Un protocole pour l’enrichissement basé sur la taille des gouttelettes lipidiques provenant des cellules épithéliales mammaires bovines et des tissus mammaires

Résumé

Ce protocole vise à obtenir une séparation et un enrichissement des gouttelettes lipidiques par centrifugation séquentielle, permettant une étude précise et reproductible des mécanismes du métabolisme lipidique et des processus biologiques associés aux gouttelettes lipidiques.

Résumé

Ce protocole décrit une approche séquentielle de centrifugation différentielle pour enrichir des gouttelettes lipidiques (LD) de tailles différentes à partir de cellules épithéliales mammaires bovines (BMEC) et de tissus mammaires, permettant une analyse par taille résolue au-delà des méthodes conventionnelles d’isolement en vrac de LD. En tant que centres régulateurs dynamiques du métabolisme lipidique intracellulaire, les LD remplissent des fonctions critiques en stockant des lipides neutres (tels que les triglycérides et les esters de cholestéryl) et en coordonnant leur synthèse, leur hydrolyse et leur transport. Ils jouent un rôle central dans le maintien de l’homéostasie énergétique, le soutien à la biogenèse membranaire et la facilitation de la transduction du signal cellulaire. L’extraction de la LD est essentielle pour étudier les mécanismes régulateurs du métabolisme lipidique. L’étude du métabolisme lipidique des glandes mammaires a des implications significatives pour le développement infantile, la santé humaine, l’économie agricole et la biologie cellulaire fondamentale. Par conséquent, nous décrivons une méthode de centrifugation différentielle pour extraire les LD des BMEC et du tissu des glandes mammaires. Contrairement aux approches conventionnelles d’isolation LD en masse, ce protocole permet l’enrichissement basé sur la taille des sous-populations LD en ajustant séquentiellement les forces centrifuges. L’intégrité et l’enrichissement relatif des fractions de LD sont évalués de manière préliminaire à l’aide de la coloration BODIPY493/503, fournissant une approche pratique et reproductible pour les analyses en aval du métabolisme lipidique et des processus associés à la LD.

Introduction

Les gouttelettes lipidiques (LD) sont des organites dynamiques au sein des cellules qui servent de sites de stockage primaires pour les lipides^{neutres 1}. Une accumulation anormale de stéatose lucide est associée à un large éventail de maladies, allant au-delà de l’obésité pour inclure des affections telles que la stéatose^{hépatique 2}, les maladies^{cardiovasculaires 3}, le^{diabète 4} et le^{cancer 5}. Inversement, un nombre insuffisant de LD peut également avoir des conséquences graves, entraînant la perte des réserves d’énergie cellulaire et des altences fonctionnelles^{ultérieures 6}. Dans le contexte de l’économie agricole, un manque de LD chez les ruminants peut entraîner une sécrétion insuffisante de graisse du lait, entraînant une dépression des graisses laitières, ce qui compromet à son tour la valeur nutritionnelle et la commercialisation des produits^{laitiers 7}. Actuellement, la régulation du métabolisme du LD est devenue un domaine de recherche important.

Le développement des techniques d’extraction des LD depuis le XXe siècle vise constamment à extraire les LD en plus grande quantité, avec une pureté plus élevée et une activité biologique mieux préservée. Cela implique l’établissement et l’optimisation continus de méthodologies. Actuellement, plusieurs entreprises ont conçu des kits commerciaux pour la séparation^{LD 8}. Bien que ces kits réduisent considérablement le temps de séparation et ne nécessitent que l’utilisation de centrifugeuses conventionnelles, pour les échantillons difficiles à dissocier, le réactif ne peut pas être ajusté, et il est difficile d’optimiser les étapes du test. De plus, l’extraction des LD joue un rôle indispensable dans l’élucidation des mécanismes pathologiques, notamment ceux des maladies métaboliques telles que le foie^{gras 9}, le cancer¹⁰ et les maladies neurodégénératives¹¹, servant de sonde multidimensionnelle pour déchiffrer les voies pathologiques. Les compositions protéiques et lipidiques peuvent également être disséquées en extrayant des LD afin de révéler la diversité des fonctions biologiques des^{LD 12}.

La formation de la graisse laitière n’est pas simplement un processus de dégradation du substrat ; il s’agit plutôt d’un processus de synthèse et d’emballage lipidique hautement orchestré réalisé par les cellules épithéliales mammaires. ¹³. La production de graisse laitière chez les vaches laitières dépend du mécanisme de sécrétion de la membrane apicale de ces cellules : les triglycérides synthétisés dans le réticulum endoplasmique forment des LD cytoplasmiques, qui sont ensuite transportés vers la membrane apicale et sécrétés par bourgeonnement. Au cours de ce processus, les LD sont enveloppées par une membrane de globule de graisse laitière dérivée de la membrane apicale, ce qui entraîne la formation de globules de graisse laitière^{structurellement stables 14}. La glande mammaire bovine sert de modèle classique pour étudier la lactation chez les mammifères, et les mécanismes fondamentaux régissant la synthèse et la sécrétion de la LD sont fortement conservés^{chez l’humain 15}. Établir des méthodes pour extraire les LD à la fois des BMEC et des tissus mammaires peut faire le lien entre la production animale et la santé humaine. Des analyses protéomiques et lipidomiques des LD extraites peuvent ensuite être exploitées pour améliorer la production et la qualité du lait, garantissant la sécurité et la sûreté.

La méthode actuelle est principalement basée sur la caractéristique de faible densité des LD, qui les fait flotter jusqu’au sommet du gradient lors de la^{centrifugation 16}. La procédure d’extraction se compose de trois étapes principales : la collecte d’échantillons, l’ultracentrifugation pour la flottation LD et le lavage LD. Du saccharose (2,5 M) est ajouté au tampon pour protéger les LD, puis la vitesse de centrifugation est ajustée selon les exigences expérimentales ; en général, les grands LD peuvent être enrichis à des forces inférieures à 10 000 x g, tandis que des vitesses plus élevées (au-dessus de 10 000 x g) sont employées pour extraire de petits LD, car les LD plus grands peuvent se rompre dans ces conditions. Enfin, les LD extraits subissent plusieurs lavages pour éviter toute contamination, et la pureté de l’extraction est évaluée de manière préliminaire à l’aide de coloration BODIPY493/503.

Les méthodes conventionnelles d’isolation de la LD permettent principalement de récupérer en masse des populations hétérogènes de LD, limitant l’analyse des différences structurelles et fonctionnelles dépendantes de la taille. Le protocole actuel étend les approches standard en permettant l’enrichissement basé sur la taille des sous-populations de LD par centrifugation différentielle séquentielle, facilitant l’étude de la croissance, du renouvellement, du trafic intracellulaire et de l’utilisation différentielle par des voies lipolytiques ou autophagiques. Cette approche permet d’enrichir plutôt qu’une purification absolue, et un chevauchement partiel entre les fractions de taille peut survenir en raison de distributions continues de taille et de propriétés physiques partagées.

Protocole

Déterminer la taille des gouttelettes lipidiques ciblées pour l’enrichissement (Figure 1).

1. Installation du réactif

1. PBS : Pèse 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 3,58 g de Na₂HPO₄·12H₂O, et 0,24 g KH₂PO₄ dans 800 mL ddH₂O. Ajustez le pH à 7,4 avec HCl, mélangez soigneusement, et portez le volume à 1 L. Conservez à 4 °C jusqu’à 1 an après l’autoclavage.
2. Saccharose (2,5 M) : Pèser 856 g de saccharose et le dissoudre dans 400 mL de ddH₂O. Remuer soigneusement jusqu’à ce que le saccharose soit complètement dissous, puis ajuster le volume à 1 L. Autoclave la solution et conserver à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.
3. Tampon A : Pèser 1,79 g de Tricine et dissoudre dans 400 mL de ddH₂O. Ajuster le pH à 7,8 avec le KOH. Après ajustement du pH, ajoutez 50 mL de solution prépréparée de saccharose de 2,5 M. Mélangez soigneusement et ajustez le volume à 500 mL. Après l’autoclavage, le tampon peut être stocké à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.
4. Tampon B : Pèse 0,95 g HEPES, 1,49 g KCl et 0,038 g MgCl₂·6H₂O séparément dans 180 mL ddH₂O. Ajustez le pH à 7,4 avec KOH, mélangez soigneusement, et portez le volume à 200 mL. Après l’autoclavage, conservez à 4 °C pendant jusqu’à 3 mois.
5. PMSF (1 000x, 0,2 M) : Pèser 0,175 g de PMSF et dissoudre-le dans 5 mL de DMSO. Conserver à l’abri de la lumière à -20 °C pendant jusqu’à un an.
   REMARQUE : Le SPMM est hautement toxique ; des mesures de protection appropriées doivent être prises. Pendant la préparation, assurez-vous d’assurer une protection complète contre la lumière ; Le PMSF est difficile à dissoudre et peut être aliquoté dans des tubes microcentrifuge de 1,5 mL.

2. Extraction des LD des cellules

1. Culture de BMEC
   1. Récupérez cinq tubes de cellules BMEC congelées dans le réfrigérateur à -80 °C et décongelez-les rapidement dans un bain-marie à 37 °C. Centrifugez les tubes à 250 x g pendant 4 min 30 s après dégel complet.
   2. Jetez le milieu de cryoconservation avec une pipette, ajoutez 1 mL de 10 % de FBS pour resuspendre les cellules, mélangez et ajoutez doucement les cellules dans une plaque de culture cellulaire de 100 mm contenant 6 mL de 10 % de FBS. Balancez doucement la plaque pour assurer une répartition cellulaire uniforme et incubez à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   3. Surveillez la morphologie cellulaire au microscope et effectuez la subculture lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 % à 90 %.
      REMARQUE : Assurez-vous d’un état optimal des cellules et d’un nombre suffisant de cellules avant l’extraction de la cellule lucide afin d’améliorer le rendement et la reproductibilité.
   4. Jetez le substrat de culture d’origine dans la boîte de Petri avec une pipette, et ajoutez 1 mL de PBS le long de la paroi de chaque plat. Après avoir lavé deux fois, ajoutez 1 mL de trypsine à chaque plat et faites couver à 37 °C pendant 3 minutes 30 secondes.
   5. Observez au microscope si les cellules sont complètement digérées, ajoutez 1 mL de 10 % de FBS pour interrompre la digestion une fois celle-ci terminée. Suspendez doucement les cellules en pipettant, transférez-les dans un tube microcentrifuge de 2 mL, puis centrifugez à 250 x g pendant 4 min 30 s.
   6. Abandonnez le surnageant et répétez les procédures décrites à l’étape 1.2.
   7. Déployez les cellules en utilisant environ 30 gamelles de culture ou des vases de culture plus grands, ou utilisez des gamelles de culture plus grandes pour la culture cellulaire. Ajoutez 150 μmol/L de t10,c12-CLA (dilué dans du DMEM) pour traiter les cellules la veille de l’extraction. Utilisez 7 mL de milieu de culture par plat de culture de 100 mm. Le temps de culture dépend de la taille des sœurs à séparer.
      REMARQUE : Sur la base de l’optimisation préalable, traiter les BMEC avec t10,c12-CLA pendant 6 heures pour enrichir de grandes LD ou pendant 12 à 24 heures pour enrichir de petites LD. Comme les cellules contiennent peu de LD, des acides gras exogènes sont généralement ajoutés pour induire l’accumulation de LD. Dans cette étude, ajoutez t10,c12-CLA aux cellules cultivées pour induire l’accumulation des LD.
2. Collecte d’échantillons
   1. Jetez le médium d’origine, ajoutez 1 mL de PBS bien froid et lavez 3 fois. Ne jetez pas PBS lors du lavage final. En prenant 30 antennes de cellules de 100 mm par exemple, collectez des cellules de chaque 10 plaques dans un tube centrifugeuse de 15 mL, chaque tube contient environ 1x108, ce qui donne un total de 3 tubes centrifugeuses.
      REMARQUE : Maintenez tous les échantillons à ≤4 °C tout au long du processus d’extraction afin d’éviter la dégradation des protéines dans les LD.
   2. Après équilibrage, centrifugez à 1 000 x g, 4 °C pendant 10 minutes.
   3. Jetez le PBS. Ajoutez 10 mL de tampon A pré-préparé et 10 μL de PMSF (1 000x, 0,2 M) au tube centrifugeuse. Mélangez bien et faites couver sur glace pendant 20 minutes.
3. Lyse cellulaire et fractionnement initial
   1. Les cellules de perturbation utilisant un homogénéiseur ultrasonique de type sonde fonctionnaient en cycles pulsés de 5 s ALLUMÉ et 10 s ÉTEINT, ce qui donne un temps de sonication effectif total de 10 minutes sur une période de 30 minutes. Réglez l’instrument à 40 % de puissance (correspondant à une amplitude de sonde d’environ 76 μm) à l’aide d’une sonde de 3 mm de diamètre.
      REMARQUE : Conservez les échantillons sur la glace tout au long de la procédure pour éviter la surchauffe.
   2. Centrifugez l’homogénéat à 3 000 x g et 4 °C pendant 10 minutes pour éliminer les noyaux et les débris cellulaires. Collectez le surnageant sous forme de surnageant post-nucléaire (PNS).
4. Ultracentrifugation des LD flottants
   1. Filtrez le surnageant à travers un filtre cellulaire de 100 μm.
   2. Pipeter 10 mL de PNS dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Ajoutez 2 mL de saccharose (2,5 M) et 2 mL de tampon B séquentiellement au sommet du SNP (le volume de saccharose peut être réduit de manière appropriée tout en augmentant le volume du tampon B pour améliorer la pureté du LD), puis centrifugez pour la première fois (5 000 x g, 4 °C, 20 min).
   3. Après centrifugation, recueillez la couche lactée et crème de LD située en haut du tube. Pour collecter les LD, ajoutez d’abord 100 μL de Buffer B à un tube microcentrifuge de 1,5 mL, puis utilisez une pipette de 20 μL pour aspirer doucement la couche de LD flottante plusieurs fois, en collectant autant de LD que possible.
      REMARQUE : Les LD forment une couche crème flottante au sommet ; Évitez d’aspirer la solution sous-jacente autant que possible pour éviter la contamination.
   4. Effectuez une seconde centrifugation (10 000 x g, 4 °C, 30 min) et collectez les LD.
   5. Transférez la solution dans un tube ultracentrifuge compatible avec un rotor à godet pivotant, bouchez-le et équilibrez les tubes. Effectuer la troisième centrifugation dans une ultracentrifugeuse (50 000 x g, 4 °C, 40 min) et recueillir les LD.
      REMARQUE : Équilibrer précisément les tubes (jusqu’à 0,0001 g) pour assurer un fonctionnement sûr de l’ultracentrifugeuse.
   6. Après l’équilibrage, effectuer la quatrième centrifugation (150 000 x g, 4 °C, 50 min) pour continuer à collecter les LD. Optimisez la vitesse et la durée selon la taille cible de la LD.
      REMARQUE : Une centrifugation longue ou répétée à grande vitesse peut perturber les LD. En revanche, la centrifugation de courte durée à 10 000 x g lors du lavage élimine principalement les impuretés et a un impact minimal sur l’intégrité de la LD. Cette méthode est adaptable ; une optimisation peut être nécessaire pour différents types cellulaires ou tissus.
5. Lavage des LD
   1. Résuspendez les LD collectés dans le tampon froid B et centrifugez à 10 000 x g et 4 °C pendant 5 minutes.
   2. Retirez soigneusement le surnageant et répétez l’étape de lavage au moins quatre fois en utilisant le même volume de tampon, la même force centrifuge et le même temps de centrifugation. Pour les petits LD, augmentez la force centrifuge selon les besoins afin d’assurer une séparation efficace.
   3. Après le lavage final, concentrez les fractions LD, mélangez doucement et conservez à −80 °C.
      REMARQUE : N’omet pas les étapes de lavage, même si une certaine perte de lucidité est inévitable. Continuez à laver jusqu’à ce qu’il ne reste plus de débris visibles sur la membrane.

3. Extraction des LD des tissus

1. Collecte d’échantillons
   1. Prélever des échantillons de tissu mammaire bovin à partir de l’azote liquide. Pèser 5 g de tissu et décongeler sur la glace jusqu’à ce qu’il ne reste plus de cristaux de glace.
   2. Rincez le tissu avec du PBS ou du sérum physiologique.
   3. Réduisez le tissu en morceaux de 1 à 2 mm à l’aide de ciseaux chirurgicaux.
   4. Transférez le tissu haché dans un mortier pré-refroidi contenant 12 mL de tampon A et 10 μL de PMSF (1 000x, 0,2 M). Moudre le mélange sur de la glace pendant environ 10 minutes.
   5. Incubez l’homogénéate sur de la glace pendant 20 minutes.
   6. Après un broyage approfondi, collectez l’homogénéate dans un tube centrifugeuse de 15 mL.
   7. Centrifugeuse à 2 500 x g, 4 °C pendant 10 minutes. Le surnageant obtenu est le SNP.
2. Ultracentrifugation des LD flottants
   1. Filtrez le surnageant à travers un filtre cellulaire de 100 μm.
   2. Pipeter 10 mL de PNS dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Ajoutez 2 mL de saccharose et 2 mL de tampon B de façon séquentielle. Effectuer la première centrifugation (4 000 x g, 4 °C, 20 min). Ramasse ce tissu laiteux, crème et laiteux.
   3. Effectuez une seconde centrifugation (7 000 x g, 4 °C, 30 min) et collectez les LD.
   4. Effectuer une troisième centrifugation (10 000 x g, 4 °C, 40 min) et collecter les LD.
   5. Transférez le surnageant dans un tube SW40 et effectuez l’ultracentrifugation (50 000 x g, 4 °C, 50 min). Collecte les LDs.
   6. Effectuer une cinquième centrifugation (100 000 x g, 4 °C, 60 min). Collecte les LDs.
3. Lavage des LD
   Consultez la méthode de lavage pour les LD extraits par cellule.

4. Validation préliminaire de la pureté de la LD par coloration

1. Préparez à l’avance une solution de colorant fluorescent lipidique neutre de 10 μg/mL dans des conditions protégées par la lumière (BODIPY : Tampon B = 1:100, V/V).
2. Ajoutez une quantité appropriée de LD mixtes et du tampon B dans un tube microcentrifuge. Dans des conditions protégées par la lumière, ajoutez une quantité appropriée de solution fluorescente lipidique neutre. Mélangez soigneusement et incubez pendant 10 minutes.
3. Préparez une lame de microscope propre. Versez 2,5 μL du mélange sur la gaine de revêtement. Placez doucement la lame sur le mélange, évitant les bulles d’air. Observez sous un microscope à fluorescence inversée.

5. Validation de la pureté de la LD par Western blot

1. La concentration en protéines des fractions de LD a été mesurée à l’aide d’un kit de test protéique BCA.
2. Pour l’analyse Western blot, mélangez 20 μg de protéines de chaque échantillon avec 5x tampon de charge SDS et chauffez à 99 °C pendant 10 minutes pour assurer une dénaturation complète.
3. Ensuite, séparez les protéines par SDS–PAGE sur des gels de polyacrylamide à gradient de 10 % selon leur poids moléculaire.
4. Après électrophorèse, transférez les protéines sur des membranes PVDF préactivées, puis bloquez avec 5 % de BSA à température ambiante pendant 1,5 heure. Ensuite, incubez les membranes toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires, dont l’anti-périlipine 2 du lapin (1:500) et l’anti-β-actine du lapin (1:5000).
5. Lavez les membranes trois fois avec 1 TBST pendant 10 minutes chacune, puis incubez avec un anticorps secondaire anti-lapin de chèvre conjugué à HRP (1:5000) pendant 1,5 h à température ambiante.
6. Après trois lavages supplémentaires avec TBST, détectez les bandes protéiques à l’aide d’un kit de chimiluminescence améliorée (ECL) et visualisez avec un système d’imagerie en gel.

6. Points de pause et consignes de stockage

1. Gardez le PNS sur glace pendant 1 à 2 heures avant l’ultracentrifugation.
2. Gardez les LD collectés sur la glace pendant 1 à 2 heures avant de les laver. Pour un stockage à court terme, conservez les LD à 4 °C pendant jusqu’à 24 heures. Pour un stockage à long terme, stockez les LD à −80 °C et limitez les cycles de gel-dégel à un maximum afin de préserver l’intégrité des LD.
3. Pendant toutes les pauses expérimentales, conservez les échantillons sur la glace avec les bouchons fermés pour minimiser la contamination.

7. Dépannage

1. Couche flottante fine : ajustez le volume du tampon ou la force de centrifugation.
2. Mauvaise flottation : augmentez la vitesse de centrifugation ou prolongez le temps.
3. Contamination : assurez-vous de manipuler la stérilité et de filtrer des tampons.
4. Rupture du LD : garder les échantillons sur de la glace, réduire la force de centrifugation ou resuspendre doucement.

Résultats

Flux de travail et cadre méthodologique
Un schéma d’arbre de décision (Figure 1) a été établi pour guider la sélection des conditions de centrifugation selon les objectifs expérimentaux. Plus précisément, des forces centrifuges ≤10 000 x g ont été utilisées pour enrichir de grands LD (≥2 μm), tandis que des forces >10 000 x g ont été appliquées pour enrichir de petits LD (<1 μm). Ce cadre fournit une base pratique pour a...

Discussion

Les LD sont des organites uniques caractérisés par un noyau lipidique neutre enfermé par une monocouche de phospholipides. Ils bourgeonnent à partir du réticulum endoplasmique et changent dynamiquement de taille et de nombre, facilitant le transport intracellulaire et une communication étendue avec d’autres structures subcellulaires pour coordonner l’homéostasie lipidique^cellulaire 17,18,19. Ce ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,25 % de trypsine-EDTA	Gibco	25200072	Réactif
Kits de préparation rapide en gel 10 % PAGE	Beijing BIOMAN	PG112	Réactif
100 & mu ; Filtre à cellules M	Beyotime	FSTR100	Réactif
Antenne de culture cellulaire de 100 mm	Corning	490167	Réactif
Amersham Imager 600	GE Sciences de la Vie en Santé	600	Équipement
Autoclave	Panasonic	MLS-3751L	Équipement
Kit de test protéique BCA	Beijing Dingguo.	BCA01	Réactif
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Réactif
Centrifugeuse	Eppendorf		Équipement
DMEM	HyClone	SH30022.01	Réactif
DMSO	Solarbio	D8370	Réactif
Sérum bovin fœtal	Gibco	2492319	Réactif
HEPES	MedChemExpress	HY-D0857	Réactif
Anticorps secondaire anti-lapin conjugué HRP à AffiniPure	Proteintech	SA00001-2	Réactif
KCl	HUSHI	20030666	Réactif
KH2PO4	HUSHI	10017608	Réactif
MgCl2	HUSHI	20059028	Réactif
Na2HPO4· ; 12H2O	HUSHI	S112623	Réactif
NaCl	HUSHI	10019328	Réactif
Tampon de chargement instantané de protéines Omni-Easy	Technologie biomédicale épizymatique de Shanghai	LT101S	Réactif
Kit de détection de chimiluminescence ultra-sensible Omni-ECL	Technologie biomédicale épizymatique de Shanghai	SQ201	Réactif
PBS	HyClone	SH30256.01	Réactif
Pénicilline & Streptomycine 100 et plus :	NCM Biotech	CLOOC5	Réactif
Mesure de pH	METTLER TOLEDO	S220K	Équipement
Pipette	Eppendorf		Équipement
PMSF	Coolaber	CP8651	Réactif
Kit de transfert de membrane PVDF	GenScript	eBlot L1	Réactif
Rabbit anti-Perilipine 2	Abcam	15294-1-AP	Réactif
Anti-&bêta ;-actine du lapin	Proteintech	20536-1-AP	Réactif
Microscope à fluorescence inversée de qualité recherche	Olympe	IX73	Équipement
Saccharose	Solarbio	S8271	Réactif
SW 40 Ti Rotor	BECKMAN COULTER	331301	Équipement
Trans-10, acide linoléique conjugué cis-12	CAÏMAN	90145	Réactif
Tricine	Coolaber	CT11331	Réactif
Ultracentrifuge	BECKMAN COULTER	Optima XE-100	Équipement
Écraseur à cellules ultrasoniques	SCIENTZ	JY92-11N	Équipement