Imagerie à super-résolution et gestion partagée : un protocole pour la microscopie confocale avec détection multiplex

Summary

Ce protocole détaille les applications avancées d’imagerie et la gestion des ressources partagées d’un système de microscope confocal à balayage laser intégré à un détecteur à réseau multiplexé pour l’imagerie cellulaire et subcellulaire à haute résolution. Ce flux de travail permet l’imagerie multimodale de la confocale à la super-résolution (~120 nm) sur une seule plateforme, rendant la visualisation à l’échelle nanométrique plus accessible.

Abstract

La microscopie à super-résolution (SRM) dépasse la limite de diffraction de la microscopie optique conventionnelle, permettant la visualisation à l’échelle nanométrique des structures subcellulaires. Cependant, l’adoption généralisée de techniques telles que la microscopie par épuisement par émission stimulée (STED), la microscopie de localisation photoactivée (PALM) / la microscopie de reconstruction optique stochastique (STORM) et la microscopie à éclairage structuré (SIM) peut être entravée par des facteurs tels que la phototoxicité élevée, la préparation spécialisée des échantillons ou le fonctionnement complexe. Ici, nous présentons un protocole complet qui exploite une plateforme confocale à balayage laser intégrée à un détecteur multiplexé à super-résolution. Ce système, combiné au traitement computationnel, permet une transition directe entre l’imagerie confocale et l’imagerie super-résolution au sein du même flux de travail. Le protocole offre une approche conviviale pour une imagerie rapide, à haute résolution et à faible phototoxicité. La méthode détaillée englobe des capacités d’imagerie multimodale, incluant la fluorescence multicolore, le contraste différentiel d’interférence (DIC), la reconstruction tridimensionnelle de la pile Z, l’imagerie en accéléré en temps réel, le pavage sur grande surface, et divers modes de super-résolution proposés par le détecteur à réseau multiplexé. Des comparaisons systématiques démontrent que les modes de super-résolution atteignent une résolution latérale d’environ 120 nm, ce qui représente une amélioration d’environ deux fois par rapport à la limite de diffraction de la microscopie large champ conventionnelle et une amélioration significative à la fois de la résolution et du rapport signal/bruit (4-8 fois) par rapport au fonctionnement confocal standard sur la même plateforme. La discussion aborde également les points clés d’un modèle de gestion partagée des ressources essentiels pour soutenir le fonctionnement durable de cette technologie. Ce guide intégré constitue une ressource précieuse tant pour les chercheurs débutants qu’expérimentés ainsi que pour les gestionnaires d’installations souhaitant adopter et maximiser le potentiel de cette forme accessible d’imagerie avancée en recherche en sciences de la vie.

Introduction

La visualisation des structures sous-cellulaires dynamiques est fondamentale pour faire progresser la recherche en sciences de la vie. Cependant, la résolution de la microscopie optique traditionnelle est limitée par la diffraction à environ 200 nm latéralement, ce qui limite sa capacité à résoudre des processus subcellulaires dynamiques. Pour surmonter cette barrière, diverses techniques de super-résolution ont été développées. Cependant, des techniques telles que la microscopie STED, PALM/STORM et SIM posent souvent des obstacles à une adoption généralisée dans les environnements multi-utilisateurs, notamment une phototoxicité élevée, la nécessité de fluorophores spécialisés ou de préparation d’échantillons, des procédures d’alignement complexes ou un traitement computationnel^{intensif 1,2,3}.

Dans ce contexte, les systèmes de microscopes confocaux équipés d’un détecteur à réseau multiplexé offrent une alternative convaincante en permettant l’imagerie à super-résolution grâce à la détection multi-pixels et à la réaffectation computationnelle, abaissant significativement le seuil^{technique 4}. Cette approche utilise un réseau de détecteurs de phosphure d’arséniure de gallium (GaAsP) à 32 éléments pour collecter davantage de photons à chaque point de balayage. Les algorithmes intelligents de déconvolution ultérieurs réaffectent ces informations, réduisant effectivement le volume de détection. Ce procédé atteint des résolutions spatiales d’environ 120 nm latéralement et 350 nm axialement, représentant environ 2 fois l’amélioration de la limite de diffraction de la microscopie à large champ et offrant une augmentation de 4 à 8 fois du rapport signal/bruit par rapport au mode confocal standard sur le^{même instrument 4,5,6}. Cette combinaison unique de résolution améliorée, de qualité de signal supérieure et de compatibilité avec les étiquettes fluorescentes et protocoles courants constitue son principal avantage pour une application large.

Par conséquent, cette forme de microscopie super-résolution accessible a trouvé une large application dans la recherche en sciences de la vie, permettant des études détaillées sur la morphologie des organites, la dynamique du cytosquelette, les interactions virus-hôte et la co-localisation moléculaire dans les cellules fixes et^{vivantes 7,8}. Sa relative douceur le rend particulièrement adapté aux observations en accéléré prolongé d’échantillons vivants.

L’intégration de tels systèmes avancés dans les installations centrales est cruciale pour démocratiser l’accès, mais leur fonctionnement durable et efficace présente des défis distincts. Dans les établissements institutionnels centraux, comme à la Faculté de médecine de l’Université du Zhejiang, la performance optimale et l’impact dépendent de manière cruciale de trois piliers : (1) des protocoles d’imagerie standardisés et reproductibles, (2) un entretien régulier rigoureux, et (3) un cadre de gestion efficace pour un accès partagé. Bien que des ressources précieuses existent pour des aspects spécifiques, tels que les méthodes d’imagerie pour les systèmes^{antérieurs 9}ou les principes généraux de gestion^{des installations 10,11}, un guide complet intégrant des protocoles détaillés et reproductibles pour les plateformes modernes de détection à réseau multiplexé avec un modèle éprouvé de gestion des ressources partagées fait actuellement défaut. Cet article sur le protocole vise à combler cet écart.

L’objectif global est de fournir un guide complet, étape par étape, pour mettre en œuvre et utiliser efficacement un système confocal avec un détecteur à réseau multiplexé pour l’imagerie à super-résolution dans un cadre de ressources partagées. It is designed for two primary audiences: researchers requiring resolution beyond conventional confocal limits (~250‬-300 nm) but for whom live-cell compatibility, ease of use, and throughput are also critical; et les gestionnaires d’installation établissant ou optimisant un tel service. Ici, nous détaillons systématiquement la configuration du système, les protocoles d’imagerie multimodale (couvrant les modes multicolore, 3D, cellules vivantes, pavage et super-résolution), ainsi qu’un modèle de gestion partagée éprouvé. Ce guide intégré sert de ressource pour maximiser le potentiel et l’accessibilité de cette puissante modalité d’imagerie.

Protocol

Toutes les expériences impliquant des échantillons biologiques ont été menées conformément aux directives et règlements des Centres Centraux de la Faculté de Médecine de l’Université du Zhejiang et ont été approuvées par le Comité de Biosécurité Institutionnelle (Certificat d’approbation n° BSL20235710079).

REMARQUE : Toutes les procédures impliquant des cultures cellulaires doivent être réalisées dans des conditions stériles dans une armoire de sécurité biologique de classe II, sauf indication contraire. Ce protocole suppose que le système de microscope est installé et que les puissances laser sont calibrées. Les spécifications détaillées et les fournisseurs recommandés pour les principaux réactifs, consommables et équipements (par exemple, vaisselles d’imagerie, verre de couverture, support de montage) sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation de l’échantillon

REMARQUE : La réussite de l’imagerie super-résolution commence par une préparation optimale de l’échantillon. L’utilisation de plaques d’imagerie en verre de haute qualité, épaisse de 1,5 épaisseur (0,17 mm), est essentielle pour correspondre au collier correcteur des objectifs d’immersion à haute concentration d’huile et éviter les aberrations sphériques. Toutes les étapes de centrifugation doivent être effectuées à 300 × g pendant 5 minutes, sauf indication contraire.

1. Préparation d’échantillons de cellules fixes pour l’imagerie multicolore à super-résolution (par exemple, cellules COS7)
   REMARQUE : Ce protocole décrit l’immunocoloration pour les microtubules (Alexa Fluor 568) et les mitochondries (Alexa Fluor 488), avec une contre-coloration nucléaire 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), comme illustré à la Figure 1.
   1. Culture des cellules COS7 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétées avec un sérum bovin fœtal (FBS) à 10 % à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO₂ .
   2. Cellules de plaque sur des antennes d’imagerie à fond en verre de 35 mm à une densité de 1,0 × 10⁵ cellules/antenne. Laissez les cellules adhérer et atteindre une confluence de 60-70 % (généralement 24 heures).
   3. Aspirez le milieu de culture et lavez doucement les cellules une fois avec du sérum physiologique phosphate (PBS) pré-chauffé (37°C). Fixez les cellules en ajoutant 1 mL de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % dans le PBS et incubez pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
   4. Aspirez la solution PFA (considérez comme un déchet dangereux). Lavez les cellules trois fois avec 2 mL de PBS, en incubant pendant 5 minutes par lavage avec un léger balancement.
   5. Perméabilisation et blocage : Incubez les cellules avec 1 mL de tampon de perméabilisation/blocage (0,1 % v/v) Triton X-100, 1 % (en v/v) d’albumine sérique bovine (BSA) en PBS) pendant 30 minutes à la RT.
   6. Incubation primaire des anticorps : Incuber les cellules avec un mélange d’anticorps primaires contre la α-tubuline (monoclonale de souris) et la TOMM20 (polyclonale de lapin) dans un tampon de dilution d’anticorps (1 % de BSA dans PBS) à 4°C pendant la nuit (ou 1-2 heures à la RT). Utilisez 300 μL par plat pour couvrir la surface du verre.
   7. Lavage : aspirez soigneusement la solution primaire d’anticorps. Lavez les cellules trois fois avec 2 mL de PBS contenant 0,05 % Tween-20 (PBST), 5 min par lavage.
   8. Anticorps secondaires et coloration nucléaire : Préparez un mélange d’anticorps secondaires fluorescents et de DAPI dans un tampon de dilution d’anticorps (1 % BSA/PBS), protégé de la lumière.
      1. Utilisez l’IgG anti-souris de l’âne conjugué à l’Alexa Fluor 568 (1:500) et l’IgG anti-lapin de l’âne conjugué à l’Alexa Fluor 488 (1:500).
      2. Inclure le DAPI à une concentration finale de 1 μg/mL pour la coloration nucléaire. Appliquez 300 μL de ce mélange sur les cellules et incubez pendant 1 heure à RT dans le noir.
   9. Lavage final : Aspirez la solution de coloration et lavez les cellules trois fois avec 2 mL de PBS, 5 minutes par lavage.
   10. Appliquer le support de montage : aspirez soigneusement le PBS de la boîte d’imagerie, en laissant l’échantillon légèrement humide. Appliquez immédiatement une petite goutte (~20 μL) de médium de montage anti-décoloration durci (par exemple, ProLong Gold) directement sur la région du fond en verre.
   11. Couvrir et durcir : Descendez doucement un verre de couverture haute précision #1.5 sur la goutte, évitant les bulles. Laissez le montage durcir toute la nuit à RT dans le noir, ou pendant 2 à 4 heures à 37°C si un durcissement plus rapide est nécessaire.
2. Préparation d’échantillons de cellules vivantes pour l’imagerie en accéléré (par exemple, des cellules Hep3B exprimant un marquant protéique fluorescent).
   REMARQUE : Ce protocole décrit l’imagerie des cellules Hep3B exprimant de manière stable une protéine fluorescente (par exemple, EGFP) ciblant les mitochondries.
   1. Cultivez des cellules Hep3B dans un milieu essentiel minimal (MEM) complétés avec 10 % de FBS. Des cellules à plaque sur des plats d’imagerie à fond en verre de 35 mm (1,5 couvrent le verre) à une densité de 0,8 × 10⁵ cellules/plat. Laissez les cellules croître jusqu’à une confluence d’environ 70-80 % pour une santé optimale et une densité d’imagerie (généralement 18-24 heures).
   2. Préparation pour l’imagerie : Le jour de l’imagerie, remplacez doucement le milieu de culture standard par 2 mL de milieu d’imagerie pré-équilibré (37°C, 5 % de CO₂ ), sans phénomène rouge, à faible fluorescence, complété avec un FBS à 10 % et, si nécessaire, un tampon HEPES de 25 mM pour la stabilisation du pH à l’extérieur d’un incubateur de CO₂ . Cela minimise la fluorescence de fond et maintient le pH physiologique lors de l’imagerie.
      REMARQUE : Laissez la boîte s’acclimater sur l’étage du microscope préchauffé à l’intérieur de la chambre environnementale pendant au moins 30 à 45 minutes avant de commencer l’acquisition en accéléré afin d’assurer la température, la concentration et la stabilisation de la santé cellulaire.

2. Démarrage, initialisation et alignement de base du système de microscope

1. Alimentation de l’unité principale du microscope, du module de lancement laser (contenant des lasers à semi-conducteurs à 405, 488, 561 et 640 nm), de la source lumineuse LED et de l’ordinateur de contrôle.
   1. Laissez les lasers chauffer et se stabiliser pendant au moins 15 à 20 minutes. Cela est essentiel pour une puissance laser stable, en particulier pour les expériences quantitatives ou en accéléré.
2. Lancez le logiciel d’exploitation du microscope.
3. Depuis l’interface principale, sélectionnez « Microscope » > « Initialiser » ou suivez l’assistant de démarrage du logiciel.
4. Dans le logiciel, allez au panneau « Acquisition ». Dans le menu déroulant de l’objectif objectif, sélectionnez « Plan-Apochromat 63 x/ 1.40 Oil » ou l’objectif approprié pour votre expérience.
5. Appliquez une goutte d’huile d’immersion (indice de réfraction = 1,518) directement sur la lentille avant de l’objectif. Évitez d’introduire des bulles.
6. Pour l’imagerie de cellules vivantes, activez la chambre environnementale et le système de stabilisation active de la mise au point (par exemple, « Definite Focus » >) au moins 45 à 60 minutes avant l’imagerie. Réglez la température à 37°C, le_CO2 à 5 %, et l’humidité à >60 %. Laissez le système se stabiliser. Vérifiez la stabilité avec les capteurs de chambre.
7. Le système est désormais prêt pour le chargement des échantillons et la configuration des paramètres d’imagerie.

3. Imagerie à fluorescence multicolore

1. Placez l’échantillon préparé sur l’étage du microscope. Soulève délicatement l’étage jusqu’à ce que le verre de couverture touche l’huile d’immersion.
2. Dans le logiciel d’acquisition, naviguez dans l’onglet « Acquisition » et sélectionnez Créer une nouvelle expérience.
3. Ajoutez plusieurs pistes d’imagerie (canaux) correspondant aux fluorophores utilisés. Pour l’exemple de la Figure 1, configurez :
   1. Piste 1 (DAPI) : Excitation 405 nm, détection 410-480 nm.
   2. Piste 2 (Alexa Fluor 488) : Excitation 488 nm, détection 495-550 nm.
   3. Piste 3 (Alexa Fluor 568) : Excitation 561 nm, détection 570-620 nm.
4. Pour chaque piste, réglez le diamètre du trou d’épingle confocal à 1 unité Airy (1 UA).
5. Optimisez la puissance laser et le gain du détecteur pour chaque canal en utilisant le processus itératif suivant :
   1. Sélectionnez le premier canal (par exemple, DAPI). Passer en mode de balayage « en direct ».
   2. Réglez la puissance initiale du laser à une valeur basse (par exemple, 0,1-0,5 %). Réglez le gain du détecteur à un niveau modéré dans sa plage linéaire (par exemple, 700 V pour un PMT GaAsP).
   3. Augmentez progressivement la puissance du laser jusqu’à ce que les structures cibles soient clairement visibles au-dessus de l’arrière-plan dans l’image en direct.
   4. Ouvre l’affichage de l’histogramme . Assurez-vous qu’il n’y ait pas de saturation des pixels (l’histogramme ne s’empile pas sur le bord droit). Réduisez la puissance du laser si nécessaire.
   5. Ajustez le gain du détecteur pour obtenir une image lumineuse et peu bruite. Évitez les gains supérieurs à 850 V pour éviter un bruit excessif.
   6. Répétez les étapes 3.5.1-3.5.5 pour tous les canaux de fluorescence restants.
      REMARQUE : Équilibrez la puissance du laser, le gain et le temps de permanence des pixels pour maximiser le rapport signal/bruit tout en minimisant les dégâts photo. Pour les cellules vivantes, privilégiez une consommation réduite et des temps de séjour plus courts.
6. Définissez le format de l’image (nombre de pixels) et le temps de permanence des pixels.
   1. Régler la taille du pixel pour satisfaire le critère de Nyquist : taille du pixel ≤(résolution / 2,3). Pour l’imagerie confocale standard (résolution latérale ~250 nm), réglez la taille des pixels ≤108 nm.
   2. Utilisez le bouton d’échantillonnage 'Nyquist ' du logiciel pour calculer cela automatiquement si disponible.
   3. Réglez le temps de permanence des pixels. Utilisez un temps de maintien plus long (par exemple, 1,0-2,0 μs) pour un rapport signal/bruit plus élevé, ou un temps de maintien plus court (par exemple, 0,5-1,0 μs) pour une imagerie plus rapide.
7. Assurez-vous que le mode « Scan séquentiel » est sélectionné entre les pistes pour minimiser la diaphonie.
8. Cliquez sur « Démarrer » pour acquérir une seule image. Sauvegardez l’image avec les métadonnées pertinentes.

4. Imagerie par contraste différentiel d’interférence (DIC)

1. Dans l’onglet « Acquisition » du logiciel d’acquisition, sélectionnez « Ajouter un nouveau canal » et configurez-le pour la détection de la lumière transmise.
2. Sélectionnez le détecteur de lumière transmise approprié (souvent appelé T-PMT (tube photomultiplicateur de lumière transmise) ou ESID (détecteur d’interface système externe) dans le logiciel).
3. Configuration du prisme DIC et du polariseur :
   1. Depuis le panneau de contrôle matériel ou l’interface logicielle, sélectionnez le prisme DIC correspondant à votre objectif (par exemple, « DIC III » pour un objectif 63x).
   2. Insérez le prisme sélectionné dans le chemin lumineux.
4. Ajustez le polariseur et le curseur DIC pour un contraste optimal :
   1. Faites pivoter l’analyseur (polariseur) jusqu’à ce que l’arrière-plan de l’image « Live » paraisse sombre ou très sombre.
   2. Pendant que vous observez l’image en direct, ajustez lentement la position du curseur DIC par petits incréments.
   3. Optimiser jusqu’à ce que des caractéristiques cellulaires (par exemple, membranes, noyaux) apparaissent avec un relief distinct en ombre, pseudo-tridimensionnel, sur un fond gris neutre.
5. Réglez la longueur d’onde d’illumination pour le CID à une valeur dans la plage visible (par exemple, 488 nm ou 546 nm).
6. Ajustez l’intensité de transmission (puissance du laser ou de la lampe) et le gain du détecteur pour le canal lumineux transmis afin d’obtenir une image claire sans saturation.
7. Acquérez l’image DIC.

5. Acquisition par pile Z pour la reconstruction tridimensionnelle

REMARQUE : Avant de définir la pile Z, configurez tous les paramètres d’imagerie (puissance laser, gain, trou d’épingle, taille des pixels) sur un seul plan focal optimal comme décrit dans la Section 3. Cela garantit des réglages cohérents sur toutes les sections optiques.

1. Dans l’onglet « Acquisition », sélectionnez le mode « Z-stack ».
2. Définissez le volume d’intérêt :
   1. En utilisant un balayage en direct à grande vitesse, concentrez-vous sur la structure la plus haute qui vous intéresse.
   2. Cliquez sur « Mettre en premier » (ou « En haut »).
   3. Concentrez-vous soigneusement vers la structure la plus basse qui vous intéresse.
   4. Cliquez sur « Mettre la fin » (ou « En bas »). Le logiciel affichera la profondeur totale.
3. Fixez la taille du pas Z pour satisfaire le critère d’échantillonnage de Nyquist dans la direction axiale. (typiquement d_r/2.3, où d_r est la résolution axiale). Pour un objectif d’huile de 63x/1,4 NA, utilisez 0,3-0,4 μm.
4. Sinon, utilisez le bouton « Optimal » ou « Nyquist » du logiciel pour calculer automatiquement la taille du pas.
5. Configurez les paramètres d’imagerie (puissance laser, gain, sténopéisme = 1 UA) pour chaque canal comme décrit dans la Section 3. Pour des signaux faibles, envisagez d’augmenter légèrement la puissance ou le gain du laser par rapport à une seule image 2D.
6. Commencez l’acquisition pour collecter toute la pile d’images.
   REMARQUE : Temps total d’acquisition = (Temps d’image d’une seule tranche) × (Nombre de tranches)
   Planifiez en conséquence, surtout pour les échantillons vivants.
7. Reconstruction 3D et visualisation :
   1. Utilisez le module « Processing » du logiciel (par exemple, la fonction de projection 3D) ou ouvrez la pile d’images dans un logiciel dédié comme ImageJ/Fiji.
   2. Générez des projections d’intensité maximale (MIP) pour visualiser tous les signaux nets dans une seule image 2D.
   3. Pour une vraie représentation 3D, appliquez le rendu volumineux. Ajustez la luminosité, l’opacité et l’éclairage selon les besoins.
   4. Générez des vues orthogonales (sections transversales XZ et YZ) pour inspecter l’étendue axiale et l’enregistrement.

6. Imagerie en accéléré temporel pour cellules vivantes

1. Préparez les cellules vivantes comme décrit à la Section 1.2. et monter la boîte sur la scène de microscope préchauffée dans la chambre environnementale.
2. Laissez l’échantillon s’acclimater pendant au moins 45 à 60 minutes comme décrit à la section 2.6 pour assurer la stabilisation.
3. Naviguez vers un champ de vision avec des cellules saines et bien espacées et obtenez un instantané unique de haute qualité en utilisant des paramètres optimisés selon la Section 3.5.
4. Activez le système de stabilisation active (par exemple, Definite focus ou similaire). Cela est non négociable pour des expériences à long terme visant à compenser la dérive thermique.
5. Dans l’onglet « Acquisition », sélectionnez le mode « Série temporelle ».
6. Sélectionnez le mode d’imagerie approprié en fonction de l’équilibre requis entre vitesse, résolution et phototoxicité :
   1. Pour une résolution spatiale maximale dans les processus moins dynamiques, sélectionnez le mode « SR » (SuperResolution).
   2. Pour un équilibre adapté à de nombreuses dynamiques d’organites, sélectionnez « SR 2 Y » ou « SR 4 Y » (modes de superrésolution accélérés).
   3. Pour une imagerie très haute vitesse sans superrésolution, sélectionnez le mode « Confocal » ou « Co 2 Y ».
7. Définir la chronologie expérimentale : définir la durée totale de l’expérience et l’intervalle de temps (Δt) entre les images consécutives. (par exemple, 5 à 30 s pour la motilité mitochondriale)
8. Optimisez les paramètres d’imagerie pour minimiser les dégâts photoléniques :
   1. Commencez avec la puissance laser la plus faible qui produit un signal détectable.
   2. Ajustez le gain du détecteur dans sa plage linéaire (600-850 V) pour obtenir un niveau de signal fonctionnel, en préférant le gain aux augmentations de puissance laser.
   3. Utilisez la vitesse de balayage la plus rapide (le temps de permanence pixel le plus court) compatible avec les exigences de qualité d’image.
9. Commencez l’acquisition en accéléré. Surveillez les premières images pour assurer la stabilité de la mise au point et la santé cellulaire.

7. Imagerie par balayage de tuiles de grande surface

1. Dans l’onglet « Acquisition », sélectionnez le mode « Scan de tuiles ».
2. Définissez la tilingRegion en utilisant l’une des deux méthodes suivantes :
   1. Basé sur la disposition : Spécifier le nombre de tuiles dans les directions X et Y (par exemple, 3 x 3).
   2. Basé sur le ROI : Dessinez manuellement un rectangle au-dessus de l’image « Live » pour définir la région d’intérêt. Le logiciel calculera automatiquement le nombre de tuiles nécessaires.
3. Réglez le chevauchement entre les tuiles adjacentes à 10-15 %.
   REMARQUE : Ce chevauchement fournit suffisamment d’informations pour que l’algorithme de couture du logiciel crée une image composite fluide.
4. Configurez les paramètres d’imagerie (puissance laser, gain, résolution) pour une seule tuile comme vous le feriez pour une image statique.
   REMARQUE : Pour les très grandes surfaces carrelées, envisagez d’utiliser un mode de balayage plus rapide (par exemple, « Co 2 Y ») afin de garder un temps d’acquisition total efficace et de minimiser le photoblanchiment.
5. Commencez l’acquisition du carrelage. Le logiciel acquiert et assemblera automatiquement les carrelages.
6. Après acquisition, inspectez soigneusement l’image brodée, en particulier aux limites des carrelages, pour détecter d’éventuels artefacts. Utilisez les outils manuels d’ajustement des coutures du logiciel si nécessaire.

8. Imagerie super-résolution utilisant le détecteur à réseau multiplexé

1. Dans l’onglet « Acquisition », allez au sélecteur de mode, cliquez sur « Smart Setup » et sélectionnez le mode « Airyscan ». Ensuite, choisissez « SuperRésolution » comme mode de fonctionnement pour le détecteur à réseau multiplexé.
2. Choisissez le mode d’acquisition spécifique en fonction des priorités expérimentales :
   1. Mode « SR » : Pour la résolution spatiale la plus élevée possible (~120 nm latéral). À utiliser pour des échantillons fixes.
   2. Mode 'SR 2 Y' : Offre un équilibre entre résolution et vitesse.
   3. Mode 'SR 4 Y' : mode super-résolution le plus rapide (jusqu’à ~25 fps à un taux de ligne théorique), optimisé pour l’imagerie à cellules vives afin de minimiser la dose lumineuse.
   4. Mode 'Co 2 Y' : Offre une vitesse d’imagerie confocale avec un rapport signal/bruit amélioré, lorsque la super-résolution n’est pas requise.
      REMARQUE : Les valeurs de résolution (par exemple, 120 nm) sont des spécifications système dans des conditions^{idéales 12}. La résolution réelle dépend de la préparation de l’échantillon, du rapport signal/bruit et du traitement correct.
3. Configurez les paramètres d’imagerie (puissance laser, gain du détecteur).
   1. Pour l’imagerie livecell, commencez avec une puissance laser inférieure à celle du mode confocal pour réduire les dégâts photo.
   2. Pour des échantillons faibles et fixes, une puissance et/ou un gain laser plus élevé peuvent être nécessaires pour atteindre un rapport signal/bruit suffisant.
   3. Trouvez la puissance laser minimale qui donne une image propre et à fort contraste en mode « Live ».
4. Définissez la taille des pixels et le temps d’attente.
   1. Pour capturer la résolution améliorée, réglez la taille des pixels pour satisfaire le critère de Nyquist : taille des pixels ≤(résolution désirée / 2,3). Pour le mode SR (cible 120 nm), réglez la taille des pixels ≤~52 nm.
   2. Utilisez le bouton « Optimal » ou « Nyquist » du logiciel pour calculer cela automatiquement si disponible.
5. Acquérez l’image. Les données brutes contiennent des signaux multiplexés et ne sont pas encore super-résolues.
6. Traiter les données acquises pour obtenir une superrésolution :
   1. Naviguez vers le module de traitement du logiciel.
   2. Sélectionnez le jeu de données et sélectionnez la fonction « SuperResolution Processing ».
   3. Commencez par les réglages « Auto ». Pour les données lowSNR, ajustez manuellement « Strength » et « Noise Filter » pour améliorer la netteté sans introduire d’artefacts.
   4. (Optionnel) Pour la plus haute fidélité, surtout dans les piles 3D, appliquez une étape supplémentaire de déconvolution conjointe (jDCV).
   5. Exécutez le traitement. Comparez les vues traitées et non traitées pour vérifier l’amélioration des détails réels.
7. (Optionnel) Pour une comparaison quantitative du rapport signal/bruit (SNR) entre les modes :
   1. Acquérir des images du même échantillon dans différents modes.
   2. Dans les logiciels d’analyse, on définit une région d’intérêt (ROI) sur une structure uniforme et on mesure l’intensité moyenne du signal.
   3. Définir un ROI de fond et mesurer l’écart-type de l’intensité de fond.
   4. Calculer SNR = (signal moyen) / (écart-type du fond).
8. (Optionnel) Pour la mesure empirique de la résolution du système à l’aide de billes fluorescentes :
   1. Préparez un échantillon de billes fluorescentes de 100 nm.
   2. Obtenez un Zstack d’une bille isolée en mode SR avec échantillonnage de Nyquist.
   3. Traiter la pile avec superrésolution et (optionnellement) jDCV.
   4. Utilisez l’outil « PSF Measurement » du logiciel pour ajuster une Gaussienne 3D et enregistrez la largeur complète à la moitié des valeurs maximales (FWHM).

Results

Imagerie à fluorescence multicolore
L’imagerie à fluorescence multicolore des cellules COS7 fixes a été réalisée comme décrit à la Section 3. Des anticorps contre la α-tubuline (microtubules) et le TOMM20 (mitochondries) ont été utilisés avec la contre-coloration nucléaire DAPI. Comme montré à la Figure 1, les noyaux (bleus), mitochondries (vert, Alexa Fluor 488) et microtubules (rouge, Alexa Fluor 568) étaient clairement délimités avec u...

Discussion

Le protocole intégré présenté ici fournit une feuille de route complète pour mettre en œuvre les capacités d’imagerie avancées d’un système moderne de microscope confocal équipé d’un détecteur à super-résolution à réseau multiplexé, dans un cadre durable de ressources partagées. Cette section synthétise les aspects critiques de la méthode, sa mise en œuvre pratique et sa position dans le domaine de la bioimagerie. La réussite de l’exécution de ce protocole dépend de plusieurs étapes clés...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
; Cellules COS7	ATCC (ou équivalent)	CRL-1651	Lignée cellulaire de fibroblastes rénaux de singe vert africain. Utilisé pour la préparation d’échantillons à cellules fixes pour l’imagerie multicolore super-résolution   ;
; IgG anti-souris Donkey, conjugué Alexa Fluor 568	Invitrogen (ou équivalent)	A10037	Anticorps secondaire pour la coloration des microtubules. Utilisé à 1:500 de dilution
; Dulbecco » s Médium Eagle modifié (DMEM), glycémie élevée	Gibco (ou similaire)	11965092	Milieu de culture standard pour cellules COS7, complété avec un FBS à 10 %.
; Sérum fœtal bovin (FBS), inactivé par la chaleur	Gibco (ou similaire)	10082147	Supplément sérique utilisé à 10 % (v/v) dans tous les milieux de culture cellulaire.
; Antenne d’imagerie à fond de verre (35 mm, µ-Dish, #1,5 Couche polymère de protection, épaisseur 0,17 mm)	Ibidi (ou similaire)	81156	Substrat pour le plaquage cellulaire et l’imagerie. Essentiel pour la compatibilité avec les objectifs d’immersion en huile à haute teneur d’énergie nucléaire.
; Traitement d’image & logiciel d’analyse (modules ZEN)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (bleu)	Utilisé pour la reconstruction 3D, le traitement en super-résolution (par exemple, le traitement Airyscan), la mesure de la PSF et l’analyse SNR.
; ImageJ / Fidji	Open Source	N/A	Utilisé pour la reconstruction 3D supplémentaire, la génération de vues orthogonales et l’analyse générale des images.
; Huile d’immersion (Indice de réfraction = 1,518)	Carl Zeiss (ou similaire)	444960-0000-000	Pour une utilisation avec des objectifs d’immersion à l’huile (par exemple, 63x/1,4 NA).
; Système de microscope confocal à balayage laser avec détecteur à réseau multiplex (par exemple, ZEISS LSM 900 avec Airyscan 2)	Carl Zeiss AG	LSM 900 (Airyscan 2)	La plateforme d’imagerie principale utilisée pour tous les modes confocaux et super-résolution décrits dans le protocole.
; Médium Essentiel Minimum (MEM) avec Earle' s Salts	Gibco (ou similaire)	11095080	Milieu de culture standard pour les cellules Hep3B, complété par 10 % de FBS.
; Anticorps monoclonal anti-alpha--tubuline de souris (Clone DM1A)	Sigma-Aldrich (ou similaire)	T6199	Anticorps primaire pour le marquage des microtubules. Utilisé à 1:500 de dilution
; Paraformodéhyde (PFA), 4 % dans PBS	; Jinpan  ; (ou similaire)	TBS5083	Fixateur pour les cellules. À utiliser à température ambiante pendant 15 minutes. Manipulez cela avec les précautions appropriées.
; Médium d’imagerie sans rouge de phénol	Gibco (ou similaire)	21063029	Milieu à faible autofluorescence utilisé pour l’imagerie de cellules vivantes. Pré-équilibré avec 5 % de CO2 à 37 °C ; C avant utilisation.
; Solution saline tamponnée phosphate (PBS), 1X, pH 7,4	CellWorld (ou équivalent)	C0162-311	Utilisé comme tampon de lavage et de dilution tout au long du protocole.
; Fixation antifade en or ProLong	Invitrogen (ou équivalent)	P36930	Milieu de montage durci pour préserver la fluorescence dans des échantillons fixes.
; Triton X-100	Sigma-Aldrich (ou similaire)	T8787	Utilisé à 0,1 % (v/v) pour la perméabilisation cellulaire
; Préadolescent-20	Sigma-Aldrich (ou similaire)	P9416	Utilisé à 0,05 % (v/v) dans le PBS (PBST) pour les étapes de lavage après l’incubation des anticorps.
Albumine sérique bovine (BSA), fraction V	Sigma-Aldrich (ou similaire)	A7906	Utilisé à 1 % (p/v) dans le PBS pour le blocage et comme composant du tampon de dilution d’anticorps.
DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole)	Sigma-Aldrich (ou similaire)	D9542	Contre-stain nucléaire. Utilisé à une concentration finale de 1 & micro ; g/mL.
Anti-IgG de l’âne, conjugué Alexa Fluor 488	Invitrogen (ou équivalent)	A21206	Anticorps secondaire contre la coloration mitochondriale. Utilisé à 1:500 de dilution
Microsphères fluorescentes (billes), diamètre de 100 nm	Invitrogen (par exemple, TetraSpeck&trade ;) ou similaires	T7279	Utilisé pour la mesure empirique du système fonction de dispersion de points (PSF) et résolution.
Cellules Hep3B exprimant de manière stable les mitochondries d’EGFP	IMMOCELL	IM-H367	Lignée cellulaire d’hépatomes humains, conçue pour exprimer de manière stable l’EGFP ciblant la matrice mitochondriale. Utilisé pour l’imagerie en accéléré de cellules vivantes.
Solution tampon HEPES, 1 M	Gibco (ou similaire)	15630080	Utilisé à une concentration finale de 25 mM dans un milieu d’imagerie pour la stabilisation du pH lors d’images en direct, à l’extérieur d’un incubateur CO2.
Verre de couverture haute précision (#1,5, 0,17 mm d’épaisseur)	Marienfeld (ou équivalent)	107052	Utilisé pour monter des échantillons fixes.
Logiciel d’exploitation pour microscope (par exemple, édition ZEN blue)	Carl Zeiss AG	ZEN 3.5 (bleu)	Utilisé pour le contrôle système, l’acquisition d’images et le traitement de base.
Objectif : Plan-apochromat 63x/1.40 NA Oil DIC	Carl Zeiss AG	421462-9900-000	Objectif principal utilisé pour l’imagerie haute résolution.
Anticorps polyclonal anti-TOMM20 de Rabbit	Abcam (ou équivalent)	ab186735	Anticorps primaire pour le marquage des mitochondries. Utilisé à dilution 1:1000   ;