In Vitro Évaluation des effets potenciatrics des molécules d’origine végétale sur les biocides conventionnels

Résumé

Ce protocole fournit un cadre systématique pour évaluer comment les phytochimiques peuvent renforcer les effets bactéricides des biocides traditionnels en utilisant la modélisation de l’activité bactéricide et des tests d’interaction combinatoire, qui visent à identifier des mélanges synergiques améliorant le contrôle microbien et réduisant l’utilisation globale de biocides.

Résumé

Développer des approches innovantes et efficaces pour renforcer l’activité antimicrobienne des biocides conventionnels est une stratégie prometteuse pour améliorer le contrôle microbien à des fins de désinfection en santé. Dans ce contexte, nous décrivons un protocole détaillé pour évaluer les effets potenciaisateurs des phytochimiques d’origine végétale sur les biocides synthétiques. Ces produits d’origine végétale sont des candidats attrayants comme adjuvants biocides en raison de leur diversité structurelle, de leur bioactivité et souvent de leur toxicité plus faible. Le flux de travail décrit ici permet de déterminer les concentrations bactéricides minimales (MBC) et de générer systématiquement à la fois des courbes dose-réponse et temps-réponse pour chaque produit testé individuellement (biocides et phytochimiques) et pour leurs combinaisons doubles ou triples. Les données obtenues permettent une modélisation mathématique avancée, notamment la détermination de l’indice fractionnaire de concentration bactéricide (FBCI) et l’évaluation des interactions entre les produits testés concernant les effets synergiques, additifs ou antagonistes à l’aide du logiciel Combenefit. En ce sens, il est possible d’identifier des produits naturels prometteurs comme des agents d’amélioration des biocides, d’optimiser l’efficacité des antimicrobiens et de concevoir des stratégies de désinfection plus durables et plus sûres susceptibles de réduire les concentrations requises des biocides synthétiques. Cela améliore le contrôle microbien et minimise les risques environnementaux et sanitaires associés à une utilisation excessive de biocides.

Introduction

Les infections associées aux soins de santé (IAA) comptent parmi les défis de santé publique les plus critiques et préoccupants dans le^{monde 1}. De manière alarmante, ils sont fortement associés à la propagation de micro-organismes multirésistants aux médicaments (MDR) et à la persistance de la charge biologique bactérienne à la surface des hôpitaux, souvent en raison de pratiques de désinfection inappropriées^{ou inefficaces 2,3}. De plus, la contamination croisée entre patients, personnel de santé et équipements médicaux amplifie encore ce^{problème 4,5}. En Europe, par exemple, on estime que près de 80 000 patients hospitalisés souffrent d’au moins un HAI chaque jour, ce qui représente environ 16 millions de jours d’hospitalisation supplémentaires chaque^{année 2}. La pandémie de COVID-19 a encore compliqué cette situation, contribuant à une augmentation des infections bactériennes MDR en raison de l’utilisation élevée d’agents antimicrobiens/désinfectants et de l’augmentation des^{hospitalisations 6,7}. L’essor des bactéries résistantes aux antibiotiques, notamment Escherichia coli productrice de β-lactamase à spectre étendu (ESBL) et le Staphylococcus aureus résistant à la méthicilline (SARG), a conduit à une charge sanitaire et économique croissante dans le monde. En fait, ces souches soulignent l’urgence de développer des solutions innovantes pour la prévention et le contrôle des^{infections 1,8,9}.

Dans cette optique, les biocides sont devenus des outils cruciaux pour contrôler la propagation des bactéries résistantes et des infections bactériennes, étant largement appliqués pour désinfecter les surfaces hospitalières, stériliser les équipements, traiter les systèmes d’eau et prévenir la contamination des dispositifs^{médicaux 10,11}. Contrairement aux antibiotiques, qui agissent sur des cibles microbiennes^{spécifiques 12}, les biocides perturbent simultanément plusieurs structures cellulaires, y compris les membranes, les enzymes, l’ARN ribosomique et les voies métaboliques 13,14,15. Cette action à large spectre était initialement considérée comme réduisant le risque de résistance. Cependant, les preuves montrent que les micro-organismes peuvent s’adapter à l’exposition au biocide, ce qui conduit à une tolérance, une persistance, voire une résistance croisée aux^{antibiotiques 10,16}. Par exemple, l’exposition de Pseudomonas aeruginosa au chlorure de benzalkonium a été sélectionnée pour des variantes résistantes à la ciprofloxacine et à la novobiocine par surexpression des pompes d’efflux¹⁷. De même, le triclosan a montré qu’il active les pompes d’efflux chez Stenotrophomonas maltophilia, tandis que l’exposition à la chlorhexidine a été associée à une résistance accrue aux antibiotiques chez S. aureus¹⁸.

De plus, les composés ammonium quaternaires (QAC), la chlorhexidine, les diamidines, les acridines et le triclosan ont été identifiés comme causes possibles de la sélection et de la persistance de la résistance bactérienne à plusieurs^{antibiotiques 19,20}. Des gènes de résistance tels que qacA/B et SMR sont connus pour conférer une tolérance aux QAC, et des échecs cliniques tels que la bactériémie liée à des cathéters stockés dans des solutions contaminées de QAC et la contamination microbienne intrinsèque des iodophores ont également été^{rapportées 16,17,21}. Ces résultats soulignent l’urgence d’optimiser l’utilisation du biocide, soutenue par des études mécanistes et des stratégies rationnelles de désinfection.

Les biofilms, qui sont des communautés bactériennes à haute densité cellulaire et bien structurées intégrées dans une matrice extracellulaire de polysaccharides, protéines et acides nucléiques, constituent un obstacle supplémentaire et significatif au contrôle des^{infections 22,23}. Ils présentent une tolérance remarquable aux antibiotiques et aux biocides, contribuant à la persistance des infections chez les patients. De plus, les biofilms sont souvent associés à la contamination persistante des dispositifs médicaux, des instruments chirurgicaux et des surfaces^{hospitalières 24}. Malgré leur importance clinique, les biofilms n’ont été reconnus que ces dernières décennies comme des contributeurs majeurs aux infections chroniques et à la résistance aux antimicrobiens. Leur résilience est telle que même les agents désinfectants agressifs ne parviennent souvent pas à les éradiquer, laissant derrière elles des cellules persistantes capables de réensemencer l’infection^{20, 25, 26}. Par conséquent, trouver des stratégies efficaces d’antibiofilms est crucial pour contrôler les IAA et réduire le fardeau sanitaire et économique des agents pathogènes^{MDR 27,28}.

En tant que solution prometteuse, les phytochimiques, qui sont des métabolites secondaires produits et extraits des plantes, représentent une ressource largement inexploitée pour de nouveaux agents antimicrobiens et antibiofilms²⁹. Cependant, aucun phytochimique n’est utilisé comme antibiotique, en raison de son activité antimicrobienne modeste comparée aux antibiotiques conventionnels. Les phytochimiques sont couramment classés comme antimicrobiens sur la base de tests de susceptibilité qui produisent la concentration inhibitrice minimale (CMI) comprise entre 100 et 1000 μg/mL, ce qui est bien plus élevé que ceux des antibiotiques^{conventionnels 30,31}. Il est important de noter que les phytoproduits chimiques ont déjà démontré une activité antibiofilm lorsqu’ils sont utilisés seuls ou comme potentisateurs des biocides conventionnels. Par exemple, la quercétine peut inhiber la production d’alginate, entraînant une diminution de l’adhésion lors du développement du biofilm 32,33,34. L’émodine a inhibé le développement de biofilms par P. aeruginosa, E. coli et S. aureus en diminuant l’expression des gènes clés impliqués dans la formation des biofilms³⁵. La combinaison de phytochimiques avec des biocides utilisés de manière conventionnelle mais de plus en plus inefficaces, en tant qu’agents modifiant la résistance, représente une stratégie prometteuse pour renforcer l’efficacité^{antimicrobienne 36}. De telles interactions synergiques peuvent interférer avec les mécanismes de résistance microbienne, réduisant les concentrations minimales efficaces de biocides nécessaires pour obtenir une désinfection^{satisfaisante 37}. Cette approche optimise la performance du biocide, réduit la pression sélective pour le développement de résistance, et diminue les impacts écologiques et toxicologiques associés à une application excessive de^{biocide 15,20}. Les phytochimiques sont structurellement divers 38,39,40, largement disponibles 38,39,41, bon marché 38,39,42, et souvent moins toxiques pour l’homme et l’environnement que les biocides^{synthétiques 38,39}. Ce sont des produits naturels souvent dérivés de sources végétales renouvelables et, dans certains cas, ils ont montré une persistance environnementale plus faible et des profils de toxicité réduits par rapport à certains biocides^{synthétiques} 43,44,45. Bien que leurs profils de coût, de disponibilité et de toxicité varient selon le composé et le procédé d’extraction, plusieurs phytochimiques ont démontré des caractéristiques de sécurité et environnementales favorables par rapport à certains biocides^{conventionnels 46,47}.

Ce protocole vise à évaluer le potentiel des phytochimiques, individuellement et en combinaison avec les biocides conventionnels, pour la désinfection des soins de santé. En résumé, le protocole évalue les interactions biocide-phytochimique sur de larges plages de concentrations. Les biocides ont d’abord été testés entre 0,1 et 500 mg/L et les phytochimiques entre 50 et 10 000 mg/L afin de déterminer les concentrations bactéricides minimales (MBC) (Tableau 1). Pour les combinaisons doubles, les concentrations sous-bactéricides ont été sélectionnées comme suit : chlorure de benzalkonium (BAC) à 0,1, 0,5 et 0,75 mg/L ; acide peracétique (PAA) à 0,1, 0,3 et 0,5 mg/L ; acide salicylique (SAL) à 50, 100 et 250 mg/L ; et eugénol (EUG) à 100, 250 et 750 mg/L (Tableau 1). Des combinaisons triples ont été réalisées en utilisant un taux d’alcoolémie (0,75 mg/L) ou un PAA (0,5 mg/L) combiné à la SAL (100 ou 250 mg/L) et à l’EUG (250 ou 750 mg/L) (Tableau 1). Des tests de réponse temporelle ont été réalisés sur 1 à 90 minutes, suivis d’une évaluation de la repousse bactérienne sur 24 heures. Les interactions antimicrobiennes sont quantifiées à l’aide de l’indice fractionnaire de concentration bactéricide (FBCI) et analysées avec le logiciel Combenefit, tandis que la cinétique de désinfection est modélisée à l’aide des modèles de Chick-Watson et Weibull pour caractériser la dépendance à la concentration et la dynamique d’inactivation.

L’innovation réside dans la conception rationnelle d’interactions duales et triples stables entre phytochimiques et biocides, optimisant l’activité de désinfection tout en minimisant la toxicité et l’impact environnemental en raison d’une utilisation réduite des biocides conventionnels. Des approches mathématiques telles que le calcul du FBCI et l’évaluation de la synergie ont également été utilisées pour quantifier les interactions phytochimie-biocide dans le contrôle microbien. Alors que le FBCI offre une interprétation catégorique de l’interaction (synergie, antagonisme ou indifférence) à des combinaisons de concentration spécifiques, Combenefit permet une évaluation plus complète, basée sur la surface de la réponse, des schémas d’interaction sur une gamme de concentration plus large. Cela permet de visualiser et de quantifier les effets d’interaction dépendants de la concentration qui peuvent ne pas être capturés par les indices à point^{unique 48,49}. De plus, la cinétique de désinfection est modélisée à l’aide^{des modèles} 50 de Chick-Watson (pour la dose-réponse) et de Weibull (pour la réponse temporelle). Ces modèles fournissent une modélisation cinétique de l’inactivation microbienne, en proposant des paramètres quantitatifs décrivant les taux de désinfection et le comportement de la courbe^{de survie 50}. Ils aident à déterminer si l’élimination suit une dynamique log-linéaire ou non linéaire et permettent une interprétation plus mécaniste des effets du traitement, qui va au-delà de la description du^{FBCI 51,52}.

Ce protocole garantit l’identification systématique de combinaisons prometteuses de phytochimies-biocides et le développement d’une stratégie efficace et durable pour la désinfection des soins de santé. Contrairement aux tests classiques de CMI ou à damier qui fournissent des mesures statiques des points finaux, ce protocole intègre la modélisation bactéricide dynamique et des analyses d’interaction pour capturer l’ampleur et la cinétique de la potentialisation. Bien que les tests classiques à damier fournissent des informations précieuses sur les interactions inhibitrices basées sur les critères de la CIM, ils se limitent aux mesures de croissance et aux indices d’interaction uniques. Le protocole décrit ici va au-delà de ce cadre en quantifiant l’activité bactéricide plutôt que l’inhibition de la croissance, en évaluant la repousse post-traitement pour évaluer les effets antimicrobiens durables, en évaluant à la fois les combinaisons biocide-phytochimique double et triple, en modélisant la cinétique de désinfection via les approches Chick-Watson et Weibull, et en appliquant l’analyse de la surface de concentration-réponse avec Combenefit. Cette stratégie multidimensionnelle permet une évaluation plus robuste et prédictive de la potentialisation biocide-phytochimique.

Protocole

REMARQUE : La méthodologie proposée a été adaptée de la norme européenne EN 1276⁵³.

1. Préparation de la culture

1. Cryopréservez les souches bactériennes testées, Escherichia coli CECT 434 et Staphylococcus aureus CECT 976, en les stockant dans des cryovials contenant du glycérol à 30 % (v/v) à -80 °C.
2. Pour la récupération, cultivez les bactéries dans des plaques d’agar de comptage de plaques (PCA) et laissez-les croître, pendant 24 heures à 25 °C, en incubant les plaques.
3. Préparez des cultures cultivées toute la nuit des souches étudiées en inoculant une colonie bactérienne à partir d’une plaque striée dans un bouillon de soja tryptique (TSB) pour atteindre la phase de croissance exponentielle (selon la courbe d’étalonnage obtenue aux étapes suivantes), puis incuber sur un incubateur secouant à 100 tr/min et 25 °C.
4. À l’aide d’un spectrophotomètre, obtenez une courbe d’étalonnage des unités formant la colonie (UFC)/mL en fonction de la densité optique à 600 nm (OD₆₀₀) pour chaque souche bactérienne dans les conditions de culture mentionnées précédemment.
   1. Cultivez une culture bactérienne toute la nuit dans du TSB à 25 °C avec agitation (100 tr/min).
   2. Préparez des dilutions en série de 10 fois de la culture dans une solution saline stérile (0,85 % de naCl en po/v).
   3. Mesurez le OD₆₀₀ de chaque dilution à l’aide d’un spectrophotomètre.
   4. Dilutions appropriées sur la plaque sur PCA. Incubez les plaques à 25 °C pendant 24 heures.
   5. Sélectionnez les plaques présentant entre 10 et 100 colonies et déterminez les valeurs correspondantes de CFU/mL.
   6. Tracez les valeurs de CFU/mL avec les lectures correspondantes OD₆₀₀ dans la plage linéaire (0,04–0,8).
   7. Effectuer au moins deux tests indépendants avec au moins deux répliqués. Effectuer une analyse de régression linéaire pour obtenir l’équation d’étalonnage.
   8. Utilisez l’équation résultante pour estimer les concentrations bactériennes lors des expériences ultérieures.
5. Centrifugez l’inocula à 3772 x g pendant 10 minutes, puis lavez une fois avec du phosphate tampon de solution (PBS) (8 g/L de NaCl, 0,2 g/L de KCl, 1,44 g/L de Na_{2HPO 4}, et 0,24 g/L de_{KH 2}PO₄).
6. À l’aide d’un spectrophotomètre, ajustez le OD₆₀₀ de l’inocula dans PBS à 1 x 10^{unités formant 8} colonies (UFC)/mL.

2. Préparation et contrôle des solutions moléculaires

1. Considérons la sélection, l’étude et la préparation des molécules testées comme suit : utiliser deux biocides – BAC et PAA (15 % (p/v) – et deux phytochimiques – SAL et EUG 99 %.
   REMARQUE : Le BAC a été choisi dans cette étude car il s’agit d’un QAC largement utilisé, efficace contre les bactéries par perturbation^{membranaire 54,55}. L’acide peracétique est un désinfectant oxydant à large spectre, de plus en plus utilisé pour la stérilisation d’instruments^{médicaux 56,57}. L’acide salicylique est un composé phénolique d’intérêt car il présente une activité antibactérienne et antibiofilm et influence la virulence bactérienne et les mécanismes de résistance aux antibiotiques, suggérant des rôles potentiels dans la désinfection et le contrôle^{microbien 58,59}. L’eugénol est un composé aromatique naturel terpénoïde/phénolique aux propriétés antimicrobiennes reconnues, qui peut agir comme une alternative plus sûre et écologique aux désinfectants^{synthétiques 60,61}.
2. Préparez l’alcoolémie et le PAA fraîchement dans de l’eau ultrapure.
3. L’EUG et le SAL dissous ont été dissous dans du diméthyle sulfoxyde (DMSO), garantissant que les cellules n’étaient jamais exposées à une concentration de DMSO supérieure à 5 %.
4. Préparez les concentrations testées en BAC, PAA, EUG et SAL, selon le tableau 1.
5. Préparez les concentrations testées dans des tubes centrifugeuses de 15 mL en ajustant les volumes de solution stock et de suspension cellulaire pour obtenir la concentration finale de molécules et la densité cellulaire souhaitées.
6. Pour tous les tests ultérieurs, inclure deux témoins négatifs : (i) bactéries sans traitement et (ii) bactéries exposées à 5 % de DMSO (car c’est la concentration maximale de DMSO à laquelle les cellules sont exposées tout au long des tests).

3. Exposition bactérienne au biocide ou à des phytochimiques

1. Ajoutez 1 mL de suspension à cellules à 1 mL d’eau ultrapure et attendez 2 minutes.
2. Ensuite, ajoutez 8 mL de biocide ou de solution phytochimique (dans de l’eau ultrapure ou du DMSO à 5 %) et faites couver sur un incubateur à 100 tr/min et 25 °C, pendant 30 minutes.
3. Mélangez les composés avec les cellules par vortex.

4. Neutralisation, dilution en série et plaquage

1. Effectuer la neutralisation de chaque biocide ou phytochimique à chaque concentration testée en utilisant la méthode de dilution-neutralisation et le neutralisant universel : 30 g/L de polysorbate 80, 30 g/L de saponine, 1 g/L de L-histidine, 3 g/L de lécithine et 5 g/L de thiosulphate de sodium dans un tampon phosphate de 0,0025 M.
2. Ajoutez 1 mL de l’échantillon à neutraliser à 8 mL de neutralisant universel et 1 mL d’eau^{ultrapure 53}.
3. Effectuer une dilution en série dix fois en ajoutant 100 μL d’une dilution spécifique à 900 μL de solution saline stérile pour obtenir la dilution suivante (répéter cela de la dilution ^10-1 à la dilution ^10-7), et déterminer les cellules survivantes sur les échantillons neutralisés en plaquant 10 μL de chaque dilution sur la PCA, selon la méthode de la plaque⁶².
4. Incubez les plaques à 25 °C sans agitation pendant 24 heures pour le nombre de cellules.
5. Les UFC ont été comptées visuellement pour les plaques contenant plus de 10 et moins de 100 colonies, et la concentration à laquelle une réduction complète de la culturabilité se produit est enregistrée comme le MBC. Selon l’équation (1), on calcule l’UFC/mL, où n est le nombre d’UFC comptés, SV est le volume d’échantillon plaqué (0,01 mL), et Dil est la dilution où les UFC ont été comptées.
   CFU/mL = n/(SV Dil) (1)
6. Évaluer la réduction logarithmique, la réduction logarithmique, selon l’équation (2), où X₀ et X correspondent respectivement à la CFU/mL des bactéries non traitées (témoins) et des bactéries traitées.
   Réduction logarithmique = log (X₀) - log (X) = log (_{X 0}/X) (2)

5. Évaluation des combinaisons doubles et triples

1. Appliquer la méthodologie décrite ci-dessus pour évaluer l’activité de toutes les combinaisons duales et triples possibles d’un biocide et d’un phytochimique (pour les combinaisons duelles) ou de deux phytochimiques (pour les combinaisons triples) afin de rechercher d’éventuels effets de potentialisation ou de synergie.
2. Considérons le choix de concentrations suivant : pour les combinaisons doubles, les concentrations testées pour le taux de taux d’alcoolémie étaient de 0,1, 0,5 et 0,75 mg/L ; pour les PAA étaient de 0,1, 0,3 et 0,5 mg/L ; pour les SAL étaient de 50, 100 et 250 mg/L ; et pour l’EUG étaient de 100, 250 et 750 mg/L (Tableau 1). Concernant la combinaison triple, la concentration testée pour le taux de taux d’alcoolémie était de 0,75 mg/L ; pour la PAA était de 0,5 mg/L ; pour la SAL étaient de 100 et 250 mg/L ; et pour l’EUG étaient 250 et 750 mg/L (Tableau 1).
3. Sélectionnez les concentrations, en choisissant celles évaluées lors du dosage-réponse pour chaque molécule ayant donné des effets non bactéricides.

6. Évaluation de la repousse bactérienne

1. Pour évaluer la capacité de repousse bactérienne, laissez les cellules microbiennes croître dans un milieu liquide pendant plus de 24 heures, à 25 °C et 100 tr/min, après traitement et neutralisation.
2. Effectuer une dilution en série dix fois, le placage, l’incubation des plaques PCA et la quantification de la CFU/mL en utilisant les mêmes techniques et conditions.

7. Interprétation des résultats combinatoires – Indice fractionnaire de concentration bactéricide (FBCI)

1. Interprétez les résultats de l’analyse combinatoire comme suit :
   1. Pour les combinaisons duales, FBCI = FBC(A) + FBC(B), où la concentration bactéricide fractionnaire de A, FBC(A), est le rapport entre le MBC de A dans la combinaison duale et le MBC de A seul (^combinaison MBC_A/MBC_A ^seul), et FBC(B) est le rapport entre le MBC de B en combinaison duale et le MBC de B seul (^combinaison MBC B/^{MBC B seul}) (Équation 3).
   2. Pour les triples combinaisons, FBCI = FBC(A) + FBC(B) + FBC(C), où FBC(A) est le rapport entre le MBC de A dans une triple combinaison et le MBC de A seul (^combinaison MBC_A/MBC_A ^seul), FBC(B) est le rapport entre le MBC de B dans la combinaison triple et le MBC de B seul (^combinaison MBC B/^{MBC B seul}), et FBC(C) est le rapport entre la MBC de C en combinaison triple et la MBC de C seule (^combinaison MBC C/^{MBC C seule}) (Équation 4).
   3. En appliquant la classification proposée par Fernandes et ^al.50, FBCI ≤ 0,5 correspond à la synergie, 0,5 < FBCI ≤ 1 indique l’additivité, 1 < FBCI ≤ 4 est classé comme indifférence, et FBCI > 4,00 est considéré comme antagonisme.
      FBC(A) + FBC(B) = (^{combinaison duale} MBC/MBC ^{A seul}) + (^combinaison duale MBC_B/^{MBC B seul}) (3)
      FBC(A) + FBC(B) + FBC(C) = (combinaison_{triple MBC A}/^{MBC A seul}) + (^{combinaison triple} MBC_B/MBC_B ^seul) + (^{combinaison triple} MBC_C/MBC_C ^seul) (4)

8. Procédure pour un test temps-réponse

1. Préparez les cultures nocturnes d’E. coli CECT 434 et S. aureus CECT 976 selon les conditions de croissance décrites précédemment (section 1).
2. Ajoutez 1 mL de suspension à cellules à 1 mL d’eau ultrapure et attendez 2 minutes. À ce stade, ajoutez 8 mL de solution biocida/phytochimique (dans de l’eau ultrapure ou 5 % de DMSO) pour atteindre les concentrations souhaitées pour chaque molécule : 1/4 x MBC et MBC, et pour la suspension bactérienne (en ajustant le OD), à 100 tr/min et 25 °C. Mélangez les molécules avec les cellules par vortex.
3. Évaluez les temps d’exposition suivants : 1, 3, 5, 15, 30, 45, 60 et 90 min.
4. Comme décrit dans la section 4, évaluez l’activité antimicrobienne en calculant la réduction logarthmithmique (CFU/mL) en logarthmithum (X/_{X 0}).
5. Effectuer le biocide ou la neutralisation phytochimique pour chaque paire de concentration/temps testée en utilisant la méthode de dilution-neutralisation et le neutralisateur universel, la dilution et le placage en série, comme décrit précédemment à la section 4.

9. Analyse des données combinatoires avec le logiciel Combenefit

1. Ouvrez le fichier « REPLICATE_TEMPLATE.xls » fourni, à https://sourceforge.net/projects/combenefit/files/ , pour garantir la bonne structure et mise en forme.
2. Organisez vos données en une matrice, selon le Tableau Supplémentaire 1, où :
   1. Augmentez les concentrations du produit A de haut en bas (de la rangée la plus basse à la plus haute numérotée). Inclure au moins trois concentrations différentes pour le produit A.
   2. Augmenter les concentrations du produit B de gauche à droite (de la colonne la plus basse à la plus haute numérotée) : Inclure au moins trois concentrations différentes pour le produit B.
   3. Représenter la rangée supérieure (produit A 0 mg/L) produit simple agent B.
   4. Représenter la première colonne (produit B à 0 mg/L) produit monoagent A.
   5. Représenter la cellule (0,0) comme étant le témoin non traité.
   6. Normaliser, pour chaque cas, les valeurs utilisées, à l’aide de l’équation (5), où le treat_0h est le logarithmite (CFU/mL) pour un traitement spécifique, immédiatement après l’exposition (0h) ; treat_24h est le logaritmte (CFU/mL) pour un traitement spécifique, 24 heures après l’exposition (repousse) ; control_0h est le logaritmte (CFU/mL) pour le contrôle correspondant (seules les cellules ou celles exposées à 5 % de DMSO), immédiatement après exposition (0 h) ; et control_24h est le logaritmte (CFU/mL) pour le témoin correspondant (seules les cellules ou celles exposées à 5 % de DMSO), 24 heures après l’exposition (repousse).
   7. Effectuez, dans tous les cas, l’énumération de l’UFC après une incubation de 24 heures d’échantillons plaqués sur PCA.
      (treat_0h - treat_24h)/(control_0h - control_24h) 100 (5)
      REMARQUE : Inclure les témoins/conditions non traitées qui définissent la viabilité de 100 % et un témoin positif qui définit l’inhibition maximale (optionnel) ; Utilisez uniquement les valeurs numériques, pas de formules ; Utilisez le même nombre de lignes et de colonnes sur les réplications ; Utilisez '.' pour les décimales.
3. Sauvegarder en .xls ou .xlsx.
4. Créez un fichier Excel pour chaque réplication, comme décrit précédemment et dans la Tableau Supplémentaire 1, et ajoutez tous les fichiers dans le même dossier.
5. Ouvrez le logiciel Combenefit (Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, version 2.021, disponible sur https://sourceforge.net/projects/combenefit/).
6. Téléchargez ce dossier sur le Combenefit.
   1. Ouvre le logiciel Combenefit
   2. Appuyez sur Sélectionner dossier projet et choisissez le bon dossier.
   3. Sélection du modèle de référence : additivité de Loewe qui suppose le mécanisme exact pour les deux produits ; Bliss indépendance qui suppose une action indépendante, ou HAS, qui est un modèle conservateur (compare la combinaison au meilleur agent unique). La meilleure pratique consiste à utiliser au moins deux modèles et à choisir le meilleur.
   4. Dans ce cas, le modèle de Bliss a été choisi, compte tenu du mode d’action des molécules testées.
   5. Sélectionnez les sorties graphiques souhaitées, sachant que vous devez en sélectionner au moins une autre pour la distribution Synergy.
   6. Analyse des presses (Figure supplémentaire 1). Conseil : Dans la fenêtre Choisir l’enregistrement pendant l’analyse, sélectionnez Tout pour enregistrer toutes les sorties graphiques résultantes dans le dossier original.

10. Application des modèles Chick-Watson et Weibull aux données de dosage et de réponse temporelle

1. Préparez vos données en formatant le jeu de données dans Excel ou CSV avant l’importation : pour la dose-réponse, la colonne A correspond à la dose (concentration, mg/L) et la colonne B correspond au logaritmo (X/X₀) ; Pour les données de réponse en temps, la colonne A correspond au temps (minutes) et la colonne B correspond au logaritme (X/X₀).
2. Sauvegardez votre fichier dans « .csv » ou copier-collez directement dans Prism.
3. Open GraphPad Prism (version utilisée : 9.0 pour Windows 11 ; La Jolla, Californie, États-Unis).
4. Dans Nouvelle table et graphique, sélectionnez XY, et dans la table des données, sélectionnez Entrer ou importez les données dans une nouvelle table (Figure supplémentaire 2).
5. Dans Options, pour X, sélectionnez Nombre, pour Y sélectionnez Entrer des valeurs répliquées dans des sous-colonnes côte à côte, puis appuyez sur Créer (Figure supplémentaire 2).
6. Entrez les données dose/temps dans X et enregistrez les données de survie dans Y.
7. Allez dans Analyser, Régression non linéaire (ajustement de courbe), sélectionnez les ensembles de données que vous souhaitez analyser, puis appuyez sur OK (Figure supplémentaire 2).
8. Sélectionnez Nouveau puis Créer une nouvelle équation.
9. Dans Équation, pour le type d’équation, choisissez Équation explicite : Y = une fonction de X et des paramètres ; pour le nom, écrivez Modèle Chick-Watson/Modèle Weibull ; et dans la définition, écrire Y = -a*x^(n)*30 modèle de Chick-Watson (Figure supplémentaire 3) et Y = -1/(2,303)*(x/a)^(b) pour le modèle de Weibull (Figure supplémentaire 4).
   REMARQUE : Le modèle de Chick-Watson est exprimé par l’équation 6, où X₀ et X sont l’UFC/mL pour les bactéries non traitées (témoins) et les bactéries traitées, C est la concentration (dose), k_dis est le coefficient du taux d’inactivation, C est la concentration (dose), n est l’exposant de concentration, et t est le temps d’exposition (dans ce cas, 30 min)⁵⁰. Le modèle de Chick-Watson a été appliqué pour observer la dose-réponse et caractériser la relation entre la concentration de désinfectant et la réduction microbienne.
   log (X/X₀) = -_{k dis} · Cⁿ · t (6)
   REMARQUE : Le modèle de Weibull est exprimé par l’équation 7, où X₀ et X sont l’UFC/mL pour les bactéries non traitées (témoins) et les bactéries traitées, t est le temps, α est le paramètre d’échelle (temps caractéristique), et β est le paramètre de forme⁵⁰. Le modèle de Weibull a été appliqué pour observer la réponse temporelle et caractériser la forme des courbes de survie. Le paramètre d’échelle représente le temps caractéristique d’inactivation, tandis que le paramètre de forme décrit les écarts par rapport au comportement log-linéaire (β = 1 log-linéaire ; β < 1 queue ; β > une épaule).
   logaritme (X/_{X 0}) = -1/2,303 (t/α)^β (7)
10. Dans les rôles pour les valeurs initiales, choisissez 0 comme valeur initiale pour chaque paramètre et (valeur initiale, à ajuster) comme règle (Figure supplémentaire 5).
11. Gardez le reste des paramètres par défaut et appuyez sur OK.
12. Effectuez l’ajustement et inspectez les paramètres estimés.

11. Réplication biologique

1. Effectuez, pour tous les tests, au moins deux expériences indépendantes avec au moins deux répliqués.

Résultats

Cette étude a évalué l’activité bactéricide des quatre composés testés — BAC, PAA, SAL et EUG — par rapport à E. coli CECT 434 et S. aureus CECT 976. Comme montré dans les figures 1 et 2, BAC, PAA, SAL et EUG ont montré un effet apparent dépendant de la concentration sur la cultivabilité. Le tableau 2 présente les valeurs de MBC pour les molécules testées après exposition et 24h après expositio...

Discussion

Le protocole présenté dans cette étude fournit un cadre intégré pour évaluer l’activité bactéricide de deux biocides couramment utilisés – BAC et PAA – et de deux phytochimiques prometteurs – EUG et SAL – individuellement et en combinaison (combinaisons doubles et triples), face à E. coli et S. aureus. Plusieurs étapes de ce protocole sont particulièrement cruciales pour garantir la reproductibilité et une interprétation précise des interactions antimicrobiennes. Cela inclut la standardi...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Chlorure de benzalkonium   ;	Merck, Espagne	8.14363.0100	Biocide
Mega Star 600R centrifugée	VWR, États-Unis	VWR Mega Star 600R	-
Combenefit - Version 2.021	Cancer Research UK Cambridge Institute, Cambridge, Royaume-Uni	-	Logiciels pour l’évaluation du synergisme
Cuvettes	VWR, Allemagne	VWRI634-0678	1,5 mL cuvettes pour l’ajustement de la densité optique
Eau détruite	-	-	Pour la préparation aux médias
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)	VWR, France	23500.322	Solvant organique
Boucles d’inoculation jetables	VWR, Italie	VWRI612-9357	10 & mu ; Boucles d’inoculation en L
Tubes d’Eppendorf	VWR, Chine	VWRI525-1164	1,5 mL tubes à verrouillage eppendorf   ;
Escherichia coli	Collection de culture de type espagnol (CECT)	434	Souche de référence utilisée dans cette étude
Éthanol	VWR, France	83813.36	Pour la désisfection de la pièce, du matériau et des mains
Eugénol 99 %	Sigma-Aldrich, États-Unis	163333	Phytochimique
Tubes Falcon	VWR, États-Unis	VWRI525-1085	Tubes Falcon de 15 mL
Tubes Falcon	VWR, Belgique	VWRI525-1109	Tubes Falcon de 50 mL
GraphPad Prism 9.0 pour Windows 11	La Jolla, Californie, États-Unis	-	Logiciels pour l’analyse mathématique et statistique
Lécithine	Alfa Aesar, Allemagne	Q04A010	-
L-histidine	Merck, États-Unis	1.04351.0025	-
Incubateur orbital	VWR, États-Unis	VWR 5000I Shaker incubateur 230V	-
Acide peracétique 15 %	AppliChem, Allemagne	143495-1211	Biocide
Plaques de Petri	VWR, Italie	VWRI391-0582	-
Pipette 1 - 10 mL	VWR, États-Unis		-
Pipette 100 - 1000 & mu ; L	VWR, États-Unis		-
Pointes de pipette 100 à 1000 et mu ; L	Frilabo, Portugal	1-202-50-0	-
Pippette 20 - 200 & mu ; L	VWR, États-Unis		-
Pointes de pipette 1 - 10 mL	VWR, Belgique	VWRI613-7094	-
Pointes de pipette 2 - 200 & mu ; L	VWR, Mexique	VWRI613-6418	-
Agar de comptage de plaques	VWR, Belgique	84608-0500	Isolement et culture des micro-organismes
Polysorbate 80	VWR, États-Unis	20E2756726	-
Chlorure de potassium - KCl  ;	VWR, Belgique	11D110008	-
Phosphate de dihydrogène de potassium - KH2PO4	VWR, Allemagne	26931.263	-
Acide sacilique	Sigma-Aldrich, États-Unis	84210-500G	Phytochimique
Saponine	VWR, Allemagne	21A124103	-
Chlorure de sodium - NaCl	VWR, Belgique	27788.297	-
Phosphate d’hydrogène sodique - Na2HPO4	VWR, Belgique	28026.26	-
Sodium Thiosulphate - Na2S2O3	VWR, États-Unis	18D2056589	-
Spectrophotomètre	VWR, États-Unis	Spectrophotomètre UV-1600PC	Ajustement de la densité optique
Staphylococcus aureus	Collection de culture de type espagnol (CECT)	976	Souche de référence utilisée dans cette étude
Bouillon de soja tryptique   ;	Merck, Allemagne	1.05459.0500	Isolement et culture des micro-organismes
Eau ultrapure	-	-	Pour la préparation de l’échantillon