Article de méthode

Isolement et identification des cellules synogéniales primaires de type fibroblaste chez des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde

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DOI :

10.3791/70116

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24 février 2026

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1Graduate School, Beijing University of Chinese Medicine, 2Department of TCM Rheumatology, China-Japan Friendship Hospital, 3Beijing Key Lab for Immune-Mediated Inflammatory Diseases, China-Japan Friendship Hospital

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la méthode permettant d’isoler et d’identifier les synoviocytes primaires de type fibroblaste (FLS) de haute pureté à partir du tissu synovial des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde afin d’une modélisation fiable de la maladie et du dépistage médicamenteux.

Résumé

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire auto-immune chronique, caractérisée par une hyperplasie synoviale et une destruction progressive des articulations comme principale caractéristique pathologique. Les synoviocytes de type fibroblaste (FLS) sont reconnus comme des composants cellulaires clés dans la pathogenèse de la PR, caractérisés par leur comportement agressif et tumoral, qui médiatise la destruction du cartilage et des os. L’isolement et la purification des synoviocytes de type fibroblaste (RA-FLS) de la polyarthrite rhumatoïde est un outil essentiel pour étudier les mécanismes de la maladie et évaluer les médicaments thérapeutiques potentiels. Nous présentons ici un protocole complet pour isoler, cultiver et valider fonctionnellement la RA-FLS primaire humaine à partir d’échantillons de tissu synovial réséqués obtenus lors d’une chirurgie de remplacement du genou chez des patients atteints de PR. Cette méthode utilise du tissu synovial frais et un processus de digestion enzymatique séquentielle avec trypsine et collagénase de type II afin de maximiser l’isolement de la RA-FLS de la matrice tissulaire. Enfin, l’identification cellulaire est réalisée par l’immunofluorescence de Vimentine et la cytométrie en flux, complétée par une évaluation fonctionnelle de la prolifération induite par le TNF-α. Ce protocole permet l’acquisition de cultures de RA-FLS de haute pureté avec des caractéristiques phénotypiques spécifiques et une réactivité inflammatoire, offrant aux chercheurs une méthode fiable pour obtenir des RA-FLS de culture à court terme, dérivés du patient, adaptés au dépistage médicamenteux, aux études mécanistiques et aux applications en ingénierie tissulaire.

Introduction

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie inflammatoire auto-immune chronique caractérisée par une polyarthrite symétrique des articulations périphériques, avec une prévalence mondiale estimée de 0,5 % à 1 % et un potentiel d’induire diverses complications systémiques etextra-articulaires 1,2,3,4,5. La caractéristique pathologique centrale de la PR est la synovite chronique médiée par des réponses auto-immunes, ce qui conduit à la formation de tissu pannus invasif érodant le cartilage articulaire et l’ossous-chondral 6,7. Parmi celles-ci, la synovite représente la marque pathologique la plus ancienne et la plus centrale de la PR. Les synoviocytes de type fibroblaste (FLS), qui sont les cellules résidentes prédominantes du synovium, jouent un rôle clé dans l’orchestration à la fois de l’inflammation synoviale et de la destructionosseuse 8,9. Lors de la réponse inflammatoire synoviale dans la PR, les synoviocytes de type fibroblaste de la polyarthrite rhumatoïde (RA-FLS) perdent leur phénotype « régulateur » normal et présentent à la place un profil « pro-inflammatoire» 10. Ce changement conduit à une production massive de cytokines inflammatoires, qui peuvent activer les voies métaboliques énergétiques apparentées, entraînant une prolifération cellulaire accrue et amplifiant davantage la cascade inflammatoiresynoviale 11,12,13. Simultanément, les RA-FLS interagissent avec d’autres cellules immunitaires (telles que les macrophages, les lymphocytes T et les cellules B) pour maintenir un état inflammatoire chroniquepersistant 14,15. De plus, les RA-FLS présentent des caractéristiques similaires à celles du cancer, notamment une capacité migratoire accrue, une invasivité, une prolifération incontrôlée et une résistance à l’apoptose, et sont activement impliqués dans les processus d’érosion du cartilageet des osseux 16.

Ces dernières années, les FLS ont été largement utilisées comme modèles in vitro pour étudier les maladies inflammatoires articulaires telles que la PR, une tendance en partie due aux limites des pharmacothérapies de première intentionactuelles 17,18,19. Ils sont utilisés dans des cultures 2D, des modèles 3D et des systèmes organe sur puce pour étudier les mécanismes de la maladie, valider des cibles thérapeutiques et effectuer des dépistagesde dépistage des médicaments 20,21,22,23. De plus, le RAFLS sert de base pour des applications avancées, notamment les organoïdes synoviaux dérivés du patient pour prédire la réponse des DMARD ; l’édition génétique via CRISPR/Cas9 pour étudier la fonction génique dans la progression de la PR ; et comme source cellulaire pour l’ingénierie des greffes de tissu synovialfonctionnel 24,25,26.

L’obtention de RA-FLS cultivée à court terme dans le tissu synovial de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde constitue la première étape de nombreuses expériences. Comparées aux lignées cellulaires FLS, les RA-FLS cultivées à court terme et dérivées du patient conservent l’hétérogénéité inter-patient et des caractéristiques spécifiques à la maladie, permettant une représentation plus authentique des facteurs transcriptionnels liés à la maladie et des différences de régulation des voies. Par conséquent, le rendement cellulaire, le taux de croissance et la performance fonctionnelle peuvent être influencés par des facteurs spécifiques au patient tels que l’âge, la durée de la maladie, les antécédents médicamenteux et l’activité de la maladie, entraînant un certain degré de variabilité entre lots. Les chercheurs devraient donc évaluer le contexte clinique de la source tissulaire avant l’utilisation et mener des expériences dans les premiers passages (P3-P7) afin de maintenir la stabilité phénotypique des cellules.

Cette étude détaille un protocole simplifié pour extraire et identifier la RA-FLS à partir du tissu synovial du genou. La méthode utilise une digestion enzymatique séquentielle (trypsine suivie de collagénasine de type II) combinée à une dissociation mécanique douce. Les preuves suggèrent que de telles stratégies enzymatiques optimisées et en plusieurs étapes surpassent généralement les traitements à enzyme unique ou non séquentiels à enzymes mixtes, ce qui peut compromettre la viabilité cellulaire et le phénotype 27,28,29,30. En comparaison, le protocole présenté permet une isolation plus efficace et plus douce des RA-FLS de haute viabilité et de haute pureté, minimisant les dommages cellulaires et la perte phénotypique afin d’assurer l’adéquation des tests fonctionnels en aval.

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Protocole

Cette étude a recueilli des tissus synoviaux de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde subissant une chirurgie de remplacement articulaire à l’hôpital China-Japan Friendship. Tous les patients ont donné un consentement écrit éclairé avant l’opération. Les informations collectées et les échantillons biologiques ont été traités avec des mesures strictes pour garantir la confidentialité des patients et la sécurité des données. Tous les spécimens restants de tissu synovial ont été éliminés conformément aux réglementations de biosécurité. L’utilisation de tissu synovial de l’articulation du genou provenant de patients atteints de polyarthrite rhumatoïde dans cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’Hôpital de l’amitié Chine-Japon (Approbation n° : 2025-KY-223). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Acquisition et préparation du tissu synovial

REMARQUE : Placez le tissu synovial obtenu lors de l’intervention dans un récipient stérile rempli de solution saline à 0,9 % ou PBS afin d’éviter toute contamination lors du transfert de la salle d’opération vers l’armoire de biosécurité. Utilisez l’immersion à l’éthanol suivie d’un lavage avec une solution de pénicilline-streptomycine comme étapes cruciales pour prévenir la contamination bactérienne ou fongique, garantissant ainsi le succès des expériences ultérieures.

  1. Immergez du tissu synovial frais dans un tube centrifuge de 50 mL contenant du PBS et transférez-le dans un cabinet de biosécurité.
  2. Transférez le tissu synovial dans une boîte de Petri contenant 75 % d’éthanol et immergez pendant 30 secondes pour désinfection.
  3. Retirez le tissu adipeux et osseux du tissu synovial à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles et de pinces, puis transférez le tissu restant dans une nouvelle boîte de culture.
  4. Lavez le tissu synovial obtenu 3 fois avec du PBS contenant 10 % de pénicilline/streptomycine.

2. Digestion du tissu synovial

REMARQUE : Utilisez la trypsine pour perturber les jonctions cellulaires et la matrice extracellulaire au sein du tissu synovial pour l’isolation ultérieure. Appliquer de la collagénase de type II pour dégrader sélectivement la structure de la matrice extracellulaire, facilitant ainsi la dissociation cellulaire de la matrice. Stériliser tous les ciseaux chirurgicaux, pinces et tamis cellulaires nécessaires à la dissection synoviale par autoclavage avant utilisation. Après la digestion, les fragments de tissu devraient sembler desserrés, avec des bords effilochés, et le milieu peut devenir légèrement trouble. Les tissus non digérés resteront compacts et opaques.

  1. Réduisez le tissu à plusieurs reprises avec des ciseaux en fragments de 1 mm × 1 mm.
  2. Ajoutez 0,25 % de trypsine au tissu et digérez à 37 °C dans un shaker à température constante (à 100-150 tr/min) ou dans un incubateur cellulaire pendant 30 minutes.
  3. Préparez une solution de sérum bovin fœtal à 10 % (FBS) à l’aide de solution saline tamponnée phosphate (PBS).
  4. Transférez le tissu dans des tubes centrifugeuses de 15 mL ou 50 mL selon la quantité de tissu, et neutralisez-le et digéréz-le avec du PBS contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS).
  5. Centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant et conservez la pastille.
  6. Résuspendez le projectile dans PBS.
  7. Centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant et conservez la pastille.
  8. Ajoutez 100 mg de collagénase de type II à 50 mL de milieu DMEM pour préparer une solution de collagénase de type II de 2 mg/mL.
  9. Filtrez la solution de collagénase de type II préparée à travers une membrane de 0,22 μm pour la stérilisation.
  10. Ajoutez 2 mg/mL de collagénase de type II et digérez dans un shaker à température constante à 37 °C (à 100-150 tr/min) ou dans un incubateur cellulaire pendant 4 heures.

3. Isolement et culture de synoviocytes de type fibroblaste

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures de culture cellulaire dans une armoire de biosécurité dans des conditions stériles et portez des gants stériles pour éviter toute contamination.

  1. Préparez un milieu DMEM complet en complétant le milieu basal DMEM avec 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine.
  2. Placez un passeur de cellules de 100 mailles sur une boîte de Petri stérile et versez le tissu synovial digéré et le liquide sur le passoire.
  3. Transférez la passoire cellulaire avec le tissu résiduel dans une autre boîte de Petri stérile.
  4. Broyez le tissu restant sur la tamoire à l’aide de l’extrémité d’une tige de sortie stérile de 20 mL jusqu’à ce qu’il ne reste que des restes blancs et fibreux, et qu’aucune suspension cellulaire supplémentaire ne puisse être exprimée.
  5. Rincez la passoire avec un volume approprié de médium DMEM complet.
  6. Collectez tous les filtrats, centrifugez (4 °C, 500 × g, 5 min), et jetez le surnageant.
  7. Résuspendez le pellet dans le PBS, centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
  8. Resuspendez les cellules dans un milieu DMEM complet.
  9. Effectuez le comptage cellulaire et transférez les cellules dans une fiole de culture.
  10. Incubez la fiole dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂).
  11. Remplacez le médium après 48 heures.
  12. Digérez les cellules avec la trypsine et le passage à un ratio de 1:3 lorsqu’elles atteignent la confluence complète.

4. Identifier RA-FLS en utilisant la coloration immunofluorescence à la vimentine

REMARQUE : Préchauffez la solution PBS utilisée pour le lavage des cellules dans un bain-marie réglée à 37 °C. Tous les volumes de réactifs spécifiés dans cette section sont standardisés pour un format de plaque à 48 puits. Les volumes doivent être dimensionnés proportionnellement en fonction de la surface de croissance lors de l’utilisation de plaques d’un autre format.

  1. Digérez les cellules avec la trypsine, remettez les cellules prélevées, puis diluez à 1 × 104 cellules/L à l’aide d’un milieu DMEM complet.
  2. Semez RA-FLS dans une plaque de 48 puits à 200 μL par puits.
  3. Placez dans un incubateur de culture cellulaire (37 °C, 5 % CO₂) et incubez pendant 24 heures.
  4. Jetez le substrat et lavez les cellules trois fois avec du PBS préchauffé.
  5. Ajoutez 4 % de paraformaldéhyde pour fixer les cellules pendant 10 minutes, jetez le fixateur, puis lavez trois fois avec du PBS.
  6. Préparez 150 μL de solution Triton X-100 à 0,1 % dans PBS par puits. Assurez-vous de mélanger complètement par vortex ou une inversion douce avant utilisation.
  7. Ajoutez une solution Triton X-100 à 0,1 % dans les puits et incubez pendant 10 minutes pour perméabiliser les cellules.
  8. Jetez la solution Triton X-100 à 0,1 % et lavez trois fois avec du PBS.
  9. Ajoutez 150 μL de solution de blocage sans animaux par puits, incubez à température ambiante pendant 1 heure.
  10. Écartez la solution de blocage. Ajoutez 150 μL de solution active primaire par anticorps de vimentine (diluée 1:200 en diluant anticorps) à chaque puits.
  11. Incubez avec un anticorps primaire à 4 °C pendant la nuit.
  12. Éliminez l’anticorps primaire et lavez les cellules cinq fois avec du PBS.
  13. Ajoutez 150 μL d’anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488 (dilué à 1:50 dans un diluant universel d’anticorps) par puits, et incubez à 37 °C pendant 1 heure protégé de la lumière.
  14. Éliminez l’anticorps secondaire et lavez les cellules trois fois avec du PBS.
  15. Ajoutez une goutte de substrat antidécolorant contenant du DAPI par puits, et laissez sécher pendant 10 minutes dans le noir.
  16. Observez et capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif de 20× et de filtres appropriés pour DAPI et FITC/GFP.
    REMARQUE : Lavez les cellules avec du PBS en remplissant complètement les puits avec du PBS, en les incubant pendant 5 minutes, puis en retirant le PBS. Cette procédure consiste en un seul cycle de lavage.

5. Quantifier RA-FLS et évaluer la pureté à l’aide de la cytométrie en flux

REMARQUE : Utilisez Vimentin et CD90 comme marqueurs positifs pour identifier RA-FLS, tout en administrant CD68, CD14 et CD11b comme contrôles négatifs pour exclure une contamination par les cellules immunitaires. La vimentine agit comme une protéine intermédiaire filamentaire spécifique intracellulaire, principalement localisée dans le cytoplasme de RA-FLS. CD90 agit comme un marqueur de surface critique, fortement exprimé sur RA-FLS, permettant leur distinction avec les cellules immunitaires. Bien que CD68, CD14 et CD11b soient spécifiquement exprimés dans les macrophages, les monocytes et les cellules myéloïdes, ils sont utilisés comme marqueurs négatifs pour exclure la contamination par les cellules immunitaires. Attribuer des fluorochromes aux marqueurs de surface cellulaire en fonction de leur spécificité de liaison, et veiller à ne pas chevaucher les canaux de fluorescence. Par exemple, dans cette expérience, CD90 et CD68 partagent le même fluorochrome ; par conséquent, ne les ajoutez pas au même tube centrifugeuse. Avant d’incuber avec l’anticorps à la vimentine, ajoutez des agents de fixation et de perméabilisation pour perturber la membrane cellulaire. Si le cytomètre en flux dispose de canaux fluorescents suffisants, des marqueurs tels que CD90 et CD68 peuvent être attribués à différents canaux pour une analyse simultanée multicolore afin d’améliorer davantage l’efficacité de la détection et le contenu en information.

  1. Digérer la RA-FLS de troisième génération en utilisant la trypsine sans EDTA.
  2. Terminez la digestion avec un milieu DMEM complet, centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
  3. Resuspendez la pelote dans le PBS, effectuez le comptage des cellules, puis ajustez la concentration cellulaire à 1 × 10⁶ cellules/mL à l’aide du PBS.
  4. Répartir les cellules dans trois tubes centrifugeuses, en ajoutant 200 μL de suspension de cellules à chaque tube.
  5. Ajouter l’anticorps CD11b (dilué 1:100 dans un diluant universel d’anticorps) à un volume final de 100 μL dans le tube 1. Vortex à mélanger.
    1. Après 15 minutes d’incubation, ajoutez 1 mL d’agent de fixation/perméabilisation au tube 1, le vortex pour mélanger, et étouffez pendant 30 minutes à l’abri de la lumière.
    2. Ajoutez 1 mL de tampon de fixation/perméabilisation au tube 1 pour terminer la perméabilisation, le vortex pour mélanger, centrifugez (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
    3. Préparer 100 μL de vimentine et du cocktail d’anticorps CD68 (chacun dilué 1:100 dans un diluant universel à anticorps), ajouter au tube 1, mélanger dans un vortex, et incuber à l’abri de la lumière pendant 30 minutes.
    4. Ajoutez 1 mL de tampon de fixation/perméabilisation au tube 1, le vortex pour mélanger, centrifugez (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
    5. Ajoutez 100 μL d’anticorps secondaire IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488 (dilué à 1:50 dans un diluant universel à anticorps) dans le tube 1. Vortex pour mélanger et incuber protégé de la lumière pendant 30 minutes.
    6. Ajoutez 1 mL de tampon au tube 1, le vortex pour mélanger, centrifugez (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
    7. Ajoutez 300 μL de tampon au tube 1, et un vortex pour mélanger pour l’échantillon de chargement.
  6. Ajouter les anticorps CD90 et CD14 (chacun dilué à 1:100 dans un diluant universel d’anticorps) dans le tube 2 pour un volume final de 100 μL. Laisser le tube 3 sans anticorps comme témoin négatif.
    1. Après 15 minutes d’incubation, ajoutez 1 mL de PBS aux tubes 2 et 3.
    2. Les tubes centrifugeuses 2 et 3 (4 °C, 500 × g, 5 min) éliminent le surnageant, ajoutent 300 μL de tampon et ferment un vortex pour mélanger l’échantillon de chargement.
  7. Effectuer l’acquisition par cytométrie en flux des échantillons préparés.
  8. Analysez les données de cytométrie en flux et effectuez des statistiques à l’aide d’un logiciel compatible.

6. Mesure de la prolifération de RA-FLS induite par le TNF-α à l’aide du test MTS

  1. Digérer la RA-FLS de troisième génération en utilisant la trypsine sans EDTA.
  2. Terminez la digestion avec un milieu DMEM complet, centrifugeuse (4 °C, 500 × g, 5 min), puis jetez le surnageant.
  3. Resuspendez le pellet dans un milieu DMEM complet, effectuez le comptage cellulaire, puis diluez à 1 × 10⁵ cellules/L.
  4. Semez les cellules en suspension dans une plaque de 96 puits à 100 μL par puits.
  5. Incubez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire jusqu’à ce que l’adhésion cellulaire se produise, puis divisez-la en groupes témoins et d’intervention vierges.
  6. Ajouter 10 ng/mL de TNF-α au groupe d’intervention et un volume égal de PBS au groupe témoin vide.
  7. Après 24 heures d’intervention, ajoutez 10 μL de réactif MTS à chaque puits et poursuivez l’incubation dans l’incubateur de cultures cellulaires.
  8. Après 1 heure d’incubation, mesurez l’absorbance (OD) à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques.
  9. Calculez la viabilité de la prolifération cellulaire en fonction de la valeur OD de chaque puits.

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Résultats

Grâce au protocole, nous avons réussi à isoler des RA-FLS de culture à court terme dérivées du patient. Un schéma du flux de travail procédural est fourni (Figure 1). Sous microscopie optique, le RA-FLS présentait un phénotype morphologique prédominant de cellules polygonales en forme de fuseau et irrégulières. Les cellules présentaient une expansion cytoplasmique étendue avec des processus allongés. Les bordures cellulaires apparaissaient légèrement indisti...

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Discussion

Ce protocole établit une méthode reproductible pour l’isolement et la culture à court terme de la RA-FLS chez les patients atteints de PR, dont le succès est attesté par une forte viabilité cellulaire, un phénotype caractéristique, une expression de marqueurs spécifiques et une réactivité fonctionnelle aux stimuli inflammatoires.

Étapes cruciales et considérations techniques
La fiabilité de cette méthode repose sur plusieurs étapes critique...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne signalent aucun conflit d’intérêts dans ce travail et confirment que l’utilisation de Figdraw pour générer la Figure 1 respecte les conditions de licence de la plateforme.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 82074223 et 8207141673) et par le projet clé au niveau du gouvernement central : l’établissement d’une utilisation durable des ressources précieuses de la médecine chinoise (n° 2060302).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
IgG anti-lapin conjugué Alexa Fluor 488Zhongshan Jingqiao BiotechnologieZF-0511
0,25 % de trypsine-EDTA (1X)Gibco25200-072
4 % de paraformaldéhydeSolarbioP1110
Alexa Flour674 anti-humain CD68biolegend562111
Solution de blocage sans animauxTechnologie de signalisation cellulaire15019
APC anti-humain CD90biolegend559869
BD FACSDiva Logiciel 8.0.2BD Biosciences657925
BD LSRFortessaBD Biosciences647177
BV605 anti-humain CD11bBidegend563015
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Astest (MTS)PromegaG358A
Colaganase IISolarbioC8150
Milieu de montage fluorescent contenant du DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
Milieu de montage fluorescent contenant du DAPIZhongshan Jingqiao BiotechnologieZLI-9556
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), glycémie élevéeHyCloneSH30022.01
Sérum bovin fœtal-Superfin (FBS)Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.ZQ0500
FITC anti-humain CD14biolegend325604
PBS, 1 et horaires ; (pH 7,4) Solution physiologique tamponnée au phosphateServicebioG4202
Solution mixte de pénicilline-streptycine (double antibiotique) 100 fois ;Shanghai Zhongqiao Xindan Biotechnology Co., Ltd.CSP006
Tampon universel QuickBlock pour les protéines et dilution des anticorpsBeyotimeP0270-500ml
TNF et alpha humains recombinants ;Peprotech300-01A
Coloration par facteur de transcription BuffeeBioscience00-5523-00
Triton X-100SolarbioT8200
Solution de trypsine (sans EDTA)Beijing Labgic Technology Co., Ltd.BL526A

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