Lactylation lysine spécifique à un site via expansion du code génétique chez E. coli et les cellules de mammifères

Résumé

Cette étude a établi une méthode utilisant l’expansion du code génétique pour incorporer avec succès la lactyl-lysine (Klac) à des sites spécifiques de l’énolase-1 humaine (hENO1) et de la GFP superfolder (sfGFP) chez Escherichia coli et les cellules de mammifères.

Résumé

La lactylation est une modification post-traductionnelle (PTM) récemment découverte avec diverses fonctions biologiques. Depuis son identification initiale en 2019 comme régulateur de la polarisation des macrophages, la lactylation des histones est devenue un maillon clé reliant le métabolisme cellulaire à la régulation fonctionnelle. Biochimiquement, il s’agit du transfert covalent d’un groupe lactyle vers des résidus lysine, médié soit par des lactyltransférases utilisant le lactyl-CoA comme donneur d’acyl, soit par des synthétases d’aminoacyl-ARNt (AARS) via un intermédiaire lactyl-AMP. Par ces mecanismes, les niveaux de lactate intracellulaire sont directement associés à la modification et à la fonction des protéines. La lactylation intervient avec un ensemble de processus cellulaires critiques, allant de fonctions physiologiques telles que la régulation des gènes, la réparation de l’ADN, la reprogrammation métabolique et la modulation immunitaire, jusqu’aux processus pathologiques tels que la progression tumorale et la métastase. Malgré l’identification de nombreux sites de lactylation par la protéomique, atteindre une lactylation lysine spécifique à un site par mutagenèse reste un défi. Pour y remédier, nous utilisons la technologie d’expansion du code génétique, en utilisant une synthétase d’aminoacyl-lysine spécifique à la lactyl-lysine (KlacRS) et son ARNt apparenté afin d’incorporer précisément la lactyl-lysine (Klac) dans les résidus désignés. Cette stratégie permet de générer des variantes protéiques homogènement lactylées pour des études fonctionnelles directes. Ici, nous décrivons un protocole simplifié pour la lactylation protéique spécifique au site, validé à la fois dans les cellules d’Escherichia coli (E. coli) et de mammifères, en utilisant l’énolase-1 humaine (hENO1) et la GFP superplieuse (sfGFP) comme systèmes modèles.

Introduction

La lactylation de la lysine (Klac), initialement identifiée sur les histones, est apparue comme un nœud clé reliant le métabolisme tumoral aberrant à la régulation^{épigénétique 1}. L’accumulation de lactate résultant d’une amélioration de la glycolyse aérobie dans les cellules tumorales constitue une base métabolique pour la lactylation, permettant au lactate d’agir non seulement comme sous-produit métabolique, mais aussi comme une molécule de signalisation qui module directement la fonction des protéines. De plus en plus de preuves indiquent que la lactylation participe largement à l’initiation et à la progression tumorale en coordonnant la prolifération des cellules ^cancéreuses 2,3,4,5, la ^{métastase 6}, la reprogrammation métabolique⁷ et la résistance thérapeutique ^8,9.

Au niveau phénotypique, une lactylation élevée est étroitement associée à une agressivité tumorale accrue. Par exemple, dans le carcinome à cellules rénales à cellules claires (CCRC), la lactylation de H3K18 favorise la prolifération et la métastase en régulant à la hausse le récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes β (PDGFRβ), établissant une boucle de rétroaction positive entre l’accumulation de lactate et la signalisation^{oncogénique 10}. De même, dans le cancer colorectal (CRC), une lactylation élevée de H3K18 stimule la progression tumorale via une transcription accrue de l’amplificateur d’autophagie de type Rubicon (RUBCNL), favorisant ainsi la maturation des autophagosomes et soutenant la survie des cellules^{cancéreuses 11}.

Au-delà des effets directs sur l’agressivité tumorale, la lactylation médie également la reprogrammation métabolique tumorale en modulant l’expression et l’activité des gènes liés au^{métabolisme 7}. Dans le cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC), la lactylation des histones sous-régule les enzymes liées à la glycolyse tout en augmentant à la hausse les enzymes du cycle de l’acide tricarboxylique (TCA), augmentant l’absorption du glucose des cellules tumorales et aggravant la dysrégulation^{métabolique 12}. De manière cohérente, le profilage global du lactylomie révèle que la lactylation cible préférentiellement les enzymes impliquées dans les voies métaboliques centrales, notamment le métabolisme du glucose, le cycle du TCA, le métabolisme des acides aminés/acides gras, et ces modifications sont fortement corrélées à un phénotype tumoral^{agressif 7}.

Il est important de noter que les conséquences biologiques de la lactylation dépendent fortement du site, et cette modification est devenue un facteur clé de la résistance thérapeutique des tumeurs. Dans la CRC, la lactylation K673 de la recombinaison méiotique 11 (MRE11) améliore la réparation de la recombinaison homologue (HR), conférant ainsi une résistance à la chimiothérapie et aux inhibiteurs de poly(ADP-ribose) polypolymérase (PARP^{) 13}. Dans le glioblastome (GBM), l’interaction entre la famille A3 (ALDH1A3) de la famille de l’aldéhyde déshydrogénase 1 et la pyruvate kinase M2 (PKM2) augmente la production de lactate, induisant par la suite la lactylation de K247 de la protéine complémentaire croisée de réparation par rayons X 1 (XRCC1) pour améliorer la réparation des dommages à l’ADN, entraînant ainsi la radiorésistance et la chimiorésistance à la témozolomide^{(TMZ) 14}. Ces études soulignent collectivement qu’un contrôle précis de la lactylation à des résidus de lysine définis est essentiel pour la dissection mécaniste et le ciblage thérapeutique.

Les avancées en spectrométrie de masse à haute résolution ont révélé une lactylation généralisée à travers les enzymes métaboliques, les facteurs de transcription et les transducteurs de signalisation, soulignant son rôle large dans le contrôle du métabolisme, la transduction du signal et la physiologie^cellulaire 15,16,17,18. À ce jour, plusieurs enzymes d’auteur catalysant la lactylation ont été rapportées – par exemple, AARS1 médie la lactylation p53 pour favoriser la^{tumoygenèse 19}, et AARS1/2 régule la lactylation du cGAS pour supprimer l’immunité innée – pourtant ces enzymes sont sélectives au substrat et ne peuvent actuellement pas atteindre une lactylation totalement spécifique au site sur des protéines^{arbitraires 20}. Ainsi, le domaine reste confronté à la manière de manipuler Klac de manière dirigée à des fins de recherche ou thérapeutiques.

Les études fonctionnelles reposent encore principalement sur la mutagenèse orientée vers le site — en substituant typiquement une lysine (K) par de la glutamine (Q) pour imiter l’état non chargé des modifications acyl-lysine telles que l’acétylation ou la^lactylation 21,22,23,24. Cependant, cette approche présente des limites importantes pour récapituler fidèlement la lactylation native : la structure chimique et la géométrie des chaînes latérales de la glutamine diffèrent de celles d’une lysine lactylée, et il est important de noter qu’une substitution K vers Q ne peut pas distinguer les états acétylés et lactylés lorsque les deux modifications peuvent se produire au même endroit.

L’expansion du code génétique (ECG) offre une solution puissante à ces limitations en permettant l’incorporation directe d’acides aminés non canoniques dans des protéines situées à des sites définis. Grâce au dépistage positif d’une bibliothèque mutant Methanosarcina mazei pyrrolysyl-tRNA synthétase (MmPylRS), nous avions précédemment identifié un variant présentant une croissance dépendante du Klac. Ce mutant, porteur des mutations L301M, Y306L, L309A et C348F, a été désigné KlacRS1^25,26. KlacRS1 aminoacyle son ARNt orthogonal apparenté avec Klac, supprime le codon d’occlupe ambré et permet une incorporation efficace et spécifique à un site spécifique de Klac dans les protéines cibles. En plus de KlacRS1, plusieurs autres variantes d’aaRS capables d’incorporer Klac ont été signalées, notamment des LacKRS dérivés de MbPylRS (L270I/Y271L/L274A/C313F) et LacKRS3 (Y271M/C313S^)19,27, ainsi qu’un LacKRS dérivé de MmPylRS (C348T/Y384F⁾²⁸. Ensemble, ces outils constituent une boîte à outils génétique polyvalente pour produire des variantes de protéines lactylées spécifiques au site, afin de comprendre les conséquences biologiques des événements de lactylation individuels.

Dans nos études précédentes, nous avons appliqué ce système basé sur la GCE pour exprimer des protéines ALDOA portant une lactylation site-spécifique à Lys147 dans des cellules d’E. coli et de mammifères. Des analyses fonctionnelles ont démontré que la lactylation au niveau de Lys147 exerce un effet de rétroaction négative sur la glycolyse, améliore la stabilité thermique et chimique d’ALDOA, et favorise sa translocation du cytoplasme vers le noyau. Ces résultats ont non seulement révélé un mécanisme de régulation jusque-là non reconnu de l’ALDOA, mais ont également validé la robustesse, la polyvalence et l’utilité pratique de cette plateforme de lactylation spécifique^{au site 25,26}. En s’appuyant sur cette base, nous utilisons ici l’énolase-1 humaine (hENO1) et la superfolder GFP (sfGFP) comme exemples représentatifs pour décrire une stratégie rationalisée d’incorporation précise de Klac en utilisant notre système orthogonal KlacRS/tRNA.

Protocole

1. Mutagenèse du codon d’arrêt ambré pour le codage génétique de la lactyllysine en gène cible

1. Introduire un codon d’arrêt ambre TAG à la position 89 du gène hENO1 et à la position 149 du gènes fGFP via une mutagenèse dirigée par site selon le protocole du fabricant, purifier le produit PCR et effectuer la recombinaison homologue. Utilisez les apprêts suivants :
   ENO1-K89TAG-F CACAGAACAAGAGtagATTGAAACTGATGATCGAG
   ENO1-K89TAG-R TctaCTCTTGTGTGTGTGACGTTCAGTTTCTTG
   sfGFP-N149TAG-F CAACAGCCATtagGTGTATATCACCGCCGACAAGC
   sfGFP-N149TAG-R CACctaATGGCTGTTGAAGTTATACTCCAGC
   REMARQUE : Pour l’incorporation spécifique à un site de lysine lactylée, le site cible doit être muté en un codon d’arrêt ambré (TAG), ou d’autres codons non-sens, et TAA ou TGA doivent être utilisés comme codon d’arrêt véritable.
2. Décongeler les cellules compétentes DH5α sur glace, mélanger 5 μL du produit de recombinaison avec 50 μL de cellules, puis incuber sur glace pendant 30 minutes. Soumettez le mélange à un choc thermique de 45 s à 42 °C, puis posez-le sur de la glace pendant 2 à 3 minutes. Ajoutez 350 μL de LB de milieu et incubez à 37 °C en secouant (220 tr/min) pendant 1 heure.
3. Étalez les cellules sur une plaque LB préchauffée contenant de l’ampicilline et incubez à 37 °C pendant 12 à 16 heures. Choisissez deux colonies individuelles pour le séquençage Sanger afin de confirmer la mutation.

2. Expression de la protéine lactylée dans les cellules d’E. coli

1. Co-transformer 50 μL de cellules chimiquement compétentes en DH10B contenant environ 100 ng chacune de pBad-ENO1-K89TAG, qui code le gène cible, et pEvol-MmKlacRS1 (plasmide d’Addgène # 232157), qui code la paire KlacRS et tRNA.
2. Incubez le mélange sur glace pendant 25 minutes, faites un choc thermique à 42 °C pendant 45 s, puis revenez sur la glace pendant 3 minutes. Ajoutez 350 μL de LB à température ambiante, secouez vigoureusement à 220 tr/min pendant 1 heure à 37 °C.
3. Dispersez la culture cellulaire sur une LB/plaque complétée avec 100 μg/mL d’ampicilline (Amp₁₀₀) et 50 μg/mL de Chloramphénicole (Cm₅₀). Incubez les plaques à 37 °C pendant 12 à 16 heures.
4. Choisissez une seule colonie pour inoculer une culture de départ de 4 mL et incubez pendant la nuit. Le lendemain, étendez la culture nocturne à 400 mL de LB/_{ampère 100}Cm₅₀ , puis secouez vigoureusement à 220 tr/min, 37 °C jusqu’à atteindre 0,6-0,8 OD.
5. Induire avec 0,2 % de L-arabinose et 1 mM Klac ; incuber à 30 °C, 220 tr/min pendant 16 heures supplémentaires.

3. Codage génétique de la lactyllysine dans les cellules HEK 293T

1. Les cellules de graines dans des plaques à 12 puits à une densité de 1 x 10⁵ cellules par puits avec 1 mL de milieu DMEM. Après 24 heures d’incubation, lorsque la confluence cellulaire atteint 70 % à 80 %, effectuez la transfection.
   REMARQUE : Une confluence de 70 % à 80 % est recommandée pour la transfection, tandis que les tests de formation de colonies nécessitent des densités de semis plus faibles, qui doivent être déterminées empiriquement.
2. Pour préparer une solution d’ADN diluée, ajoutez 0,75 μg de pcDNA-sfGFP-N149TAG et pNeu-KlacRS (plasmide Addgene # 232155) dans un rapport 1:1 dans 38 μL de DMEM sans sérum avec un taux élevé de glucose. Pipeter doucement de haut en bas ou faire un vortex brièvement pour mélanger.
3. Pour préparer un réactif de transfection dilué, ajoutez 2,25 μL de réactif à transfection dans 38 μL de DMEM sans sérum avec un taux élevé de glucose. Faites doucement une pipette de haut en bas 3 à 4 fois pour mélanger.
   REMARQUE : La possibilité d’utiliser Opti-MEM dépend des instructions du fabricant, car sa teneur sérique peut interférer avec l’efficacité de la transfection.
4. Ajoutez immédiatement le réactif de transfection dilué à la solution d’ADN dilué d’un seul coup.
   REMARQUE : Ne mélangez pas les solutions dans l’ordre inverse.
5. Pipettez immédiatement 3x-4x ou faites un vortex brièvement pour mélanger. Incubez pendant 10 à 15 minutes à température ambiante pour permettre la formation de complexes de transfection/ADN.
   REMARQUE : Le complexe transfection/ADN doit être utilisé dans les 20 minutes suivant la préparation.
6. Ajoutez le mélange transfection/ADN de 50 μL goutte par goutte sur le milieu de chaque puits et homogénéisez le mélange en faisant doucement tourner la plaque.
7. À 6 h après la transfection, remplacez le milieu par du DMEM frais contenant 1 mM Klac. Culture pour 24 à 48 heures.
   REMARQUE : Sur la base de nos données précédentes, Klac à des concentrations de 1 à 5 mM n’a montré aucun effet cytotoxique sur les cellules²⁶. La concentration de travail de Klac doit être optimisée en fonction du niveau d’expression protéique. Si la protéine cible est sujette à la perte de la modification de la lactylation, l’administration d’inhibiteurs de la HDAC (par exemple, la trichostatine A) ou de l’inhibiteur de la sirtuine NAM (nicotinamide) est recommandée.

4. Purification par His-tag de la protéine lactylée dans les cellules d’E. coli

1. Prélever les cellules par centrifugation à 6 900 x g pendant 10 minutes à 4 °C. Resuspendez dans 50 mL de tampon de lyse (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl). Lyse par ultrasonicisation sur glace pour une impulsion de 3 s, intervalle de 8 s à 200 W pendant 30 minutes. Centrifugez à 13 800 x g, 4 °C pendant 30 minutes puis collectez le surnageant.
   REMARQUE : Si la protéine cible est susceptible au cisaillement mécanique, l’étape d’ultrasonicisation peut être remplacée par une lyse cellulaire douce à l’aide d’un réactif d’extraction protéique formulé adapté à E. coli.
2. Filtrez le surnageant à travers une membrane de 0,45 μm pour collecter les fractions solubles. Chargez les lysats clarifiés sur une colonne gravitationnelle Ni-NTA de 1 mL. Laver avec environ 5 mL de tampon A (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl,
   5 mM d’imidazole) jusqu’à ce qu’aucune protéine détectable ne soit trouvée dans l’éluat. Éluez la protéine avec 1 mL de tampon B (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 200 mM NaCl, 200 mM d’imidazole) pendant 5 fois. Garde toutes les fractions. Vérifiez la présence de protéines éluées avec un test rapide de Bradford.
3. Combinez les fractions de protéines purifiées et effectuez l’échange de tampon dans le tampon de stockage (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl). Aliquote les protéines concentrées dans 50 μL dans chaque tube, congele instantanément et stocke à -80 °C pour l’analyse suivante.

5. Caractérisation biochimique de la protéine lactylée

1. SDS-PAGE et Western Blotting
   1. Séparez la protéine par SDS-PAGE (90 V pendant 20 minutes, puis 150 V pendant 50 minutes). Colorez le gel avec du bleu Coomassie, chauffez pendant 15 s au micro-ondes, puis détinez avec une solution décolorante (40 % d’éthanol absolu, 10 % d’acide acétique glaciaire et 50 % d’eau déionisée) sur un shaker (50 tr/min, 15 min). Répétez l’étape de décoloration jusqu’à ce que les bandes protéiques soient clairement visibles.
   2. Activez une membrane PVDF dans le méthanol pendant 1 minute. Assemblez la pile de transfert dans l’ordre : éponge, papier filtre, gel, membrane, papier filtrant, éponge. Effectuer le transfert à 250 mA pendant 1 heure dans un tampon pré-refroidi. Bloquez la membrane avec 5 % de lait écrémé pendant 1,5 heure, puis lavez 3 fois avec TBST (10 min chacun).
   3. Incuber avec des anticorps primaires (Anti-His 1:10 000 ; Anti-L-Lactyl Lysine 1:1 000) à 4 °C pendant la nuit. Laver 3 fois avec TBST.
      REMARQUE : Les ratios de dilution optimaux doivent être déterminés empiriquement pour les anticorps obtenus à partir de différentes sources commerciales.
   4. Incubez avec un anticorps secondaire de lapin (1:10 000) pendant 1,5 h à température ambiante. Laver 3 fois avec TBST. Image utilisant la chimiluminescence et sauvegarde des données dans Image Lab.
2. Analyses de spectrométrie de masse
   1. Pour une analyse de masse intacte, diluez les protéines jusqu’à une concentration finale de 0,1 μg/μL avec de l’eau contenant 0,1 % d’acide formique (FA), puis soumettez-les à un système de chromatographie liquide ultra-haute performance (UPLC). La phase mobile était composée du solvant A (0,1 % d’AC dans l’eau) et du solvant B (acétonitrle, ACN) à un débit de 0,3 mL/min.
   2. Mesurez les poids moléculaires de hENO1-89Klac à l’aide d’un spectromètre de masse quadrupole-time-of-flight (Q-TOF) à haute résolution, avec la plage m/z réglée à 300-2000. Collectez et traitez toutes les données à l’aide du logiciel MassLynx.
   3. Pour l’analyse protéomique, analysez les lysats cellulaires digérés comme décrit précédemment, en utilisant un système de chromatographie liquide à nano-flux couplé à un spectromètre de masse tribride haute résolution équipé d’un analyseur. La phase mobile était composée du solvant A (0,1 % d’AO dans l’eau) et du solvant B (ACN/eau, 8:2, v/v) à un débit de 300 nL/min.
   4. Séparer les peptides sur une colonne capillaire C18 en phase inversée (75 μm x 250 mm) avec un gradient de 90 min : 3 %-8 % B (0-5 min), 8 %-28 % B (5-60 min), 28 %-38 % B (60-75 min), 38 %-100 % B (75-80 min) et 100 % B (80-90 min). Acquérir des spectres MS1 sur m/z 350-1800 avec une résolution de 120 000 et un objectif AGC de 4e5. Générer des spectres MS2 par fragmentation de dissociation collisionnelle (HCD) à haute énergie (énergie de collision = 32 %), avec une première masse de m/z 110, une résolution de 30 000, et un objectif AGC de 5e4.
3. Analyse de cytométrie en flux
   1. Lavez les cellules deux fois avec un tampon PBS pré-refroidi, suivi d’une centrifugation à 1 380 x g pendant 3 minutes après chaque lavage. Résuspendez la granule cellulaire obtenue après centrifugation dans 500 μL de tampon PBS et pipettez doucement pour mélanger. Filtrez la suspension cellulaire à travers une gaze stérile de 300 mailles, collectez le filtrat dans un tube de cytométrie en flux afin de minimiser les interférences des agrégats cellulaires lors de la détection. Analyser l’échantillon préparé à l’aide d’un cytomètre en flux avec deux lasers, avec excitation à 405 nm et détection à 488 nm pour les signaux de fluorescence correspondants.

Résultats

Nous avons d’abord évalué la spécificité d’incorporation de Klac dans les protéines d’E. coli. Le gène de l’énolase humaine 1 (hENO1) a été conçu pour contenir un codon d’arrêt ambré au résidu K89 (hENO1-89TAG), et cette construction a été co-exprimée avec le KlacRS orthogonal et sa paire d’ARNt apparentée chez E. coli. En l’absence de supplémentation de 1 mM en Klac, aucun hENO1 de longueur complète n’a été détecté ; en revanche, lorsque 1 mM de Klac a été ajouté au milieu de croissance, du hE...

Discussion

Ici, nous décrivons une stratégie pour l’incorporation spécifique à un site de Klac dans des protéines des cellules procaryotes et eucaryotes. En introduisant un codon d’arrêt ambre à la position souhaitée du gène cible et en le coexprimant avec la paire orthogonale KlacRS/tRNA dans les cellules hôtes, la lysine lactyl authentique peut être incorporée précisément dans les protéines des cellules vivantes, fournissant un outil puissant pour sonder la biologie spécifique à la lactylation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
6*his,Son tag Anticorps monoclonal recombinant	Proteintech	84814-1-RR	Une classe d’immunoglobulines spécifiques ciblant les 6&Times Son tag (un petit peptide composé de six résidus d’histidine consécutifs, HHHHHH) dans les protéines recombinantes.
Système UPLC ACQUITY	Eaux		Chromatographie liquide UltraPerformance
MAb anti-L-Lactyllysine du lapin	PTM Biolabs	PTM-1401RM	Une classe d’immunoglobulines spécifiques ciblant la L-Lactyl Lysine (Klac), une modification post-traductionnelle (PTM) des protéines.
Kit de clonage en une étape ClonExpress II	Vazyme  ;	C112	Grâce à une technologie de clonage simple et rapide et efficace de l’ADN sans interfusion, les fragments d’insertion peuvent être clonés directionnellement dans n’importe quel site de n’importe quel vecteur.
Cytomètre à flux CytoFlex	Beckmann Coulter		Cytomètre en flux avec détection à haute sensibilité et capacité d’analyse multicolore
DH10B	Biorabbit	EC005H-S	Un type de cellules compétentes pour la transformation plasmidique, le clonage génétique et le criblage bleu-blanc.
DH5 & alpha ;	Vazyme  ;	C502	Un type de cellules compétentes pour la transformation plasmidique, le clonage génétique et le criblage bleu-blanc.
Système EASY-nano LC 1200	Thermo Fisher Scientific		Nano-chromatographie liquide pour séparer des échantillons complexes à haute sensibilité et haute résolution
Spectromètre de masse Orbitrap Eclipse Tribrid	Thermo Fisher Scientific		un système phare de chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS) de type tribrid haut de gamme
Phanta Max ADN polymérase super-fidélité	Vazyme  ;	P505	Une enzyme unique de haute fidélité combinant amplification rapide et fidélité
PolyJet	SignaGen	SL100688	Le réactif de transfection in vitro à l’ADN de PolyJet est formulé comme un puissant réactif de transfection qui garantit une transfection efficace et reproductible avec moins de cytotoxicité.