Quantification des changements dans les unités formatrices de colonies de bifidobactéries et lactobacilles pendant le traitement à la rifaximine et le gel synbiotique chez des volontaires sains

Summary

Cet essai clinique a évalué les taux de bifidobactéries et lactobacilles après une semaine de traitement à la rifaximine et un gel synbiotique composé de Lactobacillus acidophilus NCFM et Bifidobacterium lactis Bi07, avec de l’inuline d’agave, pendant le traitement à la rifaximine et 4 semaines après, comparé à un gel placebo, montrant que le gel synbiotique pouvait aider à maintenir les lactobacilles et les bifidobactéries.

Abstract

Bien que le microbiote intestinal soit généralement stable, il peut être influencé par un traitement antibiotique. La rifaximine, utilisée pour traiter les troubles gastro-intestinaux, est fréquemment administrée avec des probiotiques pour réduire le risque de dysbiose. Lactobacillus acidophilus interagit avec les cellules intestinales et utilise des composés prébiotiques. Bifidobacteria, en particulier Bifidobacterium infantis ssp. lactis Bi07, est un probiotique associé à des effets bénéfiques dans l’intestin. Des études in vitro ont démontré la supériorité des fructans d’agave sur l’inuline de chicorée. Aucune étude n’a documenté de changements dans le nombre de lactobacilles fécaux et de bifidobactéries après l’administration concomitante de rifaximine et de synbiotiques. Notre objectif était d’évaluer les changements dans les taux d’UFC des bifidobactéries intestinales et des lactobacilles chez des volontaires en bonne santé après la consommation de gel synbiotique, qui contient Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 et l’inuline d’agave en tant que prébiotique, pendant une semaine de traitement à la rifaximine et pendant 4 semaines après. Dans un essai clinique randomisé, contrôlé par placebo et en double aveugle, les participants sains sans traitement antimicrobien le mois précédent ont été randomisés en 1:1 en deux groupes (10 participants par groupe). Le groupe Gel Synbiotique a reçu 10,32 g d’inuline d’agave en prébiotique, 4 ×¹⁰ UFC 9 de Lactobacillus acidophilus NCFM et 4 ×^{10 UFC} 9 g de Bifidobacterium lactis Bi07 par jour pendant 5 semaines, et 200 mg de rifaximine deux fois par jour pendant la première semaine. Le groupe Placebo Gel a reçu un gel placebo pendant 5 semaines et 200 mg de rifaximine deux fois par jour pendant la première semaine. Les changements bactériens ont été estimés en quantifiant l’UFC par évaluation microbiologique des selles. Cinq semaines plus tard, les populations de lactobacils et de bifidobactéries n’ont pas changé. La détection de Lactobacillus acidophilus NCFM et Bifidobacterium lactis Bi07 dans certains échantillons de selles suggère une colonisation transitoire et partielle, soulignant la nécessité d’études dose-réponse avec ce produit synbiotique.

Introduction

Le microbiote intestinal humain est une communauté densément peuplée qui comprend des espèces indigènes présentes en permanence ainsi que d’autres micro-organismes transitoires. Bien que sa composition puisse varier d’un individu à l’autre, elle est généralement considérée comme stable. Cependant, elle peut être influencée par l’âge, l’infection et le traitement^{antibiotique 1,2,3}. La rifaximine, un antibiotique à large spectre à faible absorption intestinale, est utilisée pour traiter les troubles intestinaux et peut modifier le microbiote. Des bactéries probiotiques des genres Lactobacillus et Bifidobacterium sont utilisées pour atténuer ces^{effets 2}.

Des souches de Bifidobacterium spp. ont été rapportées comme étant résistantes à^{la rifaximine 2}, ce qui a un effet intéressant en favorisant une biote intestinale contenant des populations de Bifidobacterium spp. en nombre suffisant pour des effets probiotiques bénéfiques.

De plus, Lactobacillus acidophilus est largement reconnu pour sa capacité à interagir avec l’épithélium^{gastro-intestinal 4} et sa capacité à utiliser des prébiotiques, tels que les polysaccharides, oligosaccharides et fructooligosaccharides. Cependant, seules quelques souches probiotiques, comme la souche Lactobacillus acidophilus North Carolina Food Microbiology (NCFM), ont été identifiées. Par conséquent, étudier leurs effets in vivo est important, tout comme la présence de Bifidobacterium lactis Bi07 dans le tube digestif, qui a été associée à divers bénéfices bénéfiques^{pour la santé 2,5}. Ces probiotiques nécessitent un prébiotique pour croître de manière optimale, c’est pourquoi un synbiotique contenant à la fois un probiotique et un prébiotique fonctionne de manière synergique ; c’est-à-dire que son effet favorable est supérieur à celui du probiotique seul. Avec les prébiotiques, qui servent de substrats aux probiotiques, cette symbiose devrait améliorer la survie des micro-organismes probiotiques dans le tractus gastro-intestinal, conduisant à une meilleure restauration du^{microbiote 6}.

Une source importante de prébiotiques est le fruit de l’agave, qui a été rapporté comme ayant des effets in vitro supérieurs sur le microbiote que ceux de la racine de chicorée (Cichorium intybus L.)⁷. Des études ont rapporté les effets de la consommation de probiotiques ; par exemple, Engelbrektson et al. ont évalué si la consommation de probiotiques pendant et après l’administration d’antibiotiques pouvait réduire les altérations du microbiote causées par les^{antibiotiques 8}. Ils ont constaté que le groupe ayant reçu le mélange probiotique montrait une récupération plus rapide du microbiote normal que ceux qui n’en avaient^{pas 8}. De plus, Koning et al. ont étudié la dysbiose dans le microbiote intestinal de 40 volontaires en bonne santé traités avec 500 mg d’amoxicilline deux fois par jour pendant 7 jours, ainsi que la possible récupération du microbiote après la consommation d’un mélange probiotique. Les résultats ont montré que le traitement à l’amoxicilline affectait la composition du microbiote natif. Lorsqu’un mélange probiotique a été administré, le microbiote s’est nettement rétabli après deux mois de consommation⁹.

Cependant, la littérature rapporte qu’aucune étude n’a étudié l’effet de la consommation de synbiotiques (avec des fructes d’agave comme prébiotique) sur le microbiote intestinal pendant et après l’administration d’antibiotiques, comme la rifaximine ; Nous n’avons trouvé que des études avec des probiotiques. Ainsi, cette étude a évalué les changements dans les taux d’UCC des bifidobactéries intestinales et des lactobacilles chez des volontaires en bonne santé après la consommation de Synbiotic Gel, qui contient Lactobacillus acidophilus NCFM, Bifidobacterium lactis Bi07 et l’inuline d’agave en tant que prébiotique, pendant une semaine de traitement à la rifaximine et pendant 4 semaines après.

Protocol

Le protocole a été approuvé par le Comité Institutionnel pour la Recherche Biomédicale sur l’Homme (CIIBH) de l’Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubiran (INCMNSZ) (RÉFÉRENCE 1734). Tous les participants ont donné leur consentement éclairé avant d’être inclus dans cette étude.

Conception de l’étude et population

Il s’agissait d’un essai clinique randomisé, contrôlé par placebo, en double aveugle, avec une période de suivi de 5 semaines. Les travailleurs de l’INCMNSZ ont été invités à participer à l’étude, et des volontaires en bonne santé âgés de 20 à 50 ans sans traitement antimicrobien le mois précédent, ayant accepté et signé le formulaire de consentement éclairé, ont été inclus entre 2011 et 2012. Les sujets de l’étude ont été randomisés 1:1 dans le groupe Gel synbiotique avec 10,32 g d’inuline d’agave en prébiotique, 4 × 10⁹ UFC/ g de Lactobacillus acidophilus NCFM et 4 ×^{10 UFC 9} de Bifidobacterium lactis Bi07 par jour, contenus dans 4 sachets pendant 5 semaines, et 200 mg de rifaximine deux fois par jour pendant la première semaine. Le groupe Placebo Gel a reçu 4 paquets de 15 g de gel placebo, présentant la même présentation et les mêmes caractéristiques sensorielles que le Synbiotic Gel, pendant 5 semaines, et 200 mg de rifaximine deux fois par jour pendant la première semaine (Figure 1).

Évaluation clinique

Dans les deux groupes d’étude, les symptômes et l’apparence des selles ont été évalués à l’aide de l’échelle de Bristol. Le poids, la taille et l’indice de masse corporelle (IMC) ont également été mesurés. Un journal intime a été utilisé pour évaluer la consommation de gel synbiotique, de gel placebo et de rifaximine, ainsi que pour enregistrer la présence ou l’absence d’effets secondaires liés à l’ingestion du gel.

Consommation de fibre

L’apport en fibres a été évalué à l’aide d’un journal alimentaire et d’un rappel hebdomadaire de 24 heures dans les deux groupes.

Adhérence au traitement

L’adhésion à la rifaximine et à la consommation de gel a été évaluée en comptant le nombre de doses de rifaximine et le nombre de sachets de gels synbiotiques et placebo consommés par participant. La présence de Lactobacillus acidophilus et Bifidobacterium lactis a été détectée par réaction en chaîne par polymérase (PCR).

Évaluation microbiologique des excréments

À la visite 0 et hebdomadaire pour 5 visites (6 visites) dans chaque groupe, les nombres de lactobacillis, bifidobactéries et entérobactéries ont été évalués dans 120 échantillons fécaux par la méthode du comptage des plaques. Cette méthode mesure les unités formant des colonies (UFC) en plaçant des échantillons dilués sur des milieux solides^{spécialisés 10}. Des échantillons de selles ont été prélevés au début de chaque visite.

Pour identifier les micro-organismes, des échantillons fécaux ont été prélevés et stockés dans des tubes BBL. La fiole de PBG était utilisée pour les bactéries anaérobies, et les échantillons fécaux étaient transportés dans un refroidisseur en polystyrène contenant des gels congelés pour maintenir une température basse avant le traitement en laboratoire. Le bouchon du flacon de PBG pour la coproculture a été retiré, et l’échantillon de selles a été prélevé à l’aide d’un écouvillon, garantissant que le prélèvement était imprégné avec l’échantillon. L’applicateur était ensuite placé dans un tube contenant un milieu solide de culture.

Pour les bactéries anaérobies, les fioles étaient pesées et 5 à 10 g de selles étaient prélevées à l’aide d’une cuillère. Le selle était ensuite mélangée au contenu de la fiole et hermétiquement scellée. Pour le traitement des échantillons, les fioles contenant les échantillons et les sacs Stomacher stériles ont été pesés. L’échantillon a été vidé dans un sac, centrifugé pendant 60 s, puis 4,5 mL d’eau à 0,1 % de peptones a été ajouté. Par la suite, 500 μL de l’échantillon ont été transférés dans un flacon et transformés en vortex pour homogénéiser le mélange. Après 100 μL de l’échantillon ont été inoculés en duplicate sur chaque plaque du milieu sélectif spécifique, le milieu Man Rogosa Sharpe (MRS) pour les lactobacils et le milieu DP Beerens avec cystéine + cycloheximide (pour éliminer la flore indésirable) pour les bifidobactéries, jusqu’à la dilution 8 (facteur de dilution 0,1 mL). Pour les entérobactéries, un milieu MacConkey a été utilisé à des dilutions 5–8 (facteur de dilution 0,1 mL), où les colonies bactériennes ont été séparées et^{quantifiées 11}. Chaque poudre de milieu était dissoute dans de l’eau distillée purifiée, la solution était chauffée à ébullition pour assurer une dissolution complète, puis stérilisée dans un autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Le mélange a été refroidi à 46,5 °C pour effectuer la technique de la plaque de coulage, en versant 1 mL par plaque en double dans des boîtes de Petri stériles contenant 15 à 20 mL de milieu de culture, et en laissant les plaques solidifier. Les échantillons inoculés ont été incubés à 37 °C dans une atmosphère enrichie en CO₂ dans des systèmes GasPak anaérobies afin de maintenir des conditions anaérobies pendant 24 à 48 heures. Les unités formant la colonie (CFU) étaient marquées avec un stylo et^{comptées 12}. La formule suivante a été appliquée :

CFU/mL = (nombre de colonies × facteur de dilution total)/volume de culture placée (mL)

Identification des caractéristiques morphologiques des lactobacils et des bifidobactéries

La tache de Gram a été utilisée pour identifier les caractéristiques morphologiques du spécimen. Un échantillon de colonies bactériennes de chaque souche était placé sur une lame de microscope, coloré au violet cristallin pendant 1 minute, puis rincé à l’eau distillée. Une solution d’iode a été appliquée pendant 1 minute puis rincée à l’eau distillée. Une solution alcool-acétone a été utilisée pendant 10 s comme décolorant et rincée à l’eau distillée. Enfin, la safranine a été appliquée comme contre-teinture pendant 1 minute puis rincée à l’eau distillée. Les lames du microscope ont été observées sous un microscope optique à l’aide d’huile d’immersion avec un objectif de 100x.

La quantification totale a été réalisée à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase conventionnelle (PCR) sur des échantillons fécaux sélectionnés au hasard parmi cinq sujets par groupe, obtenant un total de 60 échantillons sur 5 semaines. Des isolats issus de milieux de culture ont été traités pour l’extraction de matériel génétique. La PCR a été réalisée à l’aide d’amorces bactériennes universelles pour amplifier un fragment du gène 13 de l’ARNr^16S. Les produits PCR étaient purifiés et séquencés. Les séquences ont été vérifiées et soumises à la base de données GenBank afin de confirmer la présence de lactobacilles et de souches bifidobactériennes isolées à partir des échantillons fécals.

Analyse statistique

Les données sont présentées sous forme de fréquences absolues et relatives ou médianes (p25-P75e). La sévérité cumulative des symptômes a été déterminée à l’aide du score de Likert (léger, 1 ; modéré, 2 ; sévère, 3) à chaque suivi. Des comparaisons intergroupes ont été réalisées à l’aide du test de Wilcoxon à la somme des rangs et du chi-carré ou test exact de Fisher. Des comparaisons intra-groupes entre les semaines 0 et 5 ont été réalisées à l’aide du test de Friedman et de comparaisons multiples avec Durbin-Conover. La signification statistique a été fixée à P < 0,05.

Results

Vingt volontaires en bonne santé ont été répartis aléatoirement en groupe Gel synbiotique (n = 10) et groupe Gel placebo (n = 10) (Figure 2 et Tableau 1). Dans le groupe Gel synbiotique, sept étaient des hommes et trois des femmes, avec un âge médian de 31 ans (fourchette de 27 à 35 ans) ; dans le groupe Placebo Gel, trois étaient des hommes et sept des femmes, avec un âge médian de 33 ans (fourchette 28–38 ans). Les groupes...

Discussion

Dans la présente étude, nous avons constaté une réduction significative des taux d’entérobactéries dans les échantillons fécaux des sujets du groupe placebo dès la première semaine d’intervention et chez les sujets du groupe Gel synbiotique lors des première et deuxième semaines. Ce changement peut s’expliquer par la rifaximine, qui a été décrite comme atténuant la prolifération bactérienne^{pathogène 14}. Dans notre étude, le groupe Gel synbiotique suivant la rifaxi...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tube à billes	NA	NA	N’importe quelle marque peut être utilisée  ;
Médium DP	NA	NA	N’importe quelle marque peut être utilisée  ;
Sachets de gel congelé
Médium MacConkey	NA	NA
MRS medium	NA	NA	N’importe quelle marque peut être utilisée  ;
Flacon PBG			Tampon phosphate, gélatine, sels 0,05 % cystéine comme agent réducteur pour 02
Plaques de Petri   ;
Mélange placebo	KuragoBiotek-BébéCat.	NA	Même propriétés physiques et sensorielles que le gel symiotique, mais sans les ingrédients actifs
Conteneur en polystyrène
Mélange symbiotique	KuragoBiotek-BébéCat.	NA	Produit non laitier composé de Lactobacillus acidophilus NCMF et Bifidobacterium infantis Bi-07 (2 x 109  ; UFC/g), et 17,2 g d’inuline d’agave en prébiotique dans un paquet de 15 g