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Article de méthode

Évaluation de la réserve de flux coronarien dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée à l’aide d’une échocardiographie Doppler

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DOI :

10.3791/70135

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24 mars 2026

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1Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, Nanjing Drum Tower Hospital Clinical College of Nanjing Medical University, 2Department of Cardiology, Nanjing Drum Tower Hospital, The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School, MOE Key Laboratory of Model Animal for Disease Study, Nanjing University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une approche rapide et non invasive pour évaluer le dysfonctionnement microvasculaire coronarien dans un modèle murin d’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF). La réserve de flux coronarien (CFR) est déterminée par la localisation guidée par Doppler de l’artère coronaire gauche, calculée comme le rapport entre la vitesse de flux coronaire hyperémique et la vitesse de base du flux coronaire.

Résumé

L’insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) constitue un fardeau global important pour la santé et un défi clinique majeur en raison de l’absence de thérapies efficaces, et la physiopathologie sous-jacente reste insaisissable. Le dysfonctionnement microvasculaire coronarien (MCD), très répandu chez les patients atteints de FPF, déclenche une ischémie myocarde qui altère à la fois la fonction diastolique et systolique du ventricule gauche. Étant donné que le dysfonctionnement microvasculaire est une caractéristique centrale de la HFpEF, la DMC est désormais considérée comme un facteur important dans sa pathogenèse. La réserve de flux coronarien (CFR), définie comme le rapport entre la vitesse maximale hyperémique et la vitesse de flux sanguin au repos, est un marqueur très précieux de l’ischémie myocardique. De plus, il sert d’indicateur complet du dysfonctionnement vasomoteur coronarienne, mesurant les effets hémodynamiques combinés des artères coronaires épicardique et microvasculaire sur la perfusion myocardique. Ce protocole portait sur l’évaluation des changements de la CFR dans un modèle murin de la HFpEF à l’aide d’une échocardiographie Doppler. Dans cette étude, les souris témoins ont montré une augmentation supérieure à deux fois de la vitesse maximale du flux sanguin coronarien avec une vasodilatation induite par l’isoflurane par rapport aux valeurs au repos, tandis que cette réponse était significativement atténuée chez les souris HFpEF. Dans la HFpEF, une réduction du CFR prédit les conséquences indésirables et reflète un dysfonctionnement microvasculaire sous-jacent, la positionnant comme un outil clé pour étudier la progression de la maladie et guider la sélection des patients.

Introduction

L’insuffisance cardiaque (IC) avec fraction d’éjection préservée (HFpEF) a été la forme dominante d’IC et est associée à un mauvais pronostic. Cependant, aucun traitement prouvé n’existe pour réduire sa morbidité et sa mortalitéassociées 1,2. La présence de multiples facteurs de risque, notamment l’âge avancé, l’hypertension, le diabète, la dyslipidémie et l’obésité, sous-tend la complexité et l’hétérogénéité de la HFpEF3. Ces dernières années, des preuves accumulées ont montré que le dysfonctionnement microvasculaire coronarien (MCD) est un facteur de risque indépendant et direct pour la FPF, plutôt qu’unecomorbidité 4,5,6. Le dysfonctionnement microvasculaire coronarien, impliquant à la fois des anomalies fonctionnelles et structurelles, sous-tend l’ischémie sous-endocardique, la mucoviscidosse interstitielle diffuse et la dysfonction du ventricule gauche dans la HFpEF 7,8. Des recherches approfondies ont été menées sur le rôle pathologique de la DMC dans les maladies cardiovasculaires 9,10. Une étude clinique a montré que le dysfonctionnement microvasculaire (attesté par une CFR altérée <2,0) est directement associé à une fonction diastolique du ventricule gauche inférieure et pourrait être une cible thérapeutique prometteuse dans la HFpEF11. L’évaluation échocardiographique dans l’étude PROMIS-HFpEF (PROMIS-HFpEF) a révélé que 75 % des patients atteints de CMD étaient atteints de CMD, sur la base des mesures du CFR dans l’artèrecoronaire gauche 12. De plus, la CMD anormale était corrélée à un risque accru de conséquences indésirables, y compris un risque de mortalité significativementaccru 13,14. Par conséquent, l’utilisation de la DMC comme biomarqueur clé dans les modèles animaux facilite grandement l’investigation de la physiopathologie de la HFpEF et aide à valider la réplication réussie du phénotype de la maladie.

Actuellement, les méthodes d’évaluation de la fonction microvasculaire coronarienne, telles que la tomographie par émission de positrons (TEP), la résonance magnétique cardiovasculaire (CMR), la réserve fractionnaire de flux (FFR) et l’indice de résistance microcirculatoire (IMR), sont difficiles à appliquer dans les études sur les rongeurs en raison de la petite taille des animaux et de la disponibilité limitée de matériel d’imagerie dédié. La réserve de flux coronarien (CFR) est recommandée par les directives internationales comme outil pour interroger la physiologiecoronarienne 15,16. De plus, le CFR sert de marqueur fiable de l’ischémie cardiaque, d’indicateur de dysfonction vasculaire coronarienne et d’indicateur pronostique précieux du risquecardiovasculaire 17. L’échocardiographie Doppler pour l’évaluation de la CFR est une méthode validée et reproductible pour évaluer la fonction vasculaire coronaire globale dans des modèles précliniques chez les rongeurs. Bien que des études antérieures aient rapporté l’utilisation de la CFR dans des modèles souris/rats de lésions ischémiales-réperfusionmyocardique 18,19, elle n’a jamais été appliquée sur des modèles animaux de HFpEF. De plus, la méthode d’évaluation CFR décrite dans cette étude, qui localise rapidement l’ACL grâce à l’échocardiographie Doppler colorée, peut être étendue à une gamme de modèles animaux, notamment ceux de la cardiomyopathie diabétique, des maladies cardiaques hypertendues et des troubles inflammatoires ou auto-immuns chroniques. Dans la présente étude, étant donné l’absence de sténose coronarienne épicardique dans le modèle murin, la réduction de la réserve de flux coronarien (CFR) reflète principalement un dysfonctionnement microvasculaire coronarien plutôt que des contributions combinées épicardique et microvasculaire. Ainsi, le CFR sert de marqueur substitutif fiable pour la CMD dans ce modèle HFpEF.

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Protocole

Toutes les procédures ont respecté les protocoles approuvés par le Comité d’éthique institutionnelle de l’hôpital Drum Tower de Nankin (Approbation n° 20011141) et ont respecté les directives Recherche animale : Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE) 20. Dans cette étude, le modèle HFpEF a été établi chez des souris mâles C57BL/6J âgés de six à huit semaines (BW, ~25 g). Tout au long de la durée expérimentale, les souris ont été logées dans une pièce sans agents pathogènes spécifiques (SPF) sous des conditions contrôlées de température (23 ± 1 °C), d’humidité (65 %–70 %) et d’un cycle clair/obscur de 12 heures. Tous les animaux avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Après l’étude, les souris ont été anesthésiées avec 1,5 % d’isoflurane et euthanasiées par luxation cervicale. Les réactifs et équipements utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Établissement du modèle souris HFpEF

  1. Répartissez aléatoirement les souris en deux groupes : un groupe témoin (CTRL) et un groupe HFpEF, avec huit souris chacun.
  2. Employons un protocoleétabli 21,22,23,24,25 pour induire le modèle souris HFpEF comme suit :
    1. Nourrissez les souris de six à huit semaines avec un régime riche en graisses (HCD, 60 % de matières grasses) et fournissez 0,5 g/L d’ester méthyle N-nitro-L-arginine (L-NAME) dissous dans de l’eau potable pendant 8 semaines.
      REMARQUE : Préparez de l’eau L-NAME dans des bouteilles brunes pour éviter l’exposition à la lumière et rafraîchissez tous les 2 à 3 jours.
  3. Nourrissez des souris correspondant à leur âge avec un régime normal standard et fournissez de l’eau potable régulière pendant la même durée que le groupe témoin.

2. Évaluation de la réserve de flux coronarien par échocardiographie

  1. Précéder l’évaluation échocardiographique en anesthésiant la souris par inhalation d’isoflurane vaporisé à 1,5 % administré à 1,5 à 2,0 L/min avec un débit d’O₂ de 100 % dans une chambre d’anesthésie.
    ATTENTION : L’isoflurane est un anesthésique volatil. Assurez-vous d’une ventilation adéquate pendant le fonctionnement. Portez des gants en nitrile lorsque vous ajoutez de l’isoflurane liquide au vaporisateur pour éviter le contact avec la peau.
  2. Confirmez l’absence de réaction au pincement cutané et à la stimulation des orteils ou de la queue, puis positionnez l’animal couché sur la plateforme d’imagerie.
  3. Transférez la machine d’anesthésie gazeuse de la chambre à la délivrance du masque et maintenez une concentration anesthésique constante de 1,5 % tout au long de la procédure.
  4. Acquérir des données physiologiques (ECG et respiration) en appliquant un gel conducteur sur la feuille de cuivre (électrodes ECG) de la plateforme d’imagerie et en scotchant les quatre pattes dessus.
    REMARQUE : Maintenez l’isoflurane à 1,5 % pour l’entretien et maintenez la température corporelle centrale proche de 37 °C à l’aide de la plateforme de réchauffement intégrée. Maintenir un taux respiratoire cible de 100 à 140 respirations par minute pour assurer la stabilité physiologique lors de l’imagerie.
  5. Enlever les poils de poitrine en appliquant une crème dépilatoire avec un applicateur à extrémité de coton.
  6. Essuyez l’excès de crème et les poils lâches avec une gaze imbibée d’eau pour préparer l’imagerie.
    REMARQUE : Retirez complètement les résidus de crème dépilatoire pour éviter les irritations ou la toxicité cutanée.
  7. Appliquez une pommade ophtalmique lubrifiante stérile sur les deux yeux pour éviter le dessèchement scléraire.
  8. Appliquez du gel de transmission ultrasonore sur la zone antérieure du cœur et positionnez la plateforme d’imagerie à un angle d’environ 30°–45° par rapport à l’horizontale.
    REMARQUE : Évitez les bulles d’air dans le gel à ultrasons.
  9. Placez lentement le transducteur à ultrasons haute fréquence sur la ligne parasternale et alignez-le parallèlement au thorax pour obtenir la vue ajustée de l’axe long parasternal (PLAX) du ventricule gauche (Figure 1A).
  10. Inclinez la sonde pour assurer un contact léger avec la paroi thoracique, évitant ainsi la compression.
  11. Appuyez sur le bouton Mode Lumineux pour passer à l’imagerie en mode luminosité.
  12. Ajustez l’angle de la sonde et de la plateforme d’imagerie pour localiser l’artère coronaire gauche (ACL).
    REMARQUE : Identifier le ventricule gauche (VV), l’oreillette gauche (LA), la paroi antérieure du ventricule gauche (LVAW), la paroi postérieure du ventricule gauche (LVPW), le septum interventriculaire (IVS), l’aorte (AO), l’artère pulmonaire (PA), la veine pulmonaire (PV), la valve mitrale (MV) et le muscle papillaire dans la fenêtre acoustique.
  13. Activez le mode Doppler couleur en appuyant sur le bouton Doppler couleur sur l’écran tactile. En affichage en temps réel, le flux s’éloignant de la valve aortique (vers la sonde) apparaît en rouge.
  14. Ajustez l’angle et la position de la sonde pour visualiser l’ACL complet du sinus aortique jusqu’au site de la branche distale tout en minimisant l’interférence du flux nerveux pulmonaire.
  15. Activez le mode Doppler à onde impulsionnelle (PW). Positionnez la fenêtre de mesure du poids de la plume parallèle à la direction du flux sanguin de l’ACL (Figure 1B,C).
    REMARQUE : Maintenez l’angle d’insonation en dessous de 60° et appliquez une correction d’angle en temps réel en alignant le curseur Doppler parallèlement au flux coronaire.
  16. Sélectionnez Enregistrer le clip pour capturer la forme d’onde de la vitesse d’écoulement LCA de base.
  17. Augmentez la concentration d’isoflurane à 3 % et observez l’augmentation progressive de la vitesse du flux coronaire.
  18. Après 45 s d’exposition continue à 3 % d’isoflurane, sélectionnez Enregistrer le clip pour capturer la vitesse du flux coronaire hyperémique.
    REMARQUE : Surveillez en continu le flux sanguin de l’ACL. Si le volume de l’échantillon de la lettre de la main dérive en raison d’un mouvement respiratoire ou cardiaque, pause l’acquisition, retour en mode Doppler couleur pour réidentifier la LCA, repositionner la porte de la porte de la pièce et reprendre le mode de la ligne de travail.
  19. Une fois terminé, arrêtez l’inhalation d’isoflurane et retirez le gel à ultrasons. Placez la souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement, puis remettez-la dans sa cage.

3. Analyse statistique

  1. Mesures moyennes de trois cycles cardiaques consécutifs suivies dans le logiciel d’analyse pour obtenir les vitesses de flux de référence et de pointe de l’ACL. Calculez le CFR comme le rapport entre la vitesse de flux coronaire diastolique hyperémique maximale et la vitesse de flux coronaire diastolique maximale de base (CFV).
  2. Mettre en œuvre une conception en double aveugle entre l’expérimentateur et l’analyste de données. Évaluer la normalité à l’aide du test de Shapiro–Wilk. Analyser les données normalement distribuées à l’aide d’un test t de l’Étudiant non apparié à deux queues. Analysez des données anormalement distribuées à l’aide du test Mann–Whitney U.

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Résultats

Dans cette étude, 16 souris (HFpEF, n = 8 ; CTRL, n = 8) ont été utilisés. L’artère coronaire gauche a été identifiée sous guidage Doppler couleur dans la vue de l’axe long parasternal (PLAX), et la vitesse de l’écoulement coronarien a été mesurée à l’aide de Doppler à onde pulsée (PW). Après l’acquisition d’images suffisantes et reproductibles de chaque souris à la fois à 1,5 % (initiale) et 3 % (hyperémique) d’isoflurane,le 26 CFR a été déterminé en moyenne sur ...

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Discussion

Cette étude présente un protocole utilisant une méthode non invasive, simple et reproductible pour évaluer les dysfonctionnements macro- et microvasculaires dans des modèles animaux HFpEF. L’échocardiographie Doppler pour évaluer la réserve de flux coronaire est reconnue par la Société européenne de cardiologie comme une méthode validée etreproductible 15. Dans des conditions physiologiques normales chez les souris C57BL/6J, la réserve de flux coronaire est attend...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs affirment qu’il n’existe pas d’intérêts financiers ou commerciaux concurrents.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par les Fonds pour les jeunes scientifiques distingués de Nankin - projet clé soutenu par la Medical Science and Technology Development Foundation, Département de la Santé de Nankin (JQX22001) ; Fondation chinoise des sciences postdoctorales (2023M731631) ; Financements pour essais cliniques de l’hôpital affilié Drum Tower, faculté de médecine de l’Université de Nankin (2024-LCYJ-PY-29) ; Fondation de recherche de la Commission provinciale de la santé et de la planification familiale du Jiangsu (MQ2024049).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Moniteur de physiologie animaleFujifilmVEVO 3100Surveillez la fréquence cardiaque, la respiration et la température corporelle
Souris C57GemPharmatech Co., Ltd
CaméraCanon, JaponEOS R50Notez la position de la plateforme d’imagerie et de la sonde d’échographie
Crème dépilatoireVeet, françaisÉpilation
GazeCurityVOITURE-6339-PKStérile
IsofluraneRÉCOMPENSER510-22-10Anesthésie
N-nitro-L-arginine éthyle ester méthyl (L-NAME)Sigma-AldrichN5751Introduction du modèle de souris HFpEF
Régimes de recherche, 60 % de graisses & nbsp ;   ;Recherche sur Diets, Inc.  ;  ; D12492Régime riche en graisses
Bouillotte thermostatique chirurgicaleGlobalebio, ChineGE0-20WContrôle de la température
Gel à ultrasonsLaboratoires ParkerW60698LGel de transmission par ultrasons
Plateau d’imagerie préclinique Vevo 3100FujifilmVEVO 3100Échocardiographie
Logiciel VevoLABFujifilmVevoLAB 3.2.6Analyse des données par échocardiographie

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

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