Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.

Article de méthode

Myographie du fil pour l’aorte dorsale et les artères de résistance mésentérique chez les souris et les rats

574 vues

⸱

DOI :

10.3791/70186

⸱

27 février 2026

 ,  ,  , 
1Department of Physiology and Pharmacology, Center for Hypertension and Personalized Medicine, University of Toledo, College of Medicine and Life Sciences

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous fournissons un protocole détaillé pour la myographie par fil côte à côte afin d’évaluer la réactivité vasculaire dans les artères conduit versus résistance isolées chez des souris et des rats.

Résumé

La myographie par fil est une technique ex vivo largement utilisée pour l’évaluation quantitative de la fonction vasculaire dans les artères isolées. Parce que les artères de grands conduits et de petites résistances diffèrent fondamentalement par leur structure et leur rôle physiologique, l’analyse parallèle des deux classes de vaisseaux à l’aide d’artères prélevées sur la même souris ou le même rat permet des comparaisons par des paires qui réduisent la variabilité interanimale et révèlent des changements fonctionnels spécifiques aux vaisseaux. Cet article présente un protocole étape par étape pour évaluer la réactivité vasculaire dans les artères isolées de conduits et de résistance muriennes à l’aide de la myographie isométrique par fil. Nous décrivons la préparation d’un tampon physiologique frais et oxygéné ; une dissection soigneuse, un nettoyage et un montage des segments artériels ; et la normalisation pour placer les vaisseaux proches de leur longueur optimale pour la génération active de forces. Un guide de dépannage et un exemple de séquence expérimentale pour générer des courbes concentration-réponse cumulatives pour les vasoconstricteurs et vasodilatateurs standards sont fournis. Ce protocole permet une mesure quantitative de la fonction endothéliale et musculaire lisse et facilite la détection des altérations spécifiques aux vaisseaux de la réactivité vasculaire associées aux maladies vasculaires, telles que l’hypertension.

Introduction

L’hypertension se caractérise par une réactivité vasculaire altérée, telle que la dysfonction endothéliale et l’hyperréactivité du muscle lisse vasculaire aux vasoconstricteurs1. Ces changements fonctionnels, associés à la remodelation microvasculaire et à la raréfaction, contribuent à une perfusion tissulaire altérée et à une dérégulation de la pressionartérielle 2,3,4. Les analyses ex vivo de vaisseaux isolés sont des outils puissants pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent le tonus vasculaire en santé et en maladie, car ils permettent un contrôle précis du microenvironnement vasculaire et une manipulation pharmacologique sélective des voies de signalisation du muscle lisse et de l’endothélium.

La réactivité vasculaire dans les artères isolées est couramment évaluée à l’aide de deux techniques complémentaires ex vivo : la myographie par fil et la myographie par pression 5,6. En myographie par fil, des anneaux ou segments de vaisseaux sont montés sur des broches ou des fils, et la force isométrique estenregistrée 7,8. En myographie sous pression, les segments de vaisseaux intacts sont canulés et pressurisés à une pression intraluminale définie, et le diamètre du vaisseau est suivi parvidéomicroscopie 9. Contrairement à la myographie par fil, la myographie par pression permet de contrôler la pression transmurale et l’écoulement intraluminal. Ainsi, il reproduit de plus près l’environnement hémodynamique in vivo des artères résistantes et est couramment utilisé pour étudier le tonus myogénique, les réponses médiées par le flux et les propriétés structurelles ou mécaniquesvasculaires 9,10. Inversement, la myographie par fil est techniquement plus facile à mettre en œuvre (pas de canulation ni de microscopie vidéo), permet un débit plus élevé grâce à des systèmes commerciaux multi-chambres, et est bien adaptée à la génération de courbes pharmacologiques reproductibles concentration-réponse dans des artères petites à moyennes de diamètres allant de l’ordre de dizaines à plusieurs centaines demicromètres 5,6. Ainsi, la myographie par fil est souvent préférée pour le profilage pharmacologique côte à côte de la réactivité vasculaire dans les artères de conduits et de résistance isolées chez des souris ou des rats.

Les artères conduit (grands élastiques) et les artères résistantes (petits muscles) diffèrent fondamentalement par leur structure et leur fonction, et ces différences dictent des considérations expérimentales distinctes et des objectifs finaux. Les artères conduites (par exemple, l’aorte thoracique descendante) contiennent de grandes quantités de tissu élastique et une masse musculaire lisse importante ; Les artères de résistance (par exemple, les artères mésentériques) présentent des rapports muscle/lumière lisses relativement plus élevés et sont des déterminants majeurs de la résistance périphérique et de l’autorégulationlocale 11,12. Parce que le même agoniste peut activer différentes réponses moléculaires dans ces lits vasculaires, la comparaison côte à côte des conduits et des vaisseaux de résistance du même animal fournit des informations complémentaires utiles. Par exemple, dans les artères conduitives, la libération d’oxyde nitrique dérivé de l’endothélium est la voie relaxante prédominante par laquelle l’acétylcholine (ACh) induit lavasorelaxation 13,14. En revanche, dans les artères à faible résistance, l’ACh induit une relaxation via l’oxyde nitrique, la prostacycline et, surtout, les facteurs hyperpolarisants dérivés de l’endothélium (EDHF)15,16. Ainsi, une myographie par fil côte à côte des artères de conduit et de résistance prélevées sur la même souris ou le même rat permet des comparaisons par des paires qui facilitent la détection des changements fonctionnels spécifiques au vaisseau tout en réduisant la variabilité interanimale.

L’interprétation précise des données de la myographie au fil dépend d’une attention attentive à un ensemble de variables techniques : composition et oxygénation de la solution physiologique de sel (PSS), manipulation et dissection des tissus, technique de montage, prétension au repos optimale (normalisation), température du bain et sélection des contrôles pharmacologiquesappropriés 6. La normalisation fait référence à la procédure technique consistant à régler le point de fonctionnement mécanique du navire afin d’optimiser le développement de la force active et d’approcher les conditions physiologiquesde fonctionnement 5. En pratique, pour les anneaux aortiques, il est courant d’utiliser une prétension fixe, souvent déterminée empiriquement pour éviter la surdistension tout en offrant des réponses stables. Pour les petites artères résistantes, la normalisation est réalisée en déterminant d’abord la circonférence interne correspondant à une pression transmurale équivalente de 100 mmHg (IC100). Le récipient est ensuite réglé à une fraction définie de cette valeur afin d’établir la circonférence interne normalisée (IC1). En pratique, de nombreux protocoles fixent IC1 proche de 0,9 × IC100 pour l’ARM chez le rat et environ 1,0 × IC100 pour l’ARM chez la souris, bien que ces valeurs puissent être ajustées en fonction du type de vaisseau, de l’espèce et des objectifsexpérimentaux 5,17.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Protocole

Le protocole suivant respecte les directives établies et a été approuvé par le comité des soins et de l’utilisation des animaux du campus des sciences de la santé de l’Université de Toledo.

ATTENTION Avant de commencer, veuillez suivre en permanence les directives du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC) et du Comité de biosécurité institutionnelle (IBC) ; utiliser des équipements de protection individuelle (EPI) appropriés ; faites preuve de prudence lors de l’utilisation d’instruments chirurgicaux ou d’autres instruments tranchants ; consulter et se conformer aux fiches de données de sécurité (FDS) pertinentes lors de la manipulation de produits chimiques et de tissus biologiques ; manipuler le carbogène comme une bouteille de gaz sous pression à l’aide de régulateurs approuvés et un stockage sécurisé ; et d’éliminer les déchets biologiques et chimiques selon les procédures institutionnelles.

1. Préparation du tampon PSS/Krebs bicarbonate de Krebs modifié (Krebs)

REMARQUE : Composition tampon de Krebs (concentrations finales, pH 7,4) : 130 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mMKH 2PO4, 1,6 mMCaCl 2, 25 mMNaHCO 3, 5,5 mM glucose et 0,03 mM EDTA.

  1. Préparez un stock de grand volume : dissoudez tous les constituants sauf leNaHCO 3, le glucose et leCaCl 2 dans de l’eau doublement distillée pour obtenir un stock. Conservez ce bouillon à 4 °C.
  2. Le jour de l’expérience, on aliquote le volume requis de stock (par exemple, 1 L), on ajoute séquentiellementNaHCO 3, glucose etCaCl 2, et on oxygéne continuellement avec du carbogène (95 %O 2/5 % CO2).
    REMARQUE : Pour minimiser les précipitations de sels de calcium, préparez et stockez un stock de 1 MCaCl 2 à 4 °C et ajoutez lentement le volume requis au tampon seulement après la dissolution complète deNaHCO 3 , tout en remuant continuellement. Maintenir la bulle des glucides lors de l’ajout de CaCl2 (voir étape 1.3) pour réduire la formation de carbonate de calcium. Si des précipitations visibles surviennent, jeter et préparer un nouveau tampon.
  3. Pour l’équilibre du pH, faites mousser le tampon avec du carbogène pendant au moins 20 minutes, puis mesurez le pH et ajustez à 7,4 si nécessaire.
    REMARQUE : pH typique de pré-bulle ≈ 7,7 ; le bouillonnement continu réduit le pH à ≈7,4 physiologiques.
  4. Préparez les chambres de myographe en les remplissant de tampon Krebs fraîchement préparé et commencez à faire bouillonner doucement avec du carbogène. Ajustez le taux de bulle pour garantir un échange gazeux adéquat sans agitation vigoureuse.
  5. Réservez un aliquote de tampon Krebs fraîchement préparé et oxygéné et refroidissez-le sur glace pour la dissection des tissus. Réchauffez le tampon oxygéné restant à 37 °C (avec des bulles continues de carbogènes) pour une utilisation lors des expériences.

2. Dissection de l’aorte thoracique descendante et de l’arcade mésentérique

  1. Euthanasiez l’animal selon les directives de l’IACUC. Standardisez le moment de l’euthanasie animale et de la prélèvement des tissus dans une fenêtre de 2 heures afin de minimiser les effets circadiens potentiels.
  2. Ouvrez immédiatement les cavités thoracique et abdominale via une incision médiane et réfléchissez latéralement la paroi thoracique pour exposer le cœur et les grands vaisseaux.
    REMARQUE : Ne pratiquez pas la perfusion systémique dans des conditions standard, car cela pourrait involontairement causer des lésions endothéliales. De plus, la retenue du sang dans les vaisseaux mésentériques améliore la discrimination visuelle entre artères et veines et facilite l’évaluation de l’intégrité artérielle. Cependant, dans certains modèles pathologiques (par exemple, troubles thrombotiques), une perfusion douce à basse pression avec un tampon physiologique héparinisé et glacé peut être conseillée pour éliminer les thrombes obstructifs tout en minimisant les lésions endothéliales.
  3. Retirer l’aorte thoracique descendante. Pour faciliter la dissection, retirez les poumons et l’œsophage afin d’améliorer la visualisation. Ne saisit pas directement l’aorte thoracique descendante ; Au contraire, tenez doucement l’arc aortique ou la graisse périadventiale, soulevez légèrement et sectionnez soigneusement les vaisseaux ramiques intercostaux en dessous de l’aorte. On excise l’aorte thoracique descendante en la coupant juste avant qu’elle ne traverse le diaphragme et on la place dans une boîte de Petri recouverte de Sylgard contenant un tampon de Krebs oxygéné et glacé.
    REMARQUE : Maintenez une température froide pour minimiser le son spontané et préserver la viabilité. Le Sylgard noir augmente le contraste pour la dissection des vaisseaux.
  4. Supprimez toute la salle d’arcade mésentérique. Soulevez doucement l’arcade mésentérique pour localiser l’artère mésentérique supérieure qui se ramifie de l’aorte caudale abdominale vers le diaphragme. Coupez l’artère mésentérique supérieure proximalement et libérez l’arcade mésentérique du tissu conjonctif environnant sans manipulation directe des vaisseaux. Placez l’arcade mésentérique dans une boîte de Petri séparée recouverte de Sylgard contenant un tampon de Krebs froid et oxygéné.

3. Isolement et montage des anneaux aortiques sur des myographes à broches

  1. Fixez les extrémités proximale et distale de l’aorte thoracique descendante avec des goupilles de dissection pour redresser le vaisseau. Évitez de trop vous étirer pour éviter des dommages mécaniques.
    REMARQUE : Placez des goupilles dans la graisse périadventiale plutôt qu’à travers la paroi du récipient pour minimiser les dégâts.
  2. Sous un stéréomicroscope avec une source lumineuse externe, retirez soigneusement la graisse périadventitiale et le tissu conjonctif à l’aide de ciseaux Vannas fins et des pinces. Éviter d’endommager la paroi du vaisseau.
    REMARQUE : Il est courant de retirer la graisse périadventitiale, sauf si l’objectif est d’étudier le rôle des tissus périvasculaires adventiaux dans la régulation du tonus vasculaire.
  3. Coupez des anneaux aortiques de 2 mm, en réalisant des coupes nettes et perpendiculaires. Jetez les anneaux qui sont perforés ou visiblement endommagés. Dans la mesure du possible, échantillonnez des lieux comparables entre les animaux pour minimiser la variabilité.
  4. Déconnectez une chambre contenant un tampon Krebs oxygéné de la machine de myographie et transportez-la soigneusement vers le stéréomicroscope.
    REMARQUE : Secouer la chambre peut affecter le transducteur et modifier les résultats, donc tenez la chambre avec précaution et placez-la délicatement.
  5. Sous le stéréomicroscope, utilisez le micromètre pour rapprocher les broches du myographe et faites glisser l’anneau aortique sur les broches, minimisant ainsi la manipulation de la surface luminale.
  6. Notez la lecture du micromètre avec l’anneau entièrement relâché ; Appliquez un léger étirement pour sécuriser le tissu au transport.
  7. Connectez la chambre à l’instrument et rétablissez le récipient à la lecture initiale du micromètre.
  8. Après que tous les anneaux sont montés, chauffez les chambres à 37 °C et surveillez la température avec la sonde fournie (généralement 20 à 30 minutes pour atteindre 37 °C).
  9. Zéro les relevés de force sur l’interface utilisateur, lance le logiciel d’acquisition de données et commence l’enregistrement.
  10. Appliquer progressivement la prétention aux anneaux aortiques à une valeur fixe appropriée au vaisseau à l’aide du micromètre.
    REMARQUE : Une valeur de prétension typique pour les anneaux aortiques de souris est de 5 milliNewtons (mN)5. Bien que les valeurs de prétension rapportées pour les anneaux aortiques de rats varient selon les études, l’optimisation antérieure permet une prétension de 10 mN dans ceprotocole 18.
  11. Équilibrez les anneaux aortiques pendant 45 à 60 minutes à la prétension sélectionnée, avec des changements répétés de tampon en utilisant des Krebs à 37 °C.
    REMARQUE : Il est courant que les anneaux aortiques perdent partiellement la tension et nécessitent donc plusieurs ajustements finis de la prétension à l’aide du micromètre avant que la tension ne se stabilise.
  12. Zéro les relevés de force sur l’interface utilisateur avant de commencer les protocoles expérimentaux.

4. Isolation et montage de la MRA sur des myographes à fil

  1. Épinglez l’arcade mésentérique dans le sens horaire pour redresser les branches mésentériques. Commencez par fixer le cécum, puis épinglez successivement les étirements successifs de l’intestin grêle dans le sens des aiguilles d’une montre pour tendre doucement le vasculaire mésentérique sans trop étirer. Remplacez le tampon par un Krebs neuf au besoin pour enlever le sang ou les débris.
  2. Identifiez l’artère mésentérique supérieure au centre de la plaque où les arcades irradiant.
  3. Sélectionner un ARM approprié pour l’isolement ; Cibles typiques : diamètre interne 200-250 μm (déterminé plus tard lors de la normalisation).
    REMARQUE : Chez les animaux adultes expérimentaux, cela correspond généralement aux branches de second ordre chez les souris et à3 à 4 branches de l’ordre 10e chez les rats. L’ordre des branches est défini par des bifurcations séquentielles à partir de l’artère mésentérique supérieure. Les branches du1er ordre proviennent directement de l’artère mésentérique supérieure, les branches du deuxième ordre proviennent des branches du 1er ordre, et ainsi de suite.
  4. Au stéréomicroscope, disséquez la veine accompagnante et retirez la graisse périadventitiale ainsi que le tissu conjonctif à l’aide de ciseaux Vannas et de pinces fines.
    REMARQUE : Les ARM peuvent être distingués des veines par leurs parois plus épaisses et leurs lumières plus petites, facilement visualisées par la présence de sang intraluminal résiduel.
  5. Relâchez les goupilles intestinales proches qui étirent la paroi intestinale adjacente au vaisseau sélectionné avant d’exciser l’artère afin d’éviter le recul du vaisseau.
  6. Retirer toute la longueur de l’ARM sélectionné (doit mesurer >2 mm de long), en effectuant des découpes nettes et perpendiculaires. À l’aide de pinces fines, saisissez une extrémité de l’artère et transférez-la dans une boîte de Petri propre contenant un tampon de Krebs glacé (les plats classiques, non recouverts de Sylgard, facilitent le montage ultérieur). Inspecter l’artère pour détecter des dommages ; La présence de sang intraluminal facilite l’évaluation visuelle de l’intégrité.
  7. Éciser un segment d’environ 2 mm d’une région intacte. Jetez toutes les zones manipulées lors du transport ou présentant des dommages visibles.
    REMARQUE : L’utilisation de plats transparents, non recouverts de Sylgard, permet de placer une règle sous la vaisselle pour mesurer avec précision la longueur du récipient.
  8. Préparez deux longueurs de 2,5 cm de fil d’acier inoxydable de 40 μm pour le montage.
  9. À l’aide de pinces fines, passez soigneusement les fils, un par un, à travers la lumière pour qu’il y ait suffisamment de fils qui dépassent des deux extrémités pour le montage. Minimiser les traumatismes endothéliaux. Après avoir inséré les deux fils, notez la longueur exacte avec une règle pour l’utiliser dans la procédure de normalisation (voir étape 5.2).
    REMARQUE : C’est l’une des étapes les plus techniquement exigeantes et les plus chronophages du protocole, et il nécessite de la patience et une pratique répétée pour minimiser les dommages endothéliaux. Après avoir inséré le premier fil, il est souvent plus facile de serrer les deux fils ensemble et de les faire avancer à travers le récipient.
  10. Déconnectez une chambre contenant un tampon Krebs oxygéné de la machine de myographie et transportez-la soigneusement vers le stéréomicroscope.
  11. Sous le stéréomicroscope, transférez les fils de maintien (MRA) à la chambre de myographe. À l’aide du micromètre, rapprochez les mâchoires du myographe pour serrer les extrémités du fil entre les mâchoires afin que l’artère soit suspendue librement entre elles.
    REMARQUE : À ce stade, il est conseillé de serrer les fils de façon à ce qu’ils reposent les uns sur les autres. Cela maintient les fils en place et empêche leur torsion.
  12. Fixez le fil supérieur sous les vis de fixation du côté du micromètre proche en enroulant les extrémités dans le sens des aiguilles d’une montre ; Répétez pour le second fil côté transducteur.
    REMARQUE : Serrez les vis doucement mais fermement. Si les vis sont trop lâches, le récipient peut glisser ; Si le fil ou le transducteur est trop serré, il peut être endommagé. Après avoir fixé la première extrémité, entrouvrez légèrement l’espace entre les mâchoires du myographe avant de fixer l’extrémité opposée pour assurer une tension homogène du fil.
  13. Écartez légèrement les mâchoires et alignez les fils pour qu’ils soient parallèles et coplanaires, presque en contact.
    REMARQUE : Effectuez tous les réglages des fils loin du récipient monté pour minimiser les dégâts.
  14. Montage répété pour tous les MRA.
  15. Chauffez les chambres à 37 °C et contrôlez la température (20-30 min en moyenne).
  16. Zéro les lectures de force sur l’interface utilisateur avant d’initier la procédure de normalisation.

5. Procédure de normalisation pour l’ARM

REMARQUE : Les anneaux aortiques sont montés à une prétention fixe et prédéfinie. Par conséquent, une étape de normalisation distincte n’est pas effectuée.

  1. Définir les paramètres de normalisation dans le logiciel d’acquisition de données : étalonnage de l’oculaire = 1 ; pression cible = 13,3 kPa (≈ 100 mmHg) ; circonférence interne normalisée (IC1) = 0,9 pour les ARM chez rats et 1,0 pour les ARM chez la souris ; temps moyen = 2 s ; délai = 60 s.
  2. Entrez les paramètres spécifiques au vaisseau dans le module de normalisation comme suit :
    1. Pour les extrémités tissulaires (mm) : fixer a1 = 0 et a2 = la longueur mesurée de l’ARM en millimètres (la longueur exacte enregistrée lors de l’excision).
    2. Diamètre du fil d’entrée : 40 μm.
    3. Lecture du micromètre : entrez la valeur de base du micromètre enregistrée avec le récipient monté et complètement détendu.
  3. Commencez la procédure de normalisation en étirant progressivement l’ARM monté par incréments de 50 μm. Après chaque étirement, entrez la nouvelle lecture du micromètre dans le module de normalisation et attendez 60 s entre les incréments.
    REMARQUE : Des chutes soudaines de tension après un ajustement micrométrique indiquent généralement un glissement du vaisseau. Les vis de fixation doivent être serrées doucement mais fermement.
  4. Attendez que le module de normalisation trace la tension de paroi au repos (mN/mm) par rapport à la circonférence interne (μm) et ajustez une courbe exponentielle. À l’aide du micromètre, continuez l’étirement par étapes jusqu’à ce que la courbe de tension-circonférence croise l’isobare de 100 mmHg. Près de l’intersection, réduisez la taille de la marche à 10-30 μm pour éviter de surétirer le récipient.
  5. Lorsque la courbe croise l’isobare de 100 mmHg, notez la circonférence interne calculée par logiciel et réglez le micromètre à la valeur correspondante calculée par le module afin que la préparation repose à la circonférence interne normalisée cible (IC₁).
    REMARQUE : Un mauvais ajustement de la courbe indique généralement des paramètres incorrects entrés dans le logiciel, tels que la longueur du tissu, le diamètre du fil ou les relevés du micromètre.
  6. Répétez la procédure de normalisation pour tous les ARM montés, puis laissez les vaisseaux s’équilibrer pendant 30 à 45 minutes avec des changements répétés de tampon en utilisant des Krebs à 37 °C.
  7. Zéro les lectures de force sur l’interface utilisateur juste avant de commencer les expériences.
    REMARQUE : Les différences de paramètres clés entre souris et rats sont résumées dans le tableau 1.
ParamètreMouseRat
Valeur de prétension pour les anneaux aortiques5 mN10 mN
Rapport IC1 de la cible pour l’ARM10.9
Ordre typique de branchement MRA pour un diamètre interne de 200 à 250 μm2e3eà 4e

Tableau 1 : Différences de paramètres clés entre souris et rats.

6. Protocole expérimental (exemple de séquence)

  1. Contrôle de viabilité : Provoquer une réponse contractile avec un défi dépolarizant à haut niveau de K⁺ (par exemple, 120 mM KCl).
    REMARQUE : Le tampon à haute teneur en K⁺ (KPSS) est préparé par substitution équimolaire du NaCl par du KCl du tampon Krebs standard pour maintenir l’osmolarité et est continuellement oxygéné avec 95 % d’O2/5 % deCO-2. Pour éviter le choc du froid, chauffez le KPSS à 37 °C avant utilisation. Composition tampon KPSS (concentrations finales, pH 7,4) : 120 mM KCl, 14,7 mM NaCl, 1,17 mM MgSO4, 1,18 mMKH 2PO₄, 1,6 mMCaCl 2, 25 mM NaHCO3, 5,5 mM glucose et 0,03 mM EDTA.
  2. Effectuer au moins trois lavages consécutifs avec un tampon Krebs oxygéné à 37 °C jusqu’à ce qu’une tension basale passive stable soit rétablie.
    REMARQUE : Toutes les étapes de lavage s’effectuent en retirant complètement la solution de bain et en la remplaçant par un tampon Krebs oxygéné neuf à 37 °C. Les myographes commerciaux disposent généralement d’une fonction de lavage intégrée qui draine les chambres de myographie.
  3. Générez une courbe concentration-réponse cumulative (CRC) à la phényléphrine (PE), en ajoutant des concentrations croissantes (exemple de plage 10⁻9 à 10⁻4 M). Laissez chaque concentration se stabiliser avant d’ajouter la suivante jusqu’à atteindre un plateau maximal stable.
  4. Effectuer au moins trois lavages consécutifs avec un tampon Krebs oxygéné à 37 °C jusqu’à ce qu’une tension basale passive stable soit rétablie.
  5. Évaluer la fonction endothéliale : précontracter avec une concentration sous-maximale de PE, permettre la réponse de se stabiliser, puis évaluer la relaxation dépendante de l’endothélium avec ACh (exemple de plage 10⁻⁹ à 10⁻⁵ M). Laissez chaque concentration se stabiliser avant d’ajouter la suivante jusqu’à obtenir une relaxation maximale stable. Enregistrer la relaxation en pourcentage par rapport au ton préconstricte (voir étape 7.4). Les préparations présentant <70 % de relaxation sont exclues.
    REMARQUE : Les maladies de la paroi vasculaire, telles que l’hypertension, sont couramment associées à un dysfonctionnement endothélial, ce qui conduit souvent à une réponse de vasorelaxation endothéliale dépendante de l’endothélium à l’ACh19. Dans ces conditions, les préparations présentant < 70 % de relaxation ne doivent pas être automatiquement exclues, car cela pourrait représenter un véritable dysfonctionnement endothélial lié à la maladie plutôt qu’une défaillance technique.
  6. Effectuer au moins trois lavages consécutifs avec un tampon Krebs oxygéné à 37 °C jusqu’à ce qu’une tension basale passive stable soit rétablie.
  7. Tester d’autres agents vasoactifs, avec ou sans inhibiteurs spécifiques à la voie, comme l’exige la question expérimentale.
  8. À la fin de l’expérience, retirez tous les récipients montés, nettoyez toutes les chambres avec 8 % d’acide acétique, suivies de trois lavages d’eau, puis enfin coupez le réservoir de gaz et la machine.
  9. Éliminer les déchets biologiques et chimiques selon les procédures institutionnelles.

7. Analyse et reporting des données

  1. Définition de base et enregistrement. Notez la tension de base immédiatement avant le début de toute provocation vasoconstrictrice (c’est-à-dire provocation à haute K⁺, CRC vasoconstricteur ou préconstriction avant une CRC vasodilatatrice).
    REMARQUE : Pour une analyse ultérieure, il est pratiquement plus facile de zéro les mesures de force sur l’interface utilisateur après un lavage adéquat de toute stimulation précédente, immédiatement avant le début de toute provocation vasoconstrictrice (c’est-à-dire une tension de base affichée = 0).
  2. Défi high-K⁺. Calculez la force active comme : Force active = Tonalité maximale après KCl - Tension de base (unités : mN). Exprimer la force active normalisée soit à la longueur unitaire (mN/mm), soit à la section transversale (mN/mm 2) du segment artériel monté. La mesure de la surface de la section transversale nécessite une analyse histologique ultérieure des segments de l’artère montée afin de déterminer l’épaisseur de la paroi.
    REMARQUE : Comme les anneaux aortiques produisent souvent une réponse non plateau, mesurez la réponse maximale à K⁺ dans un temps prédéfini (par exemple, 10 minutes) sur toutes les préparations, afin de minimiser la variabilité. Dans les ARM, la réponse maximale à K⁺ est généralement atteinte en quelques secondes après la stimulation.
  3. CRC contractiles. Pour chaque concentration dans un CRC cumulatif contractile (par exemple, PE), on calcule la force active comme suit. Exprimez la force active à chaque concentration en pourcentage de la réponse provoquée par le défi à haut K⁺. Utilisez ces valeurs en pourcentage pour ajuster les CRC contractiles (voir étape 7.5).
    Force active = Tonalité maximale après l’application du médicament - Tension de base (unités : mN)
    REMARQUE : Certaines affections peuvent provoquer une variabilité des réponses maximales à haute intensité de K⁺ selon les préparations (par exemple, des changements de masse musculaire lisse ou un état de différenciation résultant d’une pathologie). Dans ces circonstances, exprimez la force active à chaque concentration normalisée soit à une unité de longueur (mN/mm), soit à une section transversale (mN/mm2) du segment artériel monté.
  4. CRC relaxants. Pour les CRC de relaxation après une préconstriction submaximale (tonalité de préconstriction), calculez le pourcentage de relaxation à chaque concentration comme suit. Utilisez ces valeurs en pourcentage pour ajuster les CRC de relaxation (voir l’étape 7.5).
    Relaxation = (Tonalité de préconstriction - Tonalité après application du médicament) / (Tonalité de préconstriction - Tension de base) × 100.
  5. Ajustement de courbe. Pour les CRC cumulatives contractiles ou relaxantes, on trace le journal [concentration agoniste] sur l’axe des x par rapport à la réponse normalisée sur l’axe des y. Ajustez la courbe tracée avec un modèle logistique à quatre paramètres en utilisant une régression non linéaire. Extraire Emax (effet maximal) et pEC50 (−logEC50) pour des comparaisons statistiques, où EC50 est la concentration d’agoniste produisant 50 % d’Emax.
  6. Présentation des données : Présentez les CRC normalisés. Pour chacun des points de données sur la courbe, utilisez la moyenne du groupe ± l’erreur standard de la moyenne (MEB) ou de l’écart-type (SD). Inclure des traces originales représentatives et fournir un tableau des paramètres résumant les valeurs Emax et pEC50 (moyenne ± SEM ou SD).
  7. Analyse statistique :
    1. Comparez les CRC entre groupes expérimentaux en utilisant l’analyse de variance à mesures répétées bidirectionnelles (ANOVA) avec un test post-hoc approprié (par exemple, Bonferroni). Cependant, vérifiez les hypothèses (sphéricité, normalité) et utilisez des approches alternatives (par exemple, des modèles à effets mixtes) lorsque les données sont manquantes ou déséquilibrées.
    2. Comparez pEC50 et Emax entre deux groupes expérimentaux à l’aide d’un test t non apparié, ou de l’ANOVA unidirectionnelle si vous comparez plus de deux groupes expérimentaux. Sinon, utilisez des tests non paramétriques lorsque les hypothèses d’homogénéité de variance et de normalité sont violées. Fixer la signification statistique à p < 0,05.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Résultats

Un schéma représentant le flux global de la myographie par fil dans les artères de conduits et de résistance isolées chez des souris ou des rats est illustré à la Figure 1. Des images représentatives de l’isolement et du montage d’un anneau thoracique de souris et d’une ARM du second ordre sont montrées respectivement dans la Figure 2 et la Figure 3. Des captures d’écran logicielles montr...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Discussion

La myographie au fil reste une approche puissante et à haute résolution pour interroger la fonction vasculaire ex vivo. Lorsqu’elle est appliquée avec soin, cette méthode fournit des critères quantitatifs fiables qui répondent à des questions biologiques distinctes tout en permettant une comparaison rigoureuse des lits macrovasculaires et microvasculaires au sein d’un même animal. Les études sur les artères conduites révèlent des changements dans la mécanique artérielle globale ...

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le travail a été soutenu par une subvention NHLBI (R00 HL153896 à I.O.) et des fonds de démarrage de l’Université de Tolède.

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes centrifugeuses coniques de 15 mLThermo Fisher Scientific14-959-70C
Tubes centrifugeuses coniques de 50 mLThermo Fisher Scientific14-959-49A
Acide acétiqueThermo Fisher ScientificA490-212
AcétylcholineMillipore SigmaA6625-100G
Balance analytiqueMettler ToledoMX304
CaCl2Thermo Fisher ScientificC79-500
Carbogène (95 % O2/5 % CO2)AirgasCD USP50
Microscope de dissection   ;ZEISSZEISS Stemi 305
Boîte de pétri de dissectionInstrumentation des systèmes vivantsDD-90-S-BLK
Goupilles de dissectionTechnologie Myo danoise400626
Kit d’outils de dissectionTechnologie Myo danoise101017Le kit se compose d’un ciseau de dissection (1), d’un ciseau polyvalent (1), de boîtes de Petri (5), de pinces (3) et de goupilles de dissection.
Dumont #5 - Pinces finesOutils scientifiques finement11254-20
EDTAThermo Fisher ScientificBP2482-500
Congélateur (-20 °C ; C)Thermo Fisher ScientificTSG2325FA
Caisses articulées pour congélateurUSA Scientific2310-5848
Gants (Grand)Thermo Fisher Scientific19-041-171D
Gants (Moyen)Thermo Fisher Scientific19-041-171C
Gants (petits)Thermo Fisher Scientific19-041-171B
GlucoseThermo Fisher ScientificD16-500
Cylindre graduéThermo Fisher Scientific08-572G
GraphPad PrismLogiciel GraphPadN/AAnalyse des données et présentation graphique
Solution d’acide chlorhydriqueThermo Fisher ScientificSA48-1
Ice BucketThermo Fisher Scientific03-395-156
KClThermo Fisher ScientificP217-500
KH2PO4Thermo Fisher ScientificP380-500
Logiciel LabChart 8AD InstrumentsN/ALogiciels de capture de données
Réfrigérateur de laboratoireThermo Fisher ScientificFBG49RPGA
Source lumineuse LEDThermo Fisher ScientificAMPSILED21
Agitateur magnétiqueThermo Fisher ScientificFB30786159
Barres magnétiques de brassage (grandes)Thermo Fisher Scientific14-513-68
Barres magnétiques de brassage (Medium)Thermo Fisher Scientific14-513-61
MgSO4Thermo Fisher ScientificM63-500
Ensemble d’échantillonnage Micro Cuillère et SpatuleThermo Fisher ScientificS43322
Tubes microcentrifugesUSA Scientific1615-5510
Mini-microcentrifugeuseThermo Fisher Scientific07-203-954
Mini-tournevisThermo Fisher ScientificNC1349489
Système de myographe multi-filsTechnologie Myo danoiseDMT 620M
NaCl  ;Thermo Fisher ScientificS271-3
NaHCO3Thermo Fisher ScientificS233-500
Mesure de pHThermo Fisher Scientific01-912-351Comprend un pH-mètre, un capteur LE420, un QuickGuide d’installation et un pack de démarrage de tampon pH
Phényléphrine & nbsp ;Millipore SigmaP6126-5G
Contrôleur de pipettesThermo Fisher Scientific01-001-023
Pointes de pipette dans les racks (10 & micro ; L)USA Scientific1111-3810
Pointes de pipette dans les racks (1000 & micro ; L)USA Scientific1111-2830
Pointes de pipette dans les racks (200 & micro ; L)USA Scientific1111-1810
Bouteilles de stockage de supports réutilisables PYREXThermo Fisher Scientific06-414-1D
Pipettes sérologiques (10 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-204
Pipettes sérologiques (25 mL)Thermo Fisher Scientific02-923-205
Micropipette à canal unique Multi-PackThermo Fisher Scientific13-684-2503 pipettes (0,5-10 & mu ; L, 10-100 &mu ; L, 100-1000 et mu ; L)
Fil d’acier inoxydable (40 & mu ; m)Technologie Myo danoise400447
MinuterieThermo Fisher Scientific02-261-840
Système d’eau ultra pureSartoriusH2O-MM-UV-SET-US
Ciseaux de printemps VannasOutils scientifiques finement15000-00
Flasque volumétriqueThermo Fisher Scientific13-756-400
Mélangeur à vortexThermo Fisher Scientific10-320-807
Bain marieThermo Fisher Scientific07-202-155
Pesée des platsThermo Fisher Scientific02-202-101

Références

  1. De Oliveira, M. G., Nadruz, W. Jr, Mónica, F. Z. Endothelial and vascular smooth muscle dysfunction in hypertension. Biochem Pharmacol. 205, 115263(2022).
  2. Gallo, G., Volpe, M., Savoia, C. Endothelial dysfunction in hypertension: current concepts and clinical implications. Front Med. 8, (2022).
  3. Touyz, R. M., et al. Vascular smooth muscle contraction in hypertension. Cardiovasc Res. 114 (4), 529-539 (2018).
  4. Serné, E. H., de Jongh, R. T., Eringa, E. C., Ijzerman, R. G., Stehouwer, C. D. A. Microvascular dysfunction. Hypertension. 50 (1), 204-211 (2007).
  5. Wenceslau, C. F., et al. Guidelines for the measurement of vascular function and structure in isolated arteries and veins. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 321 (1), H77-H111 (2021).
  6. Del Campo, L., Ferrer, M. Wire myography to study vascular tone and vascular structure of isolated mouse arteries. Methods Mol Biol. 1339, 255-276 (2015).
  7. Mulvany, M. J., Halpern, W. Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ. Nature. 260 (5552), 617-619 (1976).
  8. Sun, J., et al. Isometric contractility measurement of the mouse mesenteric artery using wire myography. J Vis Exp. (138), e58064(2018).
  9. Halpern, W., Osol, G., Coy, G. S. Mechanical behavior of pressurized in vitro prearteriolar vessels determined with a video system. Ann Biomed Eng. 12 (5), 463-479 (1984).
  10. Jadeja, R. N., Rachakonda, V., Bagi, Z., Khurana, S. Intravital assessment of vascular function. J Vis Exp. (101), e50997(2015).
  11. Intengan, H. D., Schiffrin, E. L. Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension. Hypertension. 36 (3), 312-318 (2000).
  12. Lee, R. M. K. W., Dickhout, J. G., Sandow, S. L. Vascular structural and functional changes in hypertension: models, remodeling and relevance. Hypertens Res. 40 (4), 311-323 (2017).
  13. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in arterial smooth muscle relaxation. Nature. 288 (5789), 373-376 (1980).
  14. Palmer, R. M., Ferrige, A. G., Moncada, S. Nitric oxide release accounts for endothelium-derived relaxing factor activity. Nature. 327 (6122), 524-526 (1987).
  15. Brandes, R. P., et al. An endothelium-derived hyperpolarizing factor distinct from nitric oxide and prostacyclin. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (17), 9747-9752 (2000).
  16. Garland, C. J., Hiley, C. R., Dora, K. A. EDHF: spreading the influence of the endothelium. Br J Pharmacol. 164 (3), 839-852 (2011).
  17. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of resistance vessels in hypertensive rats. Circ Res. 41 (1), 19-26 (1977).
  18. Grano De Oro, A., et al. Spontaneous vascular dysfunction in Dahl salt-sensitive rats without high-salt diet. Physiol Rep. 12 (14), e16165(2024).
  19. Deanfield, J. E., Halcox, J. P., Rabelink, T. J. Endothelial function and dysfunction: testing and clinical relevance. Circulation. 115 (10), 1285-1295 (2007).
  20. Mulvany, M. J. Structure and function of small arteries in hypertension. J Hypertens Suppl. 8 (7), S225-S232 (1990).
  21. Huda, K., Lawrence, D. J., Thompson, W., Lindsey, S. H., Bayer, C. L. In vivo noninvasive systemic myography in pregnant mice. Nat Commun. 14 (1), (2023).
  22. Choi, R., et al. Optimization of resting tension for wire myography in rat pulmonary arteries. Physiol Rep. 12 (1), e15911(2024).
  23. Lu, X., Kassab, G. S. Assessment of endothelial function across vessel sizes using a unified myograph. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 300 (1), H94-H100 (2011).
  24. Hou, T., Guo, Z., Gong, M. C. Circadian variations of vasoconstriction and blood pressure. Curr Opin Pharmacol. 57, 125-131 (2021).
  25. Li, T., et al. sex-dependent vascular responsiveness mediated by estrogen receptor pathways. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 306 (8), H1105-H1115 (2014).
  26. Schubert, R., Gaynullina, D., Shvetsova, A., Tarasova, O. S. Myography of isolated blood vessels. Front Physiol. 14, 1176748(2023).
  27. Ruddy, J. M., Jones, J. A., Spinale, F. G., Ikonomidis, J. S. Regional heterogeneity within the aorta. J Thorac Cardiovasc Surg. 136 (5), 1123-1130 (2008).
  28. Ameer, O. Z., et al. Regional abnormalities within the aorta in metabolic syndrome. Exp Physiol. 106 (3), 771-788 (2021).
  29. Mezhenskyi, O. R., Philyppov, I. B. Regional differences in endothelium-dependent relaxation of rat thoracic aorta. Physiol Rep. 12 (6), (2024).
  30. Zhang, L., Rong, S., Dong, H. Functional heterogeneity of endothelium-dependent vasorelaxation in mesenteric arteries. Microvasc Res. 158, 104777(2025).

Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.

Réimpressions et autorisations

Étiquettes

Réactivité vasculaireartères mésentériquesmyographie isométriquedissection artériellefonction vasculairefonction endothélialefonction musculaire lisse

Cet article a été publié

Vidéo bientôt disponible

Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d’utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.