In Vivo Observation non invasive des changements dynamiques de la tige pileuse, de la mélanine et du collagène pendant le cycle du follicule pileux de la souris

Résumé

Cette étude présente une méthode non invasive, in vivo , utilisant la microscopie à deux photons et à la génération de seconde harmonique pour surveiller longitudinalement la morphologie du flanc pileux, la dynamique de la mélanine et la densité du collagène dermique tout au long du cycle folliculaire pileux chez la souris, fournissant un cadre méthodologique solide pour la recherche thérapeutique sur la perte de cheveux.

Résumé

Les évaluations traditionnelles du cycle du follicule pileux reposent sur des méthodes histologiques invasives, limitant l’observation longitudinale continue. Il a été émis l’hypothèse que l’imagerie optique non invasive, en particulier la fluorescence excitée par deux photons (TPEF) et la génération de seconde harmonique (SHG), peuvent suivre et quantifier avec précision les changements dynamiques in vivo des tiges pileuses, de la mélanine et du collagène à travers plusieurs cycles folliculaires pileux. Les tiges pileuses des souris C57BL/6 ont été surveillées in vivo pendant les phases anagène, catagène et télogène à l’aide de dermoscopie, de photographie et de microscopie électronique. Plus précisément, le TPEF sous excitation et imagerie à 800 nm a été utilisé pour quantifier la dynamique de la mélanine, tandis que la SHG sous excitation à 950 nm a été utilisée pour observer les changements de collagène interfolliculaire. Pour garantir l’exactitude, les mesures optiques in vivo ont été validées : la dynamique de la mélanine a été confirmée par photographie cutanée pour l’apparence globale des tissus et une coloration hématoxyline et éosine (HE) pour l’expression du bulbe pileux, tandis que les modifications du collagène ont été validées en évaluant la densité et l’orientation des fibres à l’aide d’un système d’imagerie à cristaux liquides polarisant sur des sections colorées à Sirius Red. Les observations ont montré que durant la phase anagène, le diamètre de la tige du cheveu et la production de mélanine augmentaient progressivement, accompagnés d’une réduction significative de la densité de collagène interfolliculaire. Pendant les phases catagène et télogène, les niveaux de mélanine ont progressivement diminué, et la densité du collagène s’est progressivement rétablie jusqu’à ses niveaux de base. Ce projet établit une méthodologie in vivo validée et non invasive pour évaluer la dynamique globale des follicules pileux, fournissant un cadre expérimental solide pour l’évaluation préclinique des agents actifs dans le traitement de la perte de cheveux.

Introduction

Les follicules pileux des souris C57BL/6 présentent une synchronicité et une régularité, offrant une commodité expérimentale et faisant d’eux un modèle animal courant pour l’étude des maladies^{cutanées 1,2}. Les follicules pileux entrent dans la deuxième phase télogène dans la septième semaine suivant la naissance de la souris C57BL/6³. En l’absence d’intervention artificielle, cette phase télogène sera maintenue jusqu’à la douzième semaine suivant^{la naissance 4}. Cette longue période de télogène est un moment couramment utilisé dans la recherche pour synchroniser le cycle de croissance du follicule^{pileux 5}. Après la dépilation artificielle des souris, les follicules pileux commencent immédiatement à entrer en phase^{anagène 6}.

Après être entrée dans la phase de croissance, les cellules souches dans la région de la bosse prolifèrent et se différencient dans la gaine radiculaire externe, descendant pour augmenter la longueur^{folliculaire 7}. La base du cheveux s’étend vers le haut à mesure que le follicule^{s’approfondit.} Les cellules souches du bulbe se différencient continuellement en la tige du poil et la gaine interne de la racine⁹. La sécrétion de collagène et de mélanine dans la peau change également rapidement durant la phase^{anagène 10}, jouant un rôle important dans le développement des follicules^{pileux 11,12}. Dans les études liées à la perte de cheveux, la sécrétion de mélanine est généralement évaluée via la couleur de la peau, ce qui ne permet pas une quantification^{précise 13}. À ce jour, la recherche sur le collagène s’est principalement concentrée sur le développement et le vieillissement plutôt que sur la dynamique cyclique de la quantification.

Actuellement, une limitation majeure dans l’évaluation des cycles des follicules pileux et des thérapies régénératrices est la dépendance à des critères histologiques destructifs, ce qui nécessite l’euthanasie de différentes cohortes d’animaux à des moments^{précis 14}. Cela empêche un suivi longitudinal continu du même microenvironnement folliculaire sur plusieurs cycles. De plus, les techniques non invasives conventionnelles comme la dermatoscopie manquent de pénétration tissulaire suffisante pour visualiser les changements folliculaires^{profonds 15}, et l’observation macroscopique ne permet pas de quantifier précisément la mélanine, rendant difficile la détection de la racine carente en mélanine des poils de club lors des phases de régression tardive et^{de repos 16,17}. Diverses technologies optiques ont fait progresser l’observation longitudinale in vivo ^18,19, telles que la polarimétrie à cristaux liquides pour évaluer les fibres de collagène^20,21, la microscopie confocale cutanée pour observer la pigmentation^22,24, et la tomographie par cohérence optique pour mesurer l’épaisseur de la^peau 25,26,27 , la microscopie multiphotonique offre une solution particulièrement convaincante. L’utilisation combinée de la fluorescence à excitation à deux photons (TPEF) et de la génération de seconde harmonique (SHG) présente des avantages distincts : elle permet un coupement optique haute résolution et sans marqueur profondément dans le derme, permettant la quantification simultanée in vivo de l’autofluorescence de la mélanine et de l’architecture des fibres de collagène sans colorants^{exogènes 28,29}. Dans cette étude, les auteurs avancent l’hypothèse que l’imagerie TPEF/SHG non invasive peut quantifier de manière dynamique et précise ces changements structurels avec une précision comparable à celle des standards histologiques invasifs. En abordant ce problème scientifique clé, cette étude vise à établir un cadre robuste d’imagerie in vivo longitudinale pour soutenir l’évaluation non invasive des agents thérapeutiques pour l’alopécie³⁰.

Protocole

Toutes les méthodes impliquant l’utilisation de sujets vertébrés ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles. Toutes les procédures expérimentales animales ont été approuvées par le Comité de Soins et d’Utilisation Institutionnelles des Animaux du Centre de Recherche Expérimentale de l’Académie chinoise des sciences médicales chinoises (Code de protocole : ERCCACMS11-2210-03). Tous les matériaux utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.

Préparation animale et observation macroscopique
Des souris mâles C57BL/6, âgées de 6 à 7 semaines et pesant 20 ± 2 g, ont été obtenues auprès d’un fournisseur commercial. Les souris ont été divisées en une cohorte d’analyse histologique (n = 39) et une cohorte continue d’imagerie in vivo (n = 3). Les poils dorsaux de toutes les souris ont été dépilés pour synchroniser le cycle du follicule pileux. Le statut de croissance des cheveux a été examiné un jour sur deux du jour 2 au jour 26 après la dépilation. Le dos des souris de la cohorte d’imagerie a été photographié un jour sur deux jusqu’au 26e jour à l’aide d’un appareil photo. Une distance focale fixe de 15 cm a été maintenue, et des conditions d’éclairage ambiant standard et constantes en laboratoire ont été assurées pour documenter avec précision les changements macroscopiques.

In vivo Imagerie TPEF et SHG
Des séances d’imagerie ont été réalisées les jours 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 et 26 après la dépilation. Les souris ont été anesthésiées à l’aide d’isoflurane. La perte totale de conscience était assurée en observant la fréquence respiratoire et en testant le réflexe du pied avec une légère pincement de l’orteil. La souris anesthésiée était fixée sur la scène d’un microscope à deux photons. Pour l’imagerie TPEF de la mélanine, le microscope était équipé d’un objectif d’immersion dans l’eau 25x (ouverture numérique = 1,05), et la longueur d’onde d’excitation était réglée à 800 nm. Un balayage en pile Z de l’autofluorescence de la mélanine a été réalisé, atteignant une profondeur totale de balayage de 45 μm. La taille du pas était réglée à 2 μm, la résolution d’image à 1 024 × 1 024 pixels, et la vitesse d’acquisition à 4 μs/pixel. Pour l’imagerie SHG des fibres de collagène, la longueur d’onde d’excitation a été ajustée à 950 nm en utilisant le même objectif d’immersion en eau de 25x. Un balayage en pile z depuis la surface supérieure du derme jusqu’à une profondeur totale de balayage de 45 μm a été initié, maintenant une taille de pas de 2 μm, une résolution d’image de 1 024 × 1 024 pixels, et une vitesse d’acquisition de 4 μs/pixel. Après la séance d’imagerie, la souris a été soigneusement retirée de l’étage du microscope, l’isoflurane a été arrêté, et la souris a été placée sur un coussin chauffant jusqu’à sa conscience complète avant de la ramener dans la cage à domicile.

Prélèvement des tissus et traitement histologique
Une cohorte distincte et distincte de trois souris du groupe histologique a été euthanasiée tous les deux jours du jour 2 au jour 26, selon les directives institutionnelles, garantissant qu’aucune souris n’était réutilisée pour un échantillonnage histologique longitudinal. Un échantillon de tissu cutané dorsal de 2 cm × 2 cm d’épaisseur complète, précisément centré à l’intersection des lignes médianes horizontales et verticales du dos de chaque souris, a été excisé chirurgicalement. Le tissu cutané excisé était placé à plat sur une carte dure pour éviter les enroulements des bords et immédiatement immergé dans un tube à essai contenant 4 % de paraformoldéhyde. Les tissus fixes étaient déshydratés et intégrés pour préparer des sections de paraffine de 6 μm d’épaisseur. Avant le décirement, les sections en paraffine ont été chauffées sur un chauffe-coulissière pendant 120 minutes. Les sections ont été colorées à l’hématoxyline et à l’éosine (HE) et Sirius Red à l’aide de kits de coloration standards selon les instructions du fabricant. Les sections étaient montées avec de la gomme neutre et observées au microscope inversé. Pour l’imagerie polarisée par cristaux liquides, les sections décirées et colorées en Sirius Red ont été photographiées au microscope à lumière polarisée. Un angle de polarisation unifié était établi en croisant le polariseur et l’analyseur à exactement 90° pour obtenir un fond maximalement sombre (état d’extinction), et cet angle spécifique était constamment verrouillé pour toutes les captures d’images ultérieures.

Dermoscopie in vivo et microscopie électronique des poils
Avant l’arrachement, la zone dorsale de croissance des poils a été évaluée in vivo à l’aide d’un dermatoscope clinique à un gros 20x. La régénération capillaire a été quantifiée à l’aide d’un système de notation standard 0–3 basé sur l’émergence et la densité de la tige capillaire (0 = pas de poils visibles ; 1 = émergence de poils clairsemés ; 2 = densité modérée ; 3 = densité complète de cheveux). Pour garantir un échantillonnage impartial, la zone dorsale dépilée de chaque souris a été visuellement divisée en quatre quadrants égaux. Un générateur de nombres aléatoires a été utilisé pour sélectionner deux quadrants par souris, et cinq tiges de poils nouvellement poussées ont été fermement arrachées à chaque quadrant sélectionné à l’aide de pinces stériles. Les tiges de cheveux épilées ont été immédiatement immergées et fixées dans du glutaraldéhyde à 2,5 % dans un tampon phosphate de 0,1 M (pH 7,4) pendant 4 heures à 4 °C afin de préserver l’ultrastructure. Les tiges de cheveux fixes ont été lavées trois fois dans un tampon phosphate de 0,1 M et déshydratées séquentiellement à travers une série d’éthanol classée (50 %, 70 %, 80 %, 90 % et 100 %) pendant 15 minutes à chaque concentration, suivies d’un séchage au point critique avec du_CO2 liquide. Les tiges séchées étaient montées horizontalement sur un ruban carbone conducteur double face fixé à des moignons en aluminium. Les échantillons ont été recouverts de sputter d’une couche d’or de 10 nm à l’aide d’un revêtement à crachats sous vide pendant 60 s pour éviter la charge électronique. Les échantillons revêtus étaient insérés dans un microscope électronique à balayage, et les tiges capillaires observées à l’aide d’une tension d’accélération de 5,0 kV. Les changements morphologiques ultramicroscopiques ont été systématiquement évalués en capturant des images à des grossissements de 500x et 1 000x, documentant spécifiquement le diamètre de la tige du cheveux ainsi que l’intégrité structurelle et l’arrangement des écailles cuticulaires.

Données et analyse statistique
Les paramètres d’image ont été mesurés et quantifiés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image générique. Toutes les analyses statistiques et représentations graphiques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique standard. Pour les données de surveillance in vivo continue obtenues auprès des mêmes animaux à plusieurs moments précis, la signification statistique a été déterminée à l’aide d’une analyse de variance par mesures répétées (RM-ANOVA) suivie du test post-hoc de Bonferroni. Pour les données histologiques impliquant des échantillons d’animaux indépendants, une ANOVA unidirectionnelle ordinaire suivie du test post-hoc de Tukey a été utilisée pour évaluer les différences statistiques. Tous les résultats ont été exprimés en moyenne ± écart-type (DE). Les différences ont été considérées comme statistiquement significatives à *p < 0,05, p < 0,01 et ***p < 0,001.

Résultats

Observation des poils de souris
Des observations photographiques de la croissance des poils murins sont présentées à la Figure 1A. L’apparition des poils à travers la surface cutanée a commencé au jour 10, avec un développement continu entre le jour 12 et le jour 16 (p < 0,05). La couverture capillaire s’est ensuite stabilisée du jour 18 au jour 26 (p > 0,05) (Figure 1B). De plus, la dermosc...

Discussion

Le modèle souris C57BL/6 a été choisi car sa deuxième phase télogienne dure de manière stable de la semaine 7 à la semaine 12. Puisque la fenêtre d’observation de 26 jours se situe entièrement dans cette phase statique, les changements dynamiques profonds observés sont explicitement dictés par la progression du cycle induite par la dépilation, excluant totalement les fluctuations naturelles liées à l’âge. Lorsque la dépilation est effectuée pendant la phase télogène, les follicules pileu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
C57BL/6 mice,	Beijing Vital River Laboratory Animal Technology	SCXK (Jing) 2021-0006	Utilisé pour les modèles animaux
Digital DSLR Camera	Canon	EOS 80D	Utilisé pour prendre des photos du dos des souris
H&E Staining Kit	LtdSolarbio Science & Technology Co.	G1120	Utilisé pour la coloration des sections de tissus
Inverted Microscope	Olympus	BX51	Utilisé pour prendre des photos
lsoflurane	RWD Life Science Co.	R510-22-16	Utilisé pour anesthésier les animaux
Mai Tai DeepSee	SpectraPhysics	Mai Tai HP	Utilisé pour l'imagerie TPEF et SHG in vivo
Medical Electronic Dermatoscope	China Chuanghong Medical Technology Co.	CH-DSIS-2000	Utilisé pour l'imagerie in vivo de la couleur de la peau
Polarized Light Microscope	Olympus	BX51-P	Utilisé pour l'imagerie de la coloration Sirius Red
Scanning electron microscope (SEM)	Hitachi High-Tech Corporation	SU8010	Pour l'observation de l'ultrastructure des cheveux
Sirius Red staining kit	Solarbio	G1472	Pour la coloration des fibres de collagène
Small Animal Anesthesia Machine	RWD Life Science Co.	R500	Utilisé pour anesthésier les animaux