concentration de protéines avec une courbe sigmoïdale sera utilisée pour les expériences futures ; Dans ce cas, 5 μg/puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Une fois le flux de travail et les étapes de normalisation (Figure 6) terminés et une concentration appropriée de protéines microsomiques établie pour le lot microsome sélectionné (Figure 7), les paramètres de base du test sont en place pour poursuivre les tests de routine des substances. À ce stade, les items de test peuvent être évalués parallèlement au jeu de contrôle de la plaque (élément de référence, contrôle du solvant et contrôles positif/négatif) dans le format standardisé de la plaque, permettant une normalisation robuste et une interprétation cohérente des profils d’inhibition.

La figure 8 montre la discrimination des tests basée sur le comportement concentration-réponse dans l’activité de libération d’iodure (IRA). L’inhibiteur de référence 6-PTU (Figure 8A) montre une diminution de l’IRA dépendante de la concentration, fournissant le profil d’inhibition sigmoïdal attendu, tel qu’attendu pour la vérification de la performance du test. L’acide tannique (Figure 8B) présente un profil inhibiteur comparable à l’inhibiteur de référence (inhibition maximale > 90 %) dans les conditions indiquées. Les trois concentrations les plus élevées de la substance testée présentaient des valeurs IRA négatives. Les valeurs IRA de <0 % ne reflètent pas une « libération négative d’iodure » biologiquement significative mais résultent de la procédure de calcul (soustraction de fond et normalisation vers le contrôle du solvant), ce qui peut propager de petites fluctuations dans le contrôle du solvant en valeurs normalisées négatives. En conséquence, les valeurs IRA inférieures à 0 % sont considérées comme équivalentes à 0 % (de base) pour l’interprétation des résultats. Le dibutylphtalate (Figure 8C) ne présente aucune inhibition (inhibition maximale inférieure à 25 %) sur toute la plage de concentration testée, ce qui représente un profil non inhibiteur. Ensemble, ces profils illustrent que le test peut différencier le comportement inhibiteur de non inhibiteur dans des conditions standardisées. Le système de test peut également identifier des inhibiteurs partiels, qui montrent des niveaux maximaux d’inhibition entre 25 % et 90 % (données non montrées). Plus de détails sur la façon dont ces catégories sont disponibles se trouvent dans le tableau 5.

Figure 8 : Le comportement dose-réponse du test DIO1–SK distingue les inhibiteurs des non-inhibiteurs. Les courbes dose-réponse montrent l’activité de libération d’iodure (IRA en %) tracée par rapport à la concentration log10 (M) pour (A) l’inhibiteur de référence 6-PTU, (B) un inhibiteur représentatif (acide tannique), et (C) un non-inhibiteur représentatif (phtalate de dibutyle). Les valeurs d’IRA ont été calculées après soustraction de fond et normalisées au contrôle du solvant. Les symboles représentent la moyenne ± DE (n = 3) issues d’une expérience indépendante, chacune réalisée avec trois réplices techniques (puits) par concentration. Les courbes ont été ajustées par régression non linéaire à l’aide d’un modèle logistique à quatre paramètres (« pente variable ») (inhibiteur vs. réponse). Les valeurs IRA inférieures à 0 % sont considérées comme équivalentes à 0 % (de base) pour l’interprétation des résultats. Ces données démontrent que le test fournit un profil d’inhibition sigmoïdal pour l’inhibiteur de référence et peut confirmer si une courbe concentration-réponse est inhibitrice ou non inhibitrice dans des conditions standardisées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Dans une analyse valide, les contrôles solvants (SC) montrent une séparation claire_{du signal ΔOD 21 minutes} par rapport à la condition de référence entièrement inhibée (6-PTU, RI-C8). Dans un jeu de données d’exemple (10 passages indépendants), chaque plaque comprenait n = 9 réplications techniques pour SC et la référence entièrement inhibée (6-PTU à 10⁻³ M). Sur les plaques, les valeurs moyennes de la SC ΔOD_21min de la plaque variaient de 1,383 à 1,819 (moyenne ± DM : 1,565 ± 0,114), tandis que les valeurs moyennes de ΔOD_{de la plaque à 21} min pour la condition inhibite de 6-PTU variaient de 0,258 à 0,771 (moyenne ± DM : 0,473 ± 0,087). Le calcul de ΔOD dans ce test est basé sur la différence entre OD_0min et_{OD 21min}, et la validité du test est généralement soutenue par un seuil de facteur z de >0,5.

Sur 10 essais indépendants, le 6-PTU a produit une courbe concentration-réponse sigmoïdale avec des valeurs IC₅₀ allant de 1,20E-06 M à 5,02E-06 M (moyenne ± DE : 2,74E-06 M ± 1,13E-06 M). Les critères d’acceptation pour les valeurs IC₅₀ dans la plage de référence de 1,00E-06 à 1,00E-05 sont basés sur des données issues d’études de validation antérieures. Cependant, les valeurs de l’IC₅₀ sont significativement influencées par le lot spécifique de microsomes utilisé et peuvent présenter une variabilité considérable. Néanmoins, ces variations devraient rester dans le même ordre de grandeur.

La qualité de l’essai peut être résumée à l’aide du facteur z′, qui reflète à la fois la fenêtre du signal et la variabilité des contrôles. Dans l’ensemble de données décrit, six courbes de référence étaient associées à des facteurs z′ allant de 0,544 à 0,774 (moyenne ± DE : 0,658 ± 0,062), ce qui correspond à la cible d’acceptation couramment utilisée de z′ > 0,5.

En pratique, des passages sous-optimaux peuvent être identifiés par des écarts dans le fond du test et/ou par le non-respect des critères d’acceptation prédéfinis. Par exemple, un fond élevé dans la réaction de Sandell-Kolthoff est indiqué lorsque le blanc diH₂O pur montre ΔOD > 0,3, ce qui justifie une enquête (par exemple, contamination par réactif ou problèmes de qualité de l’eau). De telles augmentations de fond peuvent réduire la plage dynamique de l’essai et augmenter la variabilité du contrôle, contribuant ainsi à l’échec des critères d’acceptation, y compris un facteur z en dessous de 0,5. Les puits présentant des artefacts techniques évidents (par exemple, précipitations ou décoloration anormale) sont exclus comme valeurs aberrantes de l’évaluation. Les valeurs aberrantes déterminées par le test de boîtes sont également exclues. Si les critères d’acceptation ne sont pas remplis après la suppression des valeurs aberrantes, la série d’essais est considérée comme non valide et doit être répétée.

Réactif/Tampon	Informations sur la préparation
Solution acide d’ammonium cérium (40 mM (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O, 0,5 M H2SO4) (250 mL)	Ajoutez 6,32 g de (NH4)4Ce(SO4)4*2H2O et 125 mL de diH2O à une flasque volumétrique de 250 mL. Ajoutez 125 mL 1 M H2SO4 pour atteindre un volume final de 250 mL. Conserver à température ambiante jusqu’à 6 mois.
DTT (Aliquotes de 1 M)	Aliquot a préparé ou fourni une solution DTT de 1 M en H2O sous forme d’aliquotes de 0,5 mL dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL et conserver à -20°C pendant jusqu’à 6 mois.
HEPES (50 mM) / EDTA (2,16 mM) tampon (pH 7,0)	À l’aide d’un flasque volumique de 250 mL, ajoutez 12,5 mL de solution 1 M HEPES, 201 mg d’acide éthylédidiaminetétraacétique (EDTA) et remplissez jusqu’à 250 mL de diH2O. Conserver à 4°C jusqu’à 3 mois.
Solution rT3 (« tubes de mélange de substrat »)	Dissoudre rT3 dans du DMSO jusqu’à une concentration finale de 6 mM, les aliquoter en portions de 10 μL dans des tubes centrifugeuses de 15 mL et les stocker à -20°C pendant jusqu’à 6 mois.
Solution d’arsénite sodique (25 mM NaAsO2, 0,8 M NaCl, 0,5 M H2SO4) (250 ml)	Ajoutez 0,81 g de NaAsO2, 11,7 g de NaCl et 125 mL de diH2O à une fiole volumétrique de 250 mL. Ajoutez 125 mL 1 M H2SO4 pour atteindre un volume final de 250 mL. Conserver à température ambiante jusqu’à 6 mois.

Tableau 1 : Préparation des tampons et des réactifs. Ce tableau détaille les étapes de préparation et les instructions de stockage pour tous les tampons et solutions d’origine utilisés dans le test DIO1 SK, y compris le tampon HEPES/EDTA, la DTT, la solution rT3, la solution acide d’ammonium cérium et la solution d’arsénite sodique.

Nom de la dilution de l’élément de référence	Concentration de dilution de l’élément de référence [M]	10 % DMSO [μL]	Élément de référence	Concentration finale de l’élément de référence dans l’essai [M]
RI-C8	1.00E-02	450	50 μL de solution de stock de référence 10-1 M	1.00E-03
RI-C7	1.00E-03	450	50 μL de RI-C8	1.00E-04
RI-C6	1.00E-04	450	50 μL de RI-C7	1.00E-05
RI-C5	3.16E-05	342	158 μL de RI-C6	3.16E-06
RI-C4	1.00E-05	450	50 μL de RI-C6	1.00E-06
RI-C3	3.16E-06	450	50 μL de RI-C5	3.16E-07
RI-C2	1.00E-06	450	50 μL de RI-C4	1.00E-07
RI-C1	1.00E-07	450	50 μL de RI-C2	1.00E-08

Tableau 2 : Préparation des dilutions des éléments de référence. Ce tableau résume la préparation des dilutions en série pour l’élément de référence (6-PTU), incluant les concentrations, les volumes de DMSO et les concentrations finales utilisées dans l’essai.

Microsome par puits [μg]	diH2O [μL]	Dilution des microsomes [μL]	Concentration finale d’enzyme dans le test [μg/mL]
20	780	20 μL de solution de microsome à 20 mg/mL	200
10	400	400 μL de 20 μg de microsome par dilution de puits	100
5	400	400 μL de 10 μg de microsome par dilution de puits	50
2.5	400	400 μL de 5 μg de microsome par dilution de puits	25
1.25	400	400 μL de dilution de 2,5 μg de microsome par puits	12.5
0.68	400	400 μL de dilution de 1,25 μg de microsome par puits	6.8

Tableau 3 : Préparation des dilutions de microsomes. Ce tableau présente le schéma de dilution pour la protéine microsomale par puits, incluant les volumes requis de diH₂O et de solution de stock microsomal pour atteindre les concentrations finales de protéines microsomales pour l’analyse.

Critères d’acceptation	Valeur de coupure suggérée
Numérique
IC50 de l’élément de référence [M]	1*10-05 - 1*10-06
CV du journal IC50 estimation de l’élément de référence [ %]	< 3
Contrôle négatif IRA [ %]	80 - 120
Contrôle positif IRA [ %]	20 <
Z'-Factor	> 0,5
Binaire
Forme de l’élément de référence (sigmoïdal ?)	Oui
La courbe concentration-réponse finale de l’élément de référence est composée d’au moins six concentrations issues de trois réplications	Oui
La courbe concentration-réponse finale de l’item testé est composée d’au moins six concentrations issues de trois réplications	Oui

Tableau 4 : Critères d’acceptation pour l’essai DIO1 SK. Ce tableau liste les critères d’acceptation pour la validité du dossage tels que la plage IC₅₀, le coefficient de variation, les valeurs IRA pour les témoins, le facteur z, et les exigences pour les courbes concentration-réponse. Les fenêtres d’acceptation ont été dérivées des études de validation DIO1-SK précédemment^{rapportées 6}, incluant une évaluation de reproductibilité basée sur cinq exécutions indépendantes qui ont informé la fenêtre de référence IC₅₀. Dans un jeu de données d’exemple de 10 exécutions indépendantes, la performance à z′ factoriel variait de 0,544 à 0,774 (moyenne ± SD : 0,658 ± 0,062), soutenant le seuil d’acceptation z′ utilisé ici.

Catégorie (par efficacité)	Sous-catégorie (par puissance)	Activité d’inhibition	Seuil
Catégorie 1 : inhibiteur complet	R : Inhibiteur complet puissant	Inhibe complètement l’activité de DIO1 à une concentration comparable à celle de l’élément de référence 6-PTU	Inhibition maximale supérieure à 90 % et IC50 à la plage supérieure ou inférieure à l’IC50 de 6-PTU
	B : Inhibiteur complet faible	Inhibe complètement l’activité de la DIO1 à des concentrations plus élevées que l’élément de référence 6-PTU	Inhibition maximale supérieure à 90 % et IC50 au-dessus de la plage supérieure IC50 du 6-PTU
Catégorie 2 : inhibiteur partiel	-	Pas d’inhibition complète, mais plus que le contrôle négatif et solvant	Inhibition maximale entre 25 % et 90 %
Catégorie 3 : non inhibiteur	-	Cela n’inhibe pas le DIO1 (comme le contrôle du négatif et du solvant)	Inhibition maximale inférieure à 25 %

Tableau 5 : Classification des éléments testés basée sur la puissance et l’efficacité de l’inhibition de DIO1. Les items testés sont classés en trois groupes d’efficacité (complet, partiel ou non inhibiteur) selon leur inhibition maximale de l’activité DIO1. Les inhibiteurs complets sont en outre sous-catégorisés selon leur puissance, selon leur IC₅₀ par rapport à l’élément de référence 6-PTU.

Discussion

Le test DIO1-SK offre une alternative non radioactive, rentable et évolutive aux méthodes traditionnelles d’évaluation de l’activité DIO1, telles que les tests radiomarqués ou la spectrométrie de masse. Sa prévalidation pour les microsomes hépatiques humains et sa forte concordance avec les mesures SPE-LC-MS/MS des niveaux d’hormones thyroïdiennes confirment sa fiabilité et sa pertinence réglementaire, comme en témoigne son inclusion dans le plan de travail des recommandations de l’OCDE. La simplicité de la réaction de Sandell-Kolthoff (SK) rend le test accessible aux laboratoires sans instrumentation avancée.

Dans le protocole actuel, plusieurs aspects pratiques ont été spécifiés avec plus de détails par rapport aux procédures DIO1-SK publiées précédemment afin de renforcer la robustesse et la reproductibilité dans un format routinier à 96 puits. Ces clarifications portent sur la logique du concept de contrôle (contrôles solvant, négatif et positif), la décision d’utiliser des plaques de résine échangeuse d’ions fraîchement préparées plutôt que de réutiliser des plaques déjà coulées, et les conditions de réaction SK qui améliorent la robustesse de la manipulation dans les mesures de plaques multi-puits, tout en maintenant l’interprétation biologique cohérente avec les travaux de normalisation^{antérieurs 6,7}.

Malgré ses forces, plusieurs étapes critiques doivent être abordées pour quantifier avec précision l’iodure libéré lors de la conversion médiée par DIO1 de rT3 en T2. Cela est obtenu via la réaction de Sandell-Kolthoff, qui nécessite un timing précis et une manipulation constante des réactifs pour garantir la reproductibilité. La réaction SK est un processus catalytique rapide dans lequel l’iodure accélère la réduction du cérium jaune (IV) en cérium incolore (III) par l’arsénite ; Le taux de changement de couleur est directement proportionnel à la concentration d’iodure. Comme la réaction se déroule rapidement une fois la solution d’arsenic ajoutée, il est essentiel que la mesure commence sans délai. Dans un format de plaques à 96 puits, l’ajout lent ou incohérent de la solution d’arsenic peut introduire une variabilité significative entre les puits. Par conséquent, l’utilisation d’une pipette multicanal ou d’un distributeur automatisé est fortement recommandée afin d’assurer un ajout uniforme et rapide de réactifs sur tous les puits.

Pour maximiser la comparabilité entre puits et entre plaques, l’ordre d’ajout de réactifs dans la réaction SK doit être maintenu cohérent avec le flux de travail décrit : le cérium est présent comme substrat chromogénique, et la réaction est initiée par l’ajout d’arsénite, qui définit le temps de départ et nécessite donc une distribution rapide et synchronisée. Les ordres d’addition de réactifs alternatifs n’ont pas été évalués dans cette configuration ; Ainsi, il n’est pas recommandé de changer l’ordre lors de la reproduction du protocole. De plus, la concentration en cérium peut influencer les caractéristiques pratiques de performance de l’affichage SK (par exemple, la fenêtre du signal et la robustesse). Alors que 25 mM de cérium était défini comme une condition standard validée lors d’une standardisation antérieure des tests, des concentrations plus élevées comme 40 mM ont montré qu’elles augmentaient la fenêtre du signal et le facteur z′ sans affecter les valeurs IC₅₀ ni l’interprétation biologique, comme déjà décrit dans des travaux^{précédents 6}. Dans ce protocole, 40 mM de cérium est utilisé pour assurer une complexation complète et rapide de l’iodure dans les conditions de test et pour améliorer la robustesse et la stabilité du signal lors des mesures de routine sur plaques. Les critères d’acceptation (par exemple, facteur z, valeurs_{IC 50} de l’inhibiteur de référence) sont basés sur la performance historique observée lors d’études de validation antérieures et sont destinés à constituer un contrôle de performance de routine lors des essais.

L’utilisation de microsomes hépatiques humains introduit une variabilité biologique, rendant essentielle la standardisation de l’activité de libération d’iodure spécifique par lot par microsome. Une préparation minutieuse des plaques filtrantes remplies de résine à échange d’ions est nécessaire pour éviter une répartition inégale de la résine sur la plaque filtrante et pour assurer une séparation complète de l’iodure des substances potentiellement interférantes. En ce qui concerne le flux de travail de la résine, des plaques filtrantes remplies de résine à échange d’ions fraîchement moulées ont été choisies afin de minimiser le risque potentiel de variabilité supplémentaire due à la saturation en résine, au transfert d’iodure ou de protéines, ainsi qu’à une perte potentielle d’efficacité de liaison lors de la réutilisation. La réutilisation de résine et de plaques filtrantes est techniquement envisageable, mais pourrait comporter certains risques qui n’ont pas été systématiquement évalués dans cette étude. Elle peut introduire une dérive batch à lot si la capacité de liaison de la résine est réduite ou si des composants résiduels de la matrice restent dans le lit de résine après des passages précédents. Pour les laboratoires envisageant le recyclage, une recommandation pragmatique est de valider la performance de la résine après réutilisation (par exemple, en surveillant le comportement des courbes de fond et standard et en assurant une capture cohérente de l’iodure) et d’arrêter la réutilisation si un fond accru, une plage dynamique réduite ou une séparation inégale est observée. Il est recommandé d’utiliser des plaques filtrantes remplies de résine pour usage unique, car ce protocole a été spécifiquement développé selon cette méthodologie.

De plus, la solubilité de chaque élément testé doit être déterminée dans un véhicule approprié, car la concentration maximale testée est limitée par la solubilité (généralement jusqu’à 1 mM avec 1 % de DMSO). Parce que tous les composés d’essai sont appliqués en DMSO comme solvant, le contrôle du solvant définit l’activité de base de la DIO1 dans des conditions pertinentes pour l’analyse et sert de condition de référence la plus appropriée pour la normalisation et la comparaison. En revanche, le sel sodique 1-thio-β-D-glucose a été inclus comme témoin négatif car il est structurellement similaire à l’aurothioglucose témoin positif (ATG) mais chimiquement inerte par rapport à la déiodination à iodothyronine et n’interfère pas avec les systèmes redox microsomaux ni l’activité catalytique de la DIO1. Son inclusion permet de distinguer les véritables effets spécifiques à la DIO1 des effets non spécifiques liés à l’addition de composés, à la manipulation ou aux interactions matricielles de test. Un contrôle sans traitement/sans véhicule n’a pas été utilisé comme condition de référence principale car il ne refléterait pas l’environnement réel de test dans lequel la DMSO est présente dans tous les puits traités à base de composés ; par conséquent, le contrôle du solvant constitue la référence pour l’interprétation du test.

Le dépannage se concentre sur l’identification des interférences dans la réaction SK. Les substances contenant de l’iode, chélantes ou fortement oxydantes peuvent affecter artificiellement la lecture colorimétrique 14,17,18. Pour y remédier, le protocole inclut des tests d’interférence sans microsomes. De plus, l’utilisation du dithiothréitol (DTT) comme cofacteur peut également entraîner la libération d’iodure non enzymatique de certaines substances testées. Dans de tels cas, des méthodes orthogonales comme SPE-LC-MS/MS sont recommandées pour confirmer l’inhibition de DIO1. Des interférences non spécifiques via des effets généraux de dénaturation (par exemple, les tensioactifs) peuvent générer des faux positifs, donc une stratégie générale pour identifier les frappeurs fréquents, utilisant des outils in silico ou des approches de test intégrées, peut être précieuse.

Le test présente plusieurs limitations. Il est sensible aux interférences des substances testées qui réagissent avec les composants du test ou libèrent de l’iodure indépendamment de l’activité du DIO1. Le test ne fait pas de distinction entre l’inhibition spécifique de DIO1 et l’interférence non spécifique avec la fonction enzymatique ou l’intégrité structurelle. Pour améliorer la spécificité, l’inhibition d’enzymes microsomales supplémentaires peut être analysée en parallèle, et comparer les puissances inhibitrices entre différents tests enzymatiques peut fournir des preuves supplémentaires.

Une autre stratégie pour identifier les artefacts possibles consiste à inclure des tests d’intégrité ou de viabilité, comme ils sont couramment réalisés dans les tests in vitro à base cellulaire, afin de définir la concentration maximale testée. Bien qu’un test d’intégrité direct fasse défaut pour le test DIO1-SK, son utilisation dans une batterie de test in vitro permet d’intégrer des données de cytotoxicité provenant d’autres tests cellulaires pour orienter la sélection des concentrations. Si ces informations de test croisé ne sont pas disponibles, la concentration supérieure dans le test DIO1-SK est limitée par la solubilité, qui peut ne pas refléter les expositions in vivo pertinentes. Cependant, les approches toxicocinétiques peuvent être utilisées pour mieux définir et interpréter les concentrations de tests in vitro.

Le test DIO1-SK est particulièrement précieux dans le dépistage toxicologique et les études mécanistes des perturbations endocriniennes. Il traite un événement clé de l’homéostasie de l’hormone thyroïdienne et peut être intégré dans les piles de test in vitro. Sa robustesse, sa reproductibilité et son adaptabilité à différents environnements de laboratoire et besoins de débit en font un outil précieux pour l’évaluation de la sécurité chimique et la validation réglementaire. Le test fournit une mesure robuste in vitro de l’inhibition de DIO1 dans des conditions standardisées et soutient la classification des substances testées par rapport à un inhibiteur de référence bien caractérisé (6-PTU). Cependant, les données in vivo sur l’inhibition de DIO1 sont rares, et la corrélation directe des résultats d’inhibition in vitro avec les effets in vivo n’est donc pas actuellement applicable pour estimer la prédiction in vivo. En conséquence, les résultats des tests doivent être interprétés comme des preuves mécanistes d’une interférence avec un événement clé du métabolisme des hormones thyroïdiennes et intégrés à des lignes de preuve supplémentaires (par exemple, d’autres tests de MoA thyroïdien et des mesures orthogonales lorsque nécessaire). Il est important de noter que le test DIO1–SK a été évalué dans plusieurs études orientées validation (optimisation/standardisation, évaluation de la prédictivité et analyse de robustesse/précision^)6,7,15, et à mesure que la méthode progresse vers la mise en œuvre par l’OCDE, le présent article fournit un niveau de détail procédural étape par étape destiné à faciliter le transfert et la mise en œuvre cohérente entre d’autres laboratoires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-Thio-&bêta ;-D-glucose sel sodique	Sigma-Aldrich	T6375-1G	CAS 10593-29-0
3,3',5'-triiodothyronine (rT3)  ;	Santa Cruz Biotechnologie	SC-209692	CAS 5817-39-0
6-Propyl-2-thiouracil (6PTU)	Supelco	P3755-10G	CAS 51-52-5
Acide acétique	Thermo Fisher	9526-33	CAS 64-19-7
Bilan analytique	NA	NA	capable de peser avec précision jusqu’à 30 g avec une lisibilité de 0,1 mg
Oxyde de sodium d’arsenic (NaAsO2)	Thermo Fisher	041533.AP	CAS 7784-46-5
Plaques d’essai (format à 96 puits)	Merck	Z707902-108EA	par exemple, plaques de culture tissulaire, plaque à 96 puits, fond plat, polystyrène, 0,34 cm2, stérile, 108/cs, TPP
Aurothioglucose (ATG)	Sigma-Aldrich	A0606-5MG	CAS 12192-57-3
Tubes centrifugeuses 15 et 50  ; mL	Merck	Z707724-800EA, Z707716-320EA	par exemple, tubes centrifugeuses TPP, volumes 15 et 50 mL, polypropylène,   ;
Centrifugeuse avec rotor basculant pour plaques de micro-titrage	NA	NA	Elles devraient être assez hautes pour accueillir une plaque de puits de 96 puits de profondeur avec une feuille filtrante de 96 puits au-dessus (au moins 6 cm de haut).
Cérium (IV) sulfate d’ammonium (Ce(NH4)4(SO4)4)	Sigma-Aldrich	22269-100G-F	CAS 10378-47-9
Incubateur à CO2	NA	NA	capable de maintenir des températures de 37°C ; C, 5 % de CO2 et &ge ; 90 % d’humidité
Plaques de puits profonds (format 96 puits)	Supelco	575653-U	par exemple SPE 96 - Plaque de collecte carrée carrée profonde, volume de puits 2 mL, polypropylène
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	AppliChem	A3672,0250	CAS 67-68-5
Dithiothréitol (TDT)	Sigma-Aldrich	D9779-1G	CAS 3483-12-3
Acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) & nbsp ;	Sigma-Aldrich	APO456787707-500G	CAS 6381-92-6
Plaques filtrantes (format 96 puits)	Merck	WHA77002810	par exemple Micro-Plates, 96-puits, polystyrène clair, 800 & micro ; L, liaison ADN, Whatman
Scellants de plaques étanches au gaz	Thermo Fisher	232698	par exemple ruban d’étanchéité, polyester, stérile, ruban d’étanchéité, polyester, stérile, Nunc
HEPES	Pan Biotech	P05-01100	CAS 7365-45-9
Microsomes hépatiques humains	Biovit	X008070	par exemple, INVITROCYP 150 - Microsomes hépatiques humains regroupés par donneurs
Iodure (norme CI)	Supelco	41271-100ML	par exemple, norme d’iodure pour CI, 1000 mg/L dans l’eau, Sigma-Aldrich
Résine à échange ionique comme la Dowex 50WX2	Roth	334.4	CAS 12612-37-2 ; Mesh 100-200
Tubes microcentrifuge 1,5  ; mL	Merck	EP0030120086-1PAK	par exemple Eppendorf & reg ; Tubes de microcentrifuge Safe-Lock, volume 1,5 mL, naturels
Distributeur multicanal capable de délivrer 50 à 300 & nbsp ; & micro ; L par étape	NA	NA	NA
Pipette multicanal capable de délivrer de 10 à 100 & nbsp ; & micro ; L par étape	NA	NA	NA
Un pH-mètre avec électrode et tampons d’étalonnage	NA	NA	capable de lire +/- 0,1 unités de pH
Photomètre pour la mesure de l’absorbance	Tecan Trading AG	NA	par exemple Sunrise Absorbance Reader, INSTSUN-3
Pipettes capables de délivrer de 1 à 10 & nbsp ; & micro ; L	NA	NA	NA
Des pipettes capables de délivrer de 10 à 100   ; & micro ; L	NA	NA	NA
Pipettes capables de délivrer de 100 à 1000 & nbsp ; & micro ; L  ;	NA	NA	NA
Pipettes pour des volumes plus élevés	NA	NA	Pipettes sérologiques, par exemple 10, 25, 50 mL
Vibrateur de plaque	Thermo Fisher	NA	par exemple, plaque micro-titer Thermo Scientific H+P monoshake vortexer, directement contrôlée
Pipette à répéteur	NA	NA	NA
Chlorure de sodium (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888-25G	CAS : 7647-14-5, par exemple chlorure de sodium, réactif ACS, etc. 99.0 %
Logiciels de statistiques	NA	NA	Capable d’effectuer une analyse de régression reflétant les caractéristiques du test et capable de calculer les concentrations inhibitrices, par exemple GraphPad Prims 8, GraphPad
Acide sulfurique (H2SO4)  ;	Supelco	1007311000	CAS 7664-93-9
Flasque volumétrique	NA	NA	certifié avec un volume défini