Flux de travail de la tomographie cryo-électronique pour tissus épais démontré dans l’hippocampe de souris

Résumé

Ce protocole standardise la tomographie cryo-électronique (cryo-ET) pour les tissus épais en intégrant la gelation à haute pression (HPF) avec la méthode gaufreuse, le levage par faisceau d’ions de focalisation cryogénique (cryo-FIB), et l’acquisition parallèle symétrique en dose, produisant des lamelles uniformément fines et des échantillons vitrifiés pour une analyse in situ reproductible dans l’hippocampe de souris.

Résumé

La cryotomographie électronique (cryo-ET) permet la visualisation 3D de l’ultrastructure cellulaire native, mais son application aux tissus épais est limitée par le manque de vitrification fiable et de préparation de lamelles à faible débit. Ici, un flux de travail de bout en bout est présenté intégrant la congélation à haute pression (HPF ; ~2100 bar ; temps de dissection à congélation ≤90 s) à l’aide d’un ensemble « gaufre » avec feuille de cuivre sur un tissu pré-fin, un levage cryo-FIB, et un amincissement contrôlé à des lamelles de 120–200 nm avec compensation de surinclinaison. Le revêtement conducteur est standardisé (sputter-Pt 30 mA/15 s ; Bouchon SIG 0,5–1,0 μm) pour minimiser le rideau. Acquisition automatisée de données à symétrie de dose (0°, ±3°, ±6°... à ±60–66° ; taille de pas de 2 à 3° ; dose totale 100–150 e⁻/Ų) est implémentée via des scripts PACEtomo, l’angle d’inclinaison de départ étant dérivé de l’angle de fraisage et de l’orientation de l’échantillon. Le traitement avec AreTomo 3 fournit des fonctions de correction du mouvement, d’estimation CTF, d’alignement et de reconstruction WBP en quasi-temps réel ; IsoNet peut éventuellement réduire l’anisotropie du coin manquant. La moyenne par subtomogramme (RELION 4.0) suit une stratégie pseudo-subtomogramme avec un rapport de résolution basé sur un seuil FSC de 0,143. Démontré sur l’hippocampe de souris, ce flux de travail produit régulièrement des échantillons bien vitrifiés et des lamelles uniformes (épaisseur cible 150 ± 40 nm) et permet une collecte en série d’inclinaison à haut débit (typiquement en série 5 à 8 min/tilt). Ce protocole offre une voie reproductible pour étudier la biologie structurale in situ directement à partir d’environnements tissulaires complexes.

Introduction

La cryo-tomographie électronique (cryo-ET) est devenue une technique clé pour visualiser les complexes macromoléculaires et les architectures cellulaires dans leur état natif et ^hydraté 1,2,3,4,5. En reconstruisant des volumes tridimensionnels à partir de séries d’images projetées en tilt, le cryo-ET comble le fossé entre le contexte cellulaire et la résolution quasi atomique, offrant des perspectives sans précédent sur la biologie structurale in^{situ 6}. Bien que les flux de travail par tomographie cryo-électronique pour les échantillons^{cellulaires 7} (y compris les cellules diluées par cryo-FIB en suspensions et cellules adhérentes) soient désormais bien établis, leur extension directe à des tissus épais et architecturalement intacts reste très difficile ^8,9,10. Cela est particulièrement vrai pour les tissus à forte teneur en eau comme le^{cerveau 11}, où une vitrification fiable et la préparation de lamelles électro-transparentes (généralement <200 nm) continuent de poser des goulets d’étranglement^{persistants 12}.

La vitrification dans les tissus est difficile en raison de leur forte teneur en eau et de leur transfert de chaleur limité. Bien que la congélation par plongée soit efficace pour les échantillons fins (≤20 μm)¹³, elle échoue pour la plupart des tissus. La congélation à haute pression (HPF) supprime la nucléation de la glace en appliquant une haute pression, permettant la vitrification d’échantillons jusqu’à ~200 μm en théorie. Cependant, l’efficacité de la HPF conventionnelle est souvent sous-optimale pour la vitrification des tissus. Pour améliorer les résultats, des efforts récents ont utilisé des stratégies telles que l’ajout de cryoprotectants¹⁴ et la pré-coupe^15,16 (par exemple, l’utilisation d’un vibratome) afin de réduire mécaniquement l’épaisseur de l’échantillon avant la congélation^11,17. Bien que ces approches puissent améliorer la qualité de vitrification, elles impliquent souvent une manipulation ex vivo prolongée et l’utilisation d’additifs chimiques risquant de modifier les structures natives. Pour remédier à ces limites, cette étude a modifié la stratégie des porteurs « gaufres » initialement développée par Kelley et ^al.18 en intégrant une optimisation critique : le tissu cérébral est physiquement comprimé à l’aide de deux supports en cuivre poli avant la congélation, ce qui pré-amincisse l’échantillon tout en le fixant simultanément entre une grille filmée et une feuille de cuivre. Cette conception favorise non seulement une vitrification rapide et uniforme, mais améliore également considérablement la stabilité mécanique, évitant ainsi efficacement la rupture de la grille et la perte d’échantillons lors de la manipulation ultérieure, établissant ainsi une base solide pour obtenir des échantillons de tissus congelés intacts et de haute qualité.

Après la vitrification, l’amincissement reste un obstacle majeur tant au débit qu’à la qualité. En tant que technique précoce et largement adoptée, la cryo-ultramicrotomie permet de nombreuses études structurelles fondamentales in situ. Néanmoins, elle introduit fréquemment des artefacts de compression et de^{coupe qui} compromettent l’intégrité structurelle. En revanche, le fraisage à faisceau ionique cryo-focalisé (cryo-FIB^{) 21} offre une précision supérieure et une distorsion^{minimale 7,22}. Initialement, le fraisage cryo-FIB était appliqué directement sur des échantillons vitrifiés sur des grilles pour produire les lamelles²³ ; cependant, cette approche in situ est principalement efficace pour les spécimens^{fins 24,25} (par exemple, cellules cultivées ou régions tissulaires périphériques) et ne peuvent pas accéder aux structures plus profondes dans des tissus épais et volumineux. Pour surmonter cette limitation de profondeur,²⁶ stratégies de levage ont été développées, permettant l’extraction spécifique aux régions d’intérêt (ROI) à l’intérieur des échantillons. Les avancées méthodologiques ultérieures, notamment le lift-out en^{série 27} et le sectionnement sérialisé sur grille (SOLIST⁾²⁸, ont encore amélioré le débit, la stabilité lamellaire et la précision du ciblage corrélatif 3D dans les tissus complexes. Plus récemment, des innovations ont continué à faire progresser le domaine, notamment la méthode d’attache à six côtés de Tang et ^al.29, qui améliore la stabilisation mécanique lors du soulèvement et de l’amincissage, ainsi que des approches novatrices de fraisage sur grille de Benjamin C. Creekmore et ^al.11 qui permettent un accès à des structures profondes tout en préservant le contexte des tissus natifs. Malgré ces avancées, les protocoles varient encore en efficacité, en reproductibilité et en adaptabilité selon les types de tissus. Un vide critique persiste dans l’établissement d’un flux de travail standardisé, facilement reproductible et largement applicable, qui intègre ces optimisations dans un pipeline cohérent pour divers tissus épais.

Cette lacune est comblée ici en synthétisant des détails techniques clés issus de méthodologies établies et en les affinant en un pipeline généralisé de bout en bout. Ce protocole utilise non seulement la méthode HPF-waffle améliorée pour une vitrification robuste, mais intègre également une série d’étapes optimisées dans le soulèvement et l’amincissement de la cryo-FIB, telles que la compensation systématique de sur-inclinaison, un revêtement conducteur standardisé et des séquences de fraisage calibrées, qui améliorent collectivement l’uniformité des lamelles, réduisent les artefacts (par exemple, le rideau) et améliorent le débit. Contrairement aux protocoles adaptés à des types cellulaires spécifiques ou à des organismes modèles, ce flux de travail est conçu avec une généralisation fondamentale, offrant un cadre polyvalent adaptable à une large gamme de tissus épais et complexes, y compris ceux relativement mous et sujets à la compression, au-delà de l’hippocampe de souris démontré.

Démontré dans le modèle complexe de l’hippocampe de la souris, remarquable pour sa sensibilité aux dommages causés par la glace et sa complexité structurelle, ce flux de travail intégré et généralisé produit de manière fiable des lamelles de haute qualité (120–200 nm) et permet une acquisition efficace en série inclinable (5–8 min/série). Cette consolidation des meilleures pratiques en un protocole cohérent, accessible et largement applicable offre un cadre reproductible qui abaisse la barrière technique à la mise en œuvre de la cryo-ET dans la recherche sur les tissus épais dans divers contextes biologiques et biomédicaux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des tissus animaux étaient conformes à SUSTech IACUC (Protocole SUSTech-JY202501019). Les régents et l’équipement utilisé sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation du support d’échantillons

1. Préparation des porteurs HPF (voir Figure 1A)
   1. Obtenir une paire de porteurs HPF en cuivre de 6 mm (type B). Assurez-vous qu’un des transporteurs ait une surface plane.
   2. Mouillez la surface plane du porte-avions et commencez à moudre. D’abord, utilisez du papier de verre de grain 8000 jusqu’à ce que les marques d’usinage d’origine soient complètement retirées. Ensuite, passez au papier de verre grain 12000 et continuez à meuler jusqu’à ce que les rayures de l’étape précédente disparaissent en grande partie, ce qui donne une finition uniformement lisse. La figure 2 montre des images typiques de la surface porteuse lors du processus de meulage et de polissage.
   3. Polir la surface du sol à l’aide d’un tissu métallographique doux et de la pâte diamantée W0.5 : d’abord, appliquer la pâte sur le chiffon, puis polir la surface en mouvement circulaire pendant 1 à 2 minutes jusqu’à obtenir une finition lisse et très polie. Rincez soigneusement le support avec de l’éthanol, puis de l’eau distillée pour éliminer tous les résidus abrasifs.
   4. Immergez les porteurs polis dans un 1-hexadécène pendant au moins 4 heures (ou toute la nuit) avant leur utilisation.
      REMARQUE : Les supports polis et traités peuvent être stockés immergés dans du 1-hexadécène.
      ATTENTION : 1-L’hexadécène est inflammable et dangereux s’il est inhalé ; travailler dans une hotte à vapeur avec des équipements de protection individuelle (EPI).
2. Préparation de la grille de support TEM (voir Figure 1B)
   1. Utilisez des grilles en cuivre de 100 mailles avec un film de support continu Formvar/carbone.
   2. Enduit par sputter des deux côtés des grilles d’or à l’aide d’un revêtement à sputter : réglez le courant à 50 mA et enrobez chaque côté pendant 120 s pour obtenir une couche d’environ 6 nm par côté.
3. Préparation de la feuille de cuivre (voir Figure 1C)
   1. Obtenir une feuille de cuivre de haute pureté d’une épaisseur de 1 μm.
      REMARQUE : La conductivité thermique du cuivre varie avec la pureté, et une pureté plus faible entraîne une conductivité thermique plus faible. Par conséquent, une feuille de cuivre de haute pureté (Cu ≥ 99,9 %) est nécessaire.
   2. Perforez la feuille de cuivre en disques d’un diamètre de 3 mm à l’aide d’une perforatrice circulaire.

2. Congélation à haute pression

1. Placez une gouttelette de 10 μL de solution à 10 % de saccharose sur une surface de verre propre.
2. Disséquez rapidement l’hippocampe d’une souris fraîchement euthanasiée. Éciser de petits morceaux de tissu d’environ 0,5 à 1^mm3 à l’aide d’une lame de rasoir tranchante (voir Figure 1D).
3. Transférez le tissu sur les grilles TEM de support en cuivre (maille 100) à l’intérieur du support HPF à l’aide d’un cure-dent ou d’une brosse fine. Utilisez du 2-méthylbutane (isopentane) pour manœuvrer doucement le tissu en place tout en minimisant les contraintes mécaniques sur la grille.
   ATTENTION : Le 2-méthylbutane (isopentane) est extrêmement inflammable. Manipulez-la dans une hotte sans source d’allumage.
4. Couvrez le tissu et la grille avec un disque en feuille de cuivre de 3 mm de diamètre. Complétez l’ensemble en plaçant le second support HPF (plat face vers le bas) sur le dessus pour former le sandwich « gaufre » scellé (voir Figure 1E).
   REMARQUE : La feuille de cuivre remplit une fonction mécanique essentielle dans l’ensemble gaufre. Il prend le tissu entre la grille TEM et le papier lui-même. Lors de l’assemblage, cette configuration exerce une pression douce, contribuant à former une tranche de tissu plus fine et uniforme, idéale pour la vitrification. De plus, le feuillet empêche la perte de tissu lors de la manipulation et aide à répartir la pression lors de la congélation à haute pression, réduisant ainsi le risque de rupture de la grille. Après la congélation, la feuille facilite également la séparation des supports de la grille vitrifiée. Cependant, cette méthode de préparation peut entraîner des dommages par compression mécanique et peut ne pas convenir aux échantillons sensibles aux artefacts induits par la pression. Pour ces échantillons, des techniques de coupe alternatives permettant d’obtenir une épaisseur appropriée sans compression, telles que le coupage par vibratomes ou le poinçage d’échantillons, doivent être envisagées.
5. Lancer immédiatement la procédure de congélation à haute pression conformément au protocole opérationnel du fabricant. Réglez la pression cible à ~2100 bars et assurez-vous que le temps total entre la dissection tissulaire et la congélation ne dépasse pas 90 s.
   REMARQUE : L’ensemble de la procédure, de la dissection à la congélation, doit être achevé dans les 90 secondes afin de minimiser les modifications structurelles liées à un temps ex vivo prolongé. La plage d’épaisseur tissulaire pour le cerveau est d’environ 20 à 40 μm.

3. Fraisage et démontage de la FIB

REMARQUE : Effectuez les étapes suivantes à l’aide d’un microscope à double faisceau équipé d’un étage cryogénique. Maintenez la température de l’échantillon en dessous de -170 °C tout au long.

1. Préparation de la grille de récepteur
   1. Obtenir une nouvelle grille dorée de 300 mailles pour servir de grille de réception finale pour la procédure de démontage.
   2. Sous un stéréomicroscope à température ambiante, clipsez doucement la grille dans un anneau AutoGrid CRYO-FIB compatible.
   3. Stockez l’AutoGrid assemblé directement dans un four sec maintenu à environ 40 °C pour minimiser l’accumulation de givre avant son utilisation.
      REMARQUE : Lors du clipping ; assurez-vous que la grille reste plate et centrée pour éviter toute courbure ou désalignement.
2. Récupération et montage de la grille tissulaire vitrifiée
   1. Tout en immergeant continuellement l’ensemble dans de l’azote liquide (LN₂), séparez soigneusement la grille vitrifiée TEM (contenant le tissu et la feuille de cuivre) des composants environnants de l’assemblage « gaufre ».
      REMARQUE : L’entretoise en feuille de cuivre facilite généralement la séparation de la grille des porteurs.
   2. Sur une station de travail pré-refroidie à chargement cryogénique, montez la grille tissulaire isolée dans un second anneau CRYO-FIB AutoGrid sous protection LN₂.
3. Grilles de co-chargement sur la navette cryo-transférée
   1. Chargez les deux AutoGrilles dans les emplacements désignés de la navette de transfert cryogénique.
   2. Orientez chaque AutoGrille de façon à ce que l’encoche de fraisage soit orientée vers l’extérieur et verticale.
   3. Gardez la navette chargée en immersion LN₂ ou pré-refroidie jusqu’à son transfert dans le microscope FIB/SEM.
4. Localisation et revêtement conducteur dans la FIB/SEM
   1. Après un transfert cryogénique au microscope, naviguez vers la grille tissulaire à faible grossissement SEM.
   2. Appliquez un revêtement conducteur et protecteur sur toute la surface de la grille.
      1. Enduit la surface de la grille avec du platine (Pt) à 30 mA pendant 15 s.
      2. Déposez un bouchon organométallique Pt d’épaisseur de 0,5 à 1,0 μm à l’aide du système d’injection de gaz (SIG).
      3. Appliquez une couche finale de Pt recouverte de sputter sur la surface de la grille à 30 mA pendant 15 s.
         REMARQUE : Le capuchon SIG est essentiel pour réduire les artefacts de rideau.
5. Isolation des blocs tissulaires et lift-out (voir Figure 3)
   1. Sélection des sites et orientation
      1. Naviguez vers la région d’intérêt sélectionnée (ROI) sur la grille tissulaire à l’aide de l’image du faisceau d’électrons SEM.
      2. Orientez l’échantillon pour le fraisage avant-côté. Une position typique de l’étape est réglée sur une rotation de 110° et une inclinaison de 7°, et cette position présente la surface de l’échantillon à un angle favorable à l’accès du faisceau d’ions.
         REMARQUE : En l’absence de marqueurs fluorescents, une stratégie de pré-dépistage peut être employée. Cette stratégie vise à localiser la région tissulaire cible et à exclure les zones contenant des composants cryoprotecteurs ou autres non tissulaires. Après avoir sélectionné une région apparemment exempte de glace de surface, on broie une petite tranchée d’essai en utilisant un courant de faisceau plus élevé (par exemple, 15 nA à 30 kV) à l’orientation frontale standard et on polit en utilisant un courant de faisceau plus faible (par exemple, 1 nA à 30 kV). Passez au faisceau d’électrons pour examiner la section efficace : le tissu présente un excellent contraste sous le faisceau d’électrons, une caractéristique particulièrement marquée dans les structures membraneuses et les régions riches en éléments lourds ; en revanche, le cryoprotectant présente généralement un contraste uniforme sous le faisceau d’électrons. Cela permet une vérification rapide avant de procéder à la procédure complète de remontage.
   2. Fraisage de tranchée pour isoler le bloc (Figure 3A)
      1. Définissez une tranchée rectangulaire entourant le bloc tissulaire cible en utilisant le faisceau ionique opérant à 30 kV.
      2. Commencez à fraiser à une certaine distance du bloc en utilisant un courant relativement élevé de 15 nA pour obtenir un retrait rapide du matériau.
      3. Lorsque les parois de tranchée approchent du bloc à quelques micromètres près, on réduit le courant du faisceau ionique à 7 nA. Réduire le courant permet un contrôle plus précis et minimise les dommages causés par le faisceau d’ions ainsi que le chauffage du matériel biologique dans la région d’intérêt.
      4. Laissez un côté du bloc attaché au matériau en vrac comme une « languette » pour le maintenir temporairement en place.
   3. Fraisage optionnel pour blocs épais (Figure 3B)
      1. Pour les blocs de tissu d’une épaisseur estimée supérieure à 20 μm, effectuez une étape de fraisage sous découpe depuis le côté inverse afin de faciliter le levage final.
      2. Faites pivoter l’étage (par exemple à -70°) et ajustez l’inclinaison de l’étage (par exemple, à 23°) pour accéder au bas du bloc.
      3. Fraisez la connexion inférieure à l’aide de la FIB à 30 kV et un courant de 3 nA.
   4. Fixation à l’aiguille du micromanipulateur (Figure 3C)
      1. Pour fixer l’échantillon à l’aiguille, effectuez des schémas de fraisage en section transversale séquentiels.
         REMARQUE : Le bloc d’or peut être extrait de la barre d’une grille dorée de 300 mailles.
   5. Soulèvement du bloc tissulaire (Figure 3D)
      1. Séparez la « languette » restante reliant le bloc à l’échantillon en vrac à l’aide de la FIB (30 kV, 1 nA).
      2. Manœuvrez soigneusement l’aiguille du micromanipulateur pour soulever le bloc tissulaire désormais isolé afin qu’il soit complètement dégagé de la tranchée et de la grille d’origine environnante. Ensuite, rétractez l’aiguille et transportez le bloc vers la grille du récepteur.
   6. Transfert de blocs, soudure et re-revêtement
      1. Naviguez vers une grille de récepteur en or pré-refroidie de 300 mailles.
      2. Descendez le bloc sur une case de grille choisie. Mettez le bloc de tissu en contact avec le film sur la grille, puis soulevez le bloc verticalement pour rompre le contact. Fraisez une tranche d’environ ~3 à 4 μm d’épaisseur du bloc sur le film en grille à l’aide du faisceau ionique (30 kV, 1 nA) (Figure 3E).
         REMARQUE : Si des débris de glace sont présents, pré-nettoyez le site d’attache avec un motif rectangulaire (30 kV, 50 pA). Assurez-vous que le bloc entre en contact avec le film de la grille afin de réduire la charge électrostatique, qui peut déplacer aléatoirement la tranche.
      3. Soudez la tranche solidement en fraisant en utilisant des motifs de section transversale de nettoyage des deux côtés de la jonction (30 kV, 30 pA) (Figure 3F).
      4. Réappliquez le revêtement conducteur/protecteur comme décrit à l’étape 3.4.2 (Figure 3G).
         REMARQUE : Pour cette étape de placage SIG, la durée peut être réduite selon la taille du bloc.
   7. Affinement des lamelles
      1. Faites pivoter l’étage (par exemple à -70°) et réglez une inclinaison initiale de l’étage (par exemple, 15°) (Figure 3H).
         REMARQUE : Le porte-échantillon présente une pré-inclinaison de 45°.
      2. Définissez la position finale des lamelles dans une zone lisse du bloc tissulaire.
         REMARQUE : Confirmez que la zone sélectionnée est exempte de contamination par la glace.
      3. Effectuez un fraisage systématique en utilisant les courants de faisceau ionique spécifiés dans le Tableau 1. On progresse des courants plus élevés vers des courants plus faibles à mesure que le plan cible est approché (Figure 3I,J). En option, lorsqu’il se trouve à moins de 1 à 2 μm de la lamelle, une tranchée de soulagement de contrainte peut être fraisée à environ 1,5 μm de distance pour éviter la pliabilité ou le recourburement de la^{lamelle 30,31}.
         REMARQUE : Lorsque le matériau restant se trouve à ~1 μm du plan cible, limitez l’épaisseur retirée par passage.

4. Collecte de données cryo-ET

1. Après une préparation réussie de la lamelle, chargez soigneusement la grille dans un microscope électronique à transmission (TEM) équipé d’un support cryogénique, d’un filtre à énergie et d’un logiciel de tomographie (par exemple, SerialEM).
2. Acquérez une carte d’atlas de l’ensemble de la grille (par exemple, Figure 4A ; le grossissement typique est de 155×).
3. Naviguez jusqu’à la position de la lamelle et obtenez une carte de montage (par exemple, Figure 4B ; le grossissement typique est de 3600× avec une défocalisation de -100 μm).
4. Régler le grossissement nominal d’enregistrement et vérifier que la taille du pixel est appropriée à la résolution prévue ; dans la présente étude, une taille de pixel de 2,109 Å a été utilisée. Ajustez les paramètres d’éclairage correspondants, y compris la taille du spot, le diamètre de l’ouverture C2 et la zone d’éclairage, afin d’obtenir un débit de dose optimisé pour le détecteur d’électrons direct.
5. Configurez les conditions de mise au point et d’éclairage d’essai pour correspondre à celles définies pour le paramètre Record.
6. Effectuez la collecte de données en utilisant les scripts^{PaceTomo 32}, en suivant les étapes ci-dessous :
   1. Présélectionnez les cibles sur la carte de montage en utilisant la fonction « ajouter des points » dans le navigateur, afin de garantir que la première caractéristique présente un contraste suffisant.
   2. Sélectionnez les cibles à l’aide du script^{PACEtomo_selectTargets.py 32}, en ajustant la zone en avant lors du grossissement d’aperçu si nécessaire. Les régions typiques d’intérêt sont représentées à la Figure 4C.
   3. Acquérir une série d’inclinaison en utilisant un schéma à symétrie de dose (par exemple, 0°, +3°, -3°, +6°, -6°... jusqu’à ±60°–66°) avec un incrément de 2° ou 3°. Définir les paramètres d’acquisition dans le script PACEtomo.py : l’angle d’inclinaison de départ est déterminé par l’angle de fraisage spécifié à l’étape 3.7.1 (c’est-à-dire 8°), son signe dépendant de l’orientation de charge de l’échantillon dans la cryo-EM ; les angles d’inclinaison minimum et maximal font référence à des valeurs absolues ; et la taille du pas correspond à l’incrément d’inclinaison (par exemple, 3°).
      REMARQUE : Cet angle d’inclinaison de départ est conçu pour positionner la lamelle horizontalement et perpendiculairement au faisceau d’électrons. Si l’angle de fraisage est inconnu, inclinez l’image pour afficher la lamelle à sa plus grande hauteur apparente ; cela fournit un alignement suffisamment précis.
   4. Maintenir une dose d’électrons cumulée de 100–150 e⁻/Ų répartie sur toutes les inclinaisons. Si disponible, utilisez un filtre à énergie avec une largeur de fente de 10 eV.
   5. Lancer l’acquisition des données. La mise au point et le suivi automatisés sont mis en place à chaque angle d’inclinaison. Le temps d’acquisition typique pour une série d’inclinaison unique est de 5 à 8 minutes.
      REMARQUE : Un guide de dépannage est fourni dans le tableau 2.

5. Traitement des données

1. Correction de mouvement en série d’inclinaison de procédés, estimation, alignement CTF et reconstruction tomogramme 3D en utilisant AreTomo^{3 33} pour effectuer trois étapes principales : (1) correction de mouvement des images brutes, (2) estimation de la fonction de transfert de contraste (CTF) pour chaque image inclinée, et (3) alignement de la série complète de tilt.
   1. Après alignement, reconstruisez les tomogrammes tridimensionnels (3D ) via l’algorithme de rétroprojection pondérée. Les entrées requises pour cette étape comprenaient : les images brutes, les fichiers de métadonnées mdoc (qui documentent les paramètres d’acquisition des séries d’inclinaison), et l’axe de rotation prédéterminé de l’échantillon.
2. Correction de coin manquante
   1. Après reconstruction, les tomogrammes générés sont soumis à une correction de coin manquant à l’aide d’IsoNet³⁴.
3. Sélection et curation des particules
   1. Effectuez le picking de particules en EMAN 2.9³⁵ en utilisant la méthode de correspondance de gabarit. Après le choix automatisé, les faux positifs (c’est-à-dire les régions non cibles ou les régions sélectionnées à tort) étaient manuellement exclus afin d’assurer la qualité du jeu de données de particules sélectionné.
4. Moyenne par sous-tomogramme
   1. Importez la série d’inclinaison et leurs coordonnées de particules correspondantes dans RELION 4.0. Effectuer la moyenne par sous-tomographie en suivant le flux de travail standard décrit dans la documentation RELION 4.0 (https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/STA_tutorial/Introduction.html), ce qui garantit le respect des meilleures pratiques établies en matière de reproductibilité.

Résultats

L’application réussie de ce protocole permet la production de lamelles tissulaires vitrifiées de haute qualité et la reconstruction subséquente de tomographies révélant l’ultrastructure cellulaire native. Les résultats suivants, démontrés à l’aide de tissu hippocampique de souris, sont représentatifs d’une expérience réussie.

Les blocs tissulaires traités par congélation à haute pression avec la méthode « gaufre » présentaient une apparence uniforme et transpa...

Discussion

Le flux de travail présenté ici établit un pipeline généralisé, optimisé et reproductible pour la tomographie cryo-électronique in situ des tissus natifs et épais. Sa contribution principale ne réside pas dans l’invention de techniques uniques, mais dans l’intégration systématique, le raffinement et la standardisation détaillée de l’ensemble du procédé, allant de la vitrification robuste utilisant une méthode modifiée de type gaufre-HPF à un protocole de levage et d’amincissemen...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-Hexadécène	Sigma-Aldrich	H2131	Produits chimiques & Réactifs
2-méthylpentane	Sigma-Aldrich	M65807	Produits chimiques & Réactifs
Anneau à clips	Thermo Fisher Scientific	1131750; 1188953	Consommables
Feuille de cuivre	Matériaux métalliques Fengcheng	1 & micro ; Épaisseur m	Consommables
Grilles TEM de support en cuivre (100 maillages)	Beijing Zhongjingkeyi Technology Co., Ltd	BZ10021b	Consommables
Cryo-EM	Thermo Fisher Scientific	Krios G4	Équipement  ;
Cryo-FIB	Thermo Fisher Scientific	Aquilos 2	Équipement  ;
Autogrille cryo-FIB	Thermo Fisher Scientific	1205101	Consommables
Grilles (UltrAufoil R 1.2/1.3 maillage 300)	Quantifoil	AltrAufoil	Consommables
Congélateur haute pression	Leica Microsystems	EM ICE	Équipement  ;
Porteur HPF, cuivre	Leica Microsystems	Type B (6 mm)	Consommables
Coater à Ion-Sputter	Quorum	Q150RS plus	Équipement  ;
Pâte de polissage métallographique	Lab-testec	W0.5	Consommables
Polissage du tissu	GORAL	B00809	Consommables
Papier de verre	Papier de verre de marque Eagle	8000 grains, 12000 grains	Consommables
Stéréomicroscope	Leica Microsystems	S9i	Équipement  ;
Saccharose	Sigma-Aldrich	200-334-9	Produits chimiques & Réactifs
Logiciels d’acquisition de la série Tilt	https://bio3d.colorado.edu/SerialEM/	SerialEM 4.0.9	Logiciels
Alignement et alignement de la série Tilt Logiciels de reconstruction	https://github.com/czimaginginstitute/AreTomo3  ;	AreTomo 3	Logiciels
Logiciels d’acquisition de la série Tilt	https://github.com/eisfabian/PACEtomo	PaceTomo	Logiciels
Alignement et alignement de la série Tilt Logiciels de reconstruction	https://github.com/IsoNet-cryoET/IsoNet	IsoNet	Logiciels
Alignement et alignement de la série Tilt Logiciels de reconstruction	https://github.com/cryoem/eman2	EMAN2	Logiciels
Alignement et alignement de la série Tilt Logiciels de reconstruction	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/index.html	Relion 4	Logiciels