Article de revue

Méthodes pour élucider les mécanismes des maladies dans les troubles neurodéveloppementaux

DOI :

10.3791/70127

⸱

6 février 2026

 , 
1Department of Neurology, University of Maryland School of Medicine

Dans cet article

Résumé

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Les options de traitement modifiant la maladie pour les personnes vivant avec des troubles neurodéveloppementaux sont limitées, et il n’existe pas de remèdes. Pour y remédier, des efforts sont nécessaires pour définir les mécanismes de la maladie et de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans cette revue, nous détaillons plusieurs techniques qui sont à l’avant-garde dans ces efforts.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) touchent 317 millions d’enfants et de jeunes dans le monde. Bien que les troubles de la NDD soient un groupe diversifié de troubles affectant plusieurs systèmes d’organes, l’épilepsie, le trouble du spectre autistique (TSA) et/ou la déficience intellectuelle (DI) sont des issues courantes. Malheureusement, il existe peu de thérapies modifiantes de la maladie et aucun remède pour les NDD. Cependant, récemment, l’édition génétique, les tests cellulaires/moléculaires et les modèles de cellules souches sont apparus comme des techniques prometteuses pour comprendre en profondeur les causes profondes des NDD, catégoriser les variants génétiques et modéliser plus précisément les processus pathologiques humains. De plus, plusieurs techniques, en particulier l’édition génétique, ont déjà rencontré un succès clinique. Dans cette revue, nous détaillons plusieurs méthodes novatrices pour valider fonctionnellement des variants génétiques, des modèles de cellules souches des NDD, ainsi que des approches novatrices d’édition génétique. Comprendre et appliquer ces méthodes est crucial pour découvrir de nouveaux mécanismes pathologiques et cibles thérapeutiques pour les NDD, ainsi que pour faire progresser les approches techniques du laboratoire à la clinique.

Introduction

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Les troubles neurodéveloppementaux (NDD) touchent 317 millions d’enfants et de jeunes dans lemonde 1. Ces troubles peuvent inclure la paralysie cérébrale, le syndrome de l’X fragile, le syndrome d’Angelman et la sclérose tubéreuse complexe, entre autres. Bien que les NDD soient un groupe diversifié de troubles affectant plusieurs systèmes d’organes, l’épilepsie, le trouble du spectre autistique (TSA) et/ou la déficience intellectuelle (DI) sont des issuesfréquentes 2. En effet, une étude a rapporté que des enfants au Kenya atteints d’épilepsie et de troubles cognitifs, de la vision, de l’audition ou des troubles moteurs mouraient à un taux de 3 à 4 fois supérieur à celui de ceux du groupe1 non-NDD.

Un changement de paradigme pour l’étude des NDD s’est produit avec l’achèvement du projet du génome humain en 2003. Des progrès supplémentaires ont été réalisés en définissant les scores de risque polygénique via GWAS, et en caractérisant les « troubles neurodéveloppementaux » par le DSM-5 en 2013. Bien qu’il existe des progrès significatifs dans la compréhension des causes génétiques des NDD, peu de thérapies ciblées existent pour des NDD spécifiques, et il n’existe pas de thérapies modifiant la maladie pour le TSA et/ou la DI qui leur sont associés.

Les tests et méthodes d’édition génétique, électrophysiologiques et cellulaires/moléculaires ainsi que les méthodes décrits dans cette revue sont à la pointe de la recherche sur les NDD. Bien que nous n’ayons pas couvert de manière exhaustive tous les tests, ces méthodes représentent des approches de pointe pour identifier des thérapies modifiant la maladie. Un exemple, les enzymes déubiquitylantes (DUB), est un groupe d’enzymes qui éliminent l’ubiquitine des protéines. Parce que les mutations au sein des DUB sont liées aux NDD, cibler leur modification pourrait être une thérapie potentielle pour les NDD 5,6. De plus, des voies au niveau des circuits, telles que celles impliquant la sous-unité du récepteurGABA A, et d’autres canalopathies sont en cours d’investigation pour définir les mécanismes de la maladie associés à l’épilepsie, au TSA et à l’ID7. Une autre méthode marquante, l’édition génomique CRISPR/Cas (Figure 1), est un outil puissant utilisé pour modifier directement le génome afin de créer de nouveaux modèles expérimentaux et, récemment, traiter des maladies génétiquesrares 8,9,10. La boîte à outils CRISPR continue de s’élargir, et quatre approches, dont CRISPRi (CRISPR Interference/Inhibition), CRISPRa (activation CRISPR), prime editing et base editing, se sont imposées comme des innovations de recherche et cliniques à impact majeure. Enfin, cet article détaille les avancées dans l’utilisation des cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Les iPSC, ainsi que leurs dérivations cellulaires, ont permis aux chercheurs de modéliser plus précisément de nombreux NDD à partir de cellules dérivées despatients 9,11,12. Il est important de noter que le développement des organoïdes à partir des iPSC a permis l’étude du processus de développement sous-jacent de nombreux NDD d’une manière bien plus pertinente pour les maladies humaines que les modèles derongeurs 13,14.

Cette brève critique détaille et développe les techniques introduites ci-dessus. De plus, plusieurs études récentes utilisant ces techniques pour mieux comprendre les NDD, les écarts dans la littérature actuelle et les orientations futures sont discutées.

Revue et perspective

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Cellules souches pluripotentes induites et paradigmes expérimentaux associés

Les cellules souches pluripotentes induites sont apparues comme un système puissant pour modéliser les NDD. En effet, de nombreux processus développementaux se produisent dans les modèles iPSC similaires à ceux observés lors du développement du cerveau humain et qui ne se produisent pas lors du développement cérébral chezles rongeurs 15. Par conséquent, les chercheurs ont couplé des modèles de cellules souches, y compris des cultures 2D, des organoïdes et des assembloïdes, à d’autres méthodes expérimentales pour mieux comprendre les mécanismes de la maladie chez les NDD 11,13,14,16.

Récemment, des assembloïdes ont été utilisés pour modéliser une caractéristique clé de la neurogenèse altérée de la trisomie 21 (DS) lors du développementfœtal 16. En utilisant à la fois des hiPSC DS et des hiPSC euploïdes isogènes, la neurogenèse a été induite, suivie d’une différenciation en neurones. Après 85 jours, l’immunocytochimie et l’imagerie ont été utilisées pour observer le cycle cellulaire. Ils ont observé que les cellules progénitrices neuronales de la DS ne sortaient pas du cycle cellulaire et étaient incapables de se différencier en neurones matures, et ont également constaté que les défauts du cycle cellulaire modifient la phase neurogénique, provoquant une neurogenèse altérée chez DS16.

Alors que de nombreux modèles de cellules souches se sont concentrés sur les neurones, d’autres types cellulaires, y compris les cellules gliales, jouent un rôle important dans la pathologie desNDD 17. Un rapport récent s’est concentré sur le rôle de la gliogenèse et des astrocytes dans le syndrome de l’X fragile (SFX). À l’aide de hiPSC, les cellules progénitrices des astrocytes ont été cultivées et différenciées en astrocytes spécifiques au cerveau antérieur dépourvus de la protéine ribonucléaire messagere de l’Xfragile 11. Ils ont observé que ces astrocytes présentaient un métabolisme glycolytique et mitochondrial déréglé. Des travaux antérieurs de la même équipe ont également démontré que le bon fonctionnement des mitochondries est nécessaire pour contrôler l’activation du potentiel d’action dans les neurones dérivés de patients atteints deFXS 11,18. Bien que davantage de travaux soient nécessaires pour comprendre le mécanisme par lequel le métabolisme des astrocytes et la libération des neurones sont modifiés dans le FXS, ces études démontrent que les astrocytes peuvent à la fois stimuler la pathologie de la maladie et être une cible thérapeutique.

Édition du génome

Francisco Mojica a jeté les bases de l’édition du génome avec la découverte de CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats), un système immunitaire adaptatif pour les procaryotes, au début des années1990. S’appuyant sur cette base, Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier ont été pionnières dans une méthode appelée CRISPR/Cas9 qui exploite CRISPR couplé à l’endonucléase Cas9 pour isoler et modifier sélectivement lesgènes 20. Peu de temps après la publication des premières études d’édition génétique CRISPR/Cas9, les chercheurs ont commencé à manipuler le système CRISPR/Cas pour révéler de nouvelles informations génomiques ou modifier les gènes de manière unique. Une méthode novatrice est CRISPRi – une méthode pour faire taire un gèned’intérêt 21,22. En utilisant une nucléase Cas9 catalytiquement inactive en conjonction avec les cr- et tracr-ARN, l’accès de l’ARN polymérase au promoteur est obstrué, désactivant l’expression génique d’un gène spécifique ou d’un ensemble degènes 22,23. Les criblages CRISPRi ont été utilisés pour identifier plusieurs gènes de risque pour les NDD ainsi que pour identifier les modifications fonctionnelles associées à la perte de fonction dans ces gènes. Par exemple, un dépistage récent de CRISPRi sur des assembloïdes dérivés de l’iPSC a testé 425 gènes NDD pour leur impact sur le développement interneuronal et a révélé que la perte de plusieurs gènes candidats affectait la structure du réticulum cytosquelettiqueet endoplasmique 24. De plus, un dépistage CRISPRi a révélé que la perte d’ADNP, un gène de risque TSA, entraînait des modifications de la taille microgliale dessynapses 25. Ainsi, les criblages CRISPRi ont révélé plusieurs mécanismes de maladie convergents et divergents dans la NDD.

Complémentaire à CRISPRi, CRISPRa est un outil utilisé pour augmenter l’expression génique. Cette technique associe un Cas9 catalytique inactif à des activateurs transcriptionnels et est ciblée par un ARN guide. CRISPRa a également été utilisé pour comprendre comment l’activation des gènes de TSA et de risque de NDD peut modifier les phénotypes de la maladie. Bien qu’il existe peu d’études utilisant CRISPRa pour sauver les phénotypes de la NDD, CRISPRa pourrait avoir un grand potentiel thérapeutique. Par exemple, une étude récente a démontré que l’activation de l’ITGB3 (dont l’haploinsuffisance est associée au TSA) sauvait la fonction du réseau et les phénotypes du TSA chezles rongeurs 23. En effet, de nombreux variants du gène NDD provoquent une maladie due à l’haploinsuffisance, ce qui soulève la possibilité que CRISPRa puisse être utilisé pour augmenter l’expression de l’allèle non affecté de manière modifiante de la maladie.

L’édition de bases et l’édition de base sont des méthodes précises au sein de la boîte à outils CRISPR pour modifier des nucléotides spécifiques du génome. Les deux clivent un brin simple d’ADN plutôt qu’une rupture à double brin (DSB) comme CRISPR/Cas910,26. Bien que le montage de base soit plus spécifique que le montage standard CRISPR/Cas9, il est moins adaptable et donc moins pertinent sur le plan de traduction que le montage principal. L’efficacité de l’édition des bases réside dans sa capacité à corriger les mutations ponctuelles en substituant la cytosine à la thymine ou l’adénine à la guanine, et inversement10. De ce fait, le montage de base est limité quant aux types de mutations qu’il peut produire. Ainsi, bien que pratique, seules les mutations de transition peuvent être exécutées, pas les insertions ou délétions10. Cependant, l’édition de premiers est une forme d’édition génomique très adaptable, avec de nombreuses applications possibles. Le montage principal exploite un ARN guide d’édition primaire (pegRNA) et une nickase Cas9 couplée à la transcriptase inverse qui peut faciliter les insertions, délétions ou modifications de nucléotidessimples 10. Malheureusement, parce qu’il est plus techniquement complexe et peut réaliser des altérations génétiques plus importantes, l’édition primaire peut être moins efficace que l’édition de base. Par conséquent, les deux peuvent être utilisés comme outils complémentaires et sont utiles dans l’édition génomique des troubles neurodéveloppementaux. Le montage de premier ordre a déjà été utilisé pour traiter un patient atteint d’une maladie génétiquerare 27 et a montré des promesses pour sauver les phénotypes de maladies dans un modèle rongeur d’hémiplégie alternée chezl’enfant 28.

Analyses cellulaires et moléculaires

Les NDD sont causés par des variants génétiques qui affectent la fonction cellulaire de différentesmanières 29,30,31. Un défi majeur auquel sont confrontés ceux qui étudient les NDD est de déterminer si une variante spécifique du patient provoque ou non un changement fonctionnel délétère de la cellule. Ainsi, il existe un grand besoin d’analyses capables de déterminer rapidement et précisément si un variant génétique spécifique est responsable de la maladie ou bénin. Un nouveau test prometteur est le test de clivageà l’ubiquitine 32. Les enzymes déubiquitylantes (DUB) sont un groupe d’enzymes qui éliminent l’ubiquitine des protéines, empêchant ainsi la dégradation. Les DUB sont à la fois des traitements potentiels et des causes des troubles de la naissance. Jusqu’à présent, des mutations dans 12 DUB ont été identifiées comme liées causalement aux NDD, notamment le syndrome de Hao-Fountain, le pseudo-TORCH, le syndrome de microcéphalie-malformation capillaire, etd’autres 5. Pour déterminer si des variants spécifiques chez les patients sont responsables de la maladie, les tests de clivage ubiquitine in vitro sont devenus la référence pour mesurer l’activité enzymatique DUB afin de valider fonctionnellement les mutations. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’effet des variants génétiques sur les DUB. Une étude récente s’est concentrée sur un DUB muté dans la déficience intellectuelle liée à l’X 105, la protéase spécifique DUB Ubiquitin Specific 27 (USP27X). Les chercheurs ont démontré avec succès une méthode d’expression et de purification du recombinant USP27X ainsi qu’un test de clivage en chaîne d’ubiquitine in vitro. Cette approche permet de déterminer l’activité enzymatique qui régule le renouvellement des protéines dans les neurones et, par conséquent, peut être importante pour comprendre les mécanismes sous-jacents à la taille synaptique modifiée, aux périodes critiques neurodéveloppementales et à la fonctiondes protéines 32. Fait intriguant, il existe une rareté d’articles publiés sur les DUB et leur rôle dans les maladies, et par conséquent, l’étendue complète de l’applicabilité de ce test reste non testée et ouverte à d’autres investigations.

Parce que de nombreux NDD sont également classés comme des troubles rares, la vérification génétique clinique des variants identifie fréquemment les changements génétiques comme des « variants de signification inconnue » (VUS) en raison de l’absence d’études cliniques ou fonctionnelles publiées antérieures surces variants 7,33,34. Ainsi, des tests permettant de déterminer rapidement si un VUS est pathogène sont cruciaux pour déterminer les causes génétiques des NDD. Un exemple est les variantes des récepteursGABA A. Les variantes génétiques du récepteurGABA A sont une cause majeure d’épilepsie génétique et sont associées à de nombreux types de crises et à des encéphalopathies épileptiquesdéveloppementales 7,35. Une étude récente a étudié les sous-unités du récepteurGABA A et a tenté d’identifier si ces variants provoquaient des changements fonctionnels au sein de la cellule en utilisant une approche multimodale. Des tests in silico ont été utilisés pour identifier le VUS et prédire les variations pathogènes de la sous-unité γ2 GABAA. Les conséquences moléculaires des variants ont alors été définies et ont inclus des marqueurs structurels, physicochimiques etbiophysiques 7. Chacun de ces domaines a été défini par analyse littéraire, modélisation in silico et électrophysiologie par patch-clamp. Une fois une région de référence sélectionnée, la modélisation neuronale pyramidale a été utilisée pour tester les effets de l’inhibition médiée par le récepteurGABA A. Ils ont observé que deux mutations ß3 de sous-unités (ß3N110D et ß3T288N) et deux mutations de sous-unités γ2 altèrent l’inhibitionGABAergique 7. Ce protocole démontre qu’une approche multimodale est souvent utile pour déterminer la pathogénicité de la VUS. Bien que ce n’est pas à haut débit, cette approche peut également être utile pour d’autres VUS associées aux NDD qui ne disposent pas d’un test spécifique pour valider fonctionnellement des variants (par exemple, les DUB) – en particulier s’ils sont associés à des changements électrophysiologiques.

Bien que ce ne soit pas une approche nouvelle, l’électrophysiologie par patch-clamp reste la référence pour comprendre les propriétés électriques des neurones, et donc comment les changements génétiques influencent également les propriétés fondamentales des neurones. Pertinentes pour les NDD sont les canalopathies36. Bien qu’il existe de nombreux types de canalopathies, les variantes de SCN1A ont été bien étudiées et constituent la principale cause du syndrome de Dravet – une encéphalopathie épileptique développementale particulièrementdévastatrice 36. La validation fonctionnelle des variantes de SCN1A a été réalisée à l’aide d’une approche combinatoire de simulations automatisées par patch-clamp et in silico. Grâce à cette approche, les chercheurs ont pu résoudre plusieurs EVV et établir des corrélations génotype-phénotype basées sur des changements fonctionnels desneurones 37. Dans une étude distincte utilisant une approche similaire, des modèles iPSC ont été utilisés avec l’électrophysiologie automatisée à pince patch-clamp et des modèles in silico pour classifier les variantes géniques dans les canaux calciques de typeT 38. En se concentrant sur CACNA1G, un gène codant pour Cav3.1 dans différents types de neurones, CACNA1G a été muté pour créer 18 variantes de Cav3.1 qui ont ensuite été transfectées de manière transitoire en neurones. Par la suite, des enregistrements automatisés du patch-clamp ont été réalisés, suivis d’approches manuelles du patch-clamp et de calcul. Ils ont observé que le patch-clamp automatisé et manuel donnaient des résultats similaires et que les approches computationnelles pouvaient déterminer les changements fonctionnels induits par des variants génétiques spécifiques38. Bien que les modèles computationnels offrent un moyen relativement rapide de prédire les conséquences fonctionnelles des variantes génétiques, les approches électrophysiologiques restent chronophages et nécessitent des compétences hautement spécialisées qui limitent l’utilité de ces approches lors de la validation d’un grand nombre de variants.

Les réseaux multi-électrodes (MEA) sont utilisés pour mesurer l’activité électrique autour de petits groupes ou à travers de grands réseaux de cellules. Cette méthode diffère de l’électrophysiologie par patch-clamp en ce qu’elle se concentre sur des modèles multicellulaires, tandis que le patch-clamp est centré sur un seul canal oucellule 39,40. De ce fait, les MEA peuvent fournir un éclairage sur la manière dont différentes régions cérébrales interagissent entre elles et peuvent être utilisées pour étudier la maladie à l’échelle du réseau. De nombreuses études ont utilisé les MEA pour étudier des modèles expérimentaux d’épilepsie et deTSA 14,39. Une caractéristique clé des MEA est qu’ils permettent de déterminer les différentes interactions entre les différents types de cellules neuronales (par exemple, neurones glutamatergiques, interneurones GABAergiques, progéniteurs et cellules gliales)14. Cela fait des MEA une excellente approche pour étudier les assembloïdes cérébraux. Une étude, réalisée par Pan et al., a utilisé cette méthode pour étudier le développement des réseaux neuronaux. Les auteurs ont utilisé des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) issues des fibroblastes14 du prépuce, qui ont d’abord été marqués viralement puis cultivés pour générer des assembloïdes. Ensuite, les assembloïdes ont été appliqués aux plaques MEA et enregistré14. Il est important de noter que, puisque les assembloïdes pouvaient être stabilisés, enregistrés et soumis à des expériences pharmacologiques pendant environ 50 jours, ce paradigme pourrait être utilisé pour analyser des médicaments thérapeutiques visant à traiter l’épilepsie associée aux NDD. En effet, cette approche pourrait être utilisée pour tester tout NDD dans lequel des changements dans les propriétés du réseau des neurones sont connus oususpectés 14.

Conclusions

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Les troubles de la NDT peuvent être des troubles dévastateurs et nécessitent peu de traitements ciblés et aucun traitement. En effet, la majorité des thérapies visent à gérer les symptômes de la maladie (par exemple, les médicaments antiépileptiques contre l’épilepsie). Cependant, les avancées technologiques récentes ont conduit à de nouvelles techniques d’édition génétique, des tests et des systèmes modèles permettant aux scientifiques d’interroger les causes profondes des NDD  (Figure 1). Cette revue a détaillé certaines approches à la pointe des efforts pour trouver de nouveaux traitements pour les NDD et les pathologies associées. Les techniques d’édition génétique permettront aux chercheurs de cibler directement les mutations afin de mieux comprendre les mécanismes de la maladie et, potentiellement, de traiter les patients par une thérapie génique de précision. De nouveaux essais permettent une classification fonctionnelle rapide des variants génétiques, et les modèles de cellules souches permettront aux scientifiques de comprendre les mécanismes précoces du développement qui alimentent les NDD ainsi que de tester de nouveaux traitements. Les techniques détaillées dans cette revue constituent la base sur laquelle de futures études peuvent être menées dans le but d’approfondir la compréhension des mécanismes des NDD, ainsi que de conduire à de nouvelles approches cliniques pour les traiter. À mesure que le domaine évolue, les études futures devraient intégrer des techniques telles que les tests prénataux, les thérapies fœtales, l’imagerie à haute teneur et la pharmacogénomique avec celles détaillées dans cette revue.

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Figure 1 : Résumé des forces et faiblesses clés des approches techniques. Les méthodes détaillées dans l’article et présentées dans les collections de méthodes complémentaires sont résumées. Un point fort et une faiblesse majeurs sont détaillés pour chaque technique. Une référence clé pour chaque technique est fournie sous la colonne de la méthode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

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Le financement a été fourni par NIH NINDS RO1NS131223 à PHI. La figure 1 a été préparée à l’aide de BioRender.

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