Tous les animaux recevaient des soins humains conformément au Guide for the Care and Use of LaboratoryAnimals 18. Toutes les procédures animales ont été examinées et approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (numéro de protocole : 202300058) ainsi que par le Bureau de la Surveillance et de l’Utilisation des Animaux.
Les souris BALB/c femelles ont été utilisées comme donneuses, tandis que les souris C57BL/6J femelles ont été réceptrices d’allogreffes VCA. Au moment de la transplantation, les souris avaient entre 8 et 30 semaines, pesaient environ 20 à 30 g et étaient maintenues dans des conditions de logement standard. Toutes les données présentées dans cette étude ont été générées par un seul chirurgien.
1. Considérations chirurgicales générales
REMARQUE : Utilisez des instruments et consommables stériles et autoclavés (autoclave), et maintenez un champ de fonctionnement aseptique. Consultez le tableau des matériaux pour les instruments requis.
- Anesthésiez les souris à l’aide d’une chambre d’inhalation d’isoflurane et maintenez l’anesthésie via un cône respiratoire. Pour plus de détails, voir respectivement les sections 2 et 3.
REMARQUE : Bien que les souris donneuses et receveuses aient un poids corporel comparable, différentes concentrations d’isoflurane ont été utilisées en raison des différences d’invasivité chirurgicale et de charge nociceptive entre les procédures. La chirurgie du donneur implique un processus opératoire plus étendu et invasif, incluant une dissection tissulaire large et un prélèvement de greffons, qui génèrent des stimuli chirurgicaux et nociceptifs plus forts et nécessitent donc des concentrations plus élevées d’isoflurane pour l’induction et le maintien afin de maintenir une profondeur d’anesthésie stable. En revanche, la chirurgie du receveur est relativement moins invasive, consistant principalement en une exposition des vaisseaux cervical et une anastomose vasculaire ; En conséquence, des concentrations plus faibles d’isoflurane étaient suffisantes pour obtenir une anesthésie chirurgicale adéquate tout en minimisant le risque de dépression cardiovasculaire ou respiratoire excessive.
- Traitez le champ chirurgical avec une crème dépilatoire avant la préparation de la peau.
- Tout au long de la procédure, surveillez attentivement la fréquence cardiaque et la fréquence respiratoire (fréquence cardiaque d’environ 350-450 battements/minute et fréquence respiratoire d’environ 60-100 respirations/minute).
- Effectuer toutes les étapes chirurgicales sous un microscope avec un grossissement adapté aux besoins de la supermicrochirurgie.
REMARQUE : Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées sous un microscope opératoire équipé d’un objectif de 0,5× et d’oculaires de 10×, offrant une plage totale de grossissement d’environ 4× à 31,5×. Un grossissement plus faible (environ 4×) était utilisé pour l’incision cutanée et la dissection macroscopique, tandis qu’un grossissement plus élevé (jusqu’à environ 31,5×) était utilisé pour la dissection vasculaire, la pose des manches et l’anastomose microvasculaire.
- Sélectionnez la cautérisation bipolaire (6 W), la cautérisation monopolaire (Bovie ; réglage de puissance maximale) ou la ligature par suture pour l’hémostasie selon le stade opératoire et le contexte anatomique, comme décrit dans les sections suivantes.
2. Acquisition partielle du membre postérieur gauche par le donneur
- Assurez-vous que la bouillotte (100 °F) fonctionne correctement.
- Induire l’anesthésie en utilisant de l’isoflurane à 3,5 % administré dans une chambre d’induction avec un débit d’oxygène de 1 L/min, puis maintenir l’anesthésie à 3 % via un cône respiratoire avec un débit d’oxygène réglé à 0,8-1 L/min.
- Retirez les poils de l’abdomen jusqu’à la cheville de la souris donneuse à l’aide d’une crème dépilatoire.
- Marque une incision cutanée quadrangulaire, allant de la partie proximale des mamelons jusqu’à la proximité de l’articulation du genou (Figure 1).
REMARQUE : Privilégiez le membre postérieur gauche quand c’est possible, car il est plus facile à disséquer.
- Élever le lambeau cutané en commençant par son perforateur (artère et veine épigastriques inférieures superficielles), puis squelettiser selon les besoins.
- Transectez le ligament inguinal crânien et procédez à la dissection caudale. À ce stade, assurez-vous que les branches exposées sont coagulées avec la cautérisation bipolaire.
- Coagulez et disséquez le tissu adipeux environnant à l’aide d’une cautérité monopolaire plus grande afin d’obtenir une exposition complète des vaisseaux iliaques externes jusqu’au niveau des vaisseaux iliaques communs. Disséquez les tissus environnants des artères iliaques externes et communes à l’aide de catérage monopolaire plus petit.
- Fléchissez l’articulation du genou pour en identifier l’emplacement, puis ouvrez-la en utilisant la cautérisation bipolaire.
- Allongez à nouveau l’articulation du genou et transectez le biceps fémoral, le quadriceps fémoral et d’autres muscles associés à la cautérité bipolaire pendant la coagulation.
REMARQUE : À cette étape, la quantité de muscle incluse dans la greffe doit être minimisée dans la plage qui ne compromet pas l’artère fémorale. Cette précaution est prise pour éviter la déviation de la trachée de la souris receveuse ou l’altération des mouvements des membres antérieurs en raison du gonflement de la masse musculaire greffée dans la région cervicale.
- Utilisez la cautérisation bipolaire pour libérer la tête fémorale.
- Coagulez soigneusement toutes les branches restantes issues des vaisseaux iliaques externes et communs, ainsi que du tissu musculaire environnant, et disséquez avec cautérité bipolaire tout en maintenant l’hémostasie.
REMARQUE : À ce stade, la greffe reste connectée à la souris donneuse uniquement à la jonction où les vaisseaux iliaques communs se ramifient de l’aorte abdominale et de la veine cave inférieure.
- Perforez la membrane entre l’artère et la veine à un point éloigné du greffon, puis accrochez un rétracteur ophtalmique à l’artère.
REMARQUE : Placez toujours l’artère dans le rétracteur, jamais dans la veine, car la veine est trop fragile.
- Séparez soigneusement la veine et l’artère aussi distalement que possible à l’aide de ciseaux Potts courbés.
REMARQUE : Cette étape nécessite un soin et une précision particuliers. Bien que la séparation longue et méticuleuse évite les complications ultérieures.
- Liguez les branches collatérales avec Prolene 10-0.
REMARQUE : Évitez la cautérisation à ce stade. Disséquez les deux côtés de la branche avant la ligature pour éviter les blessures.
- Liguer l’artère avec 8-0 Prolène. Placez un point de suture à base sur l’artère comme marqueur pour éviter les torsions lors de l’anastomose vasculaire.
REMARQUE : Desserrez la suture de maintien pour éviter d’endommager le pédicule.
- Liguez la veine avec 8-0 Prolène. Placez des points de suture de soi à deux endroits de la veine pour faciliter son passage à travers le manche. Comme la veine est très fine et que la paroi du vaisseau peut parfois être difficile à distinguer, insérez un nylon 4-0 dans la lumière pour faciliter la pose des points de suture de soutien.
- Faites passer la veine à travers le brassard à l’aide de sutures de maintien et serrez la manche avec une pince vasculaire.
- Évenvez la paroi du vaisseau et fixez-la au poignard avec du nylon 9-0.
- Restaurez le brassard à sa forme d’origine en libérant la déformation avec la pince vasculaire après fixation (Figure 2).
- Rincez la greffe avec 2 mL de solution physiologique héparinée préparée à une concentration finale de 50 UI/mL à travers l’artère (Figure 3).

Figure 1 : Souris donneuse avec des marques cutanées préopératoires délimitant les incisions prévues sur le membre postérieur gauche. La direction crânienne est indiquée en haut de l’image. L’incision est orientée de la proximité juste aux mamelons à la proximale de l’articulation du genou (Étape 2.4). Ce marquage garantit une exposition adéquate du perforateur épigastrique inférieur superficiel. Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Placement du brassard veineux sur la veine greffée. La veine iliaque externe est évertie sur un brassard en polyéthylène et fixée avec du nylon 9-0 (Étape 2.18). Cette étape assure la pernocence de la lumière et offre une interface rapide et fiable pour une anastomose ultérieure de bout en bas avec la veine jugulaire recevrice. (A) Utiliser une pince vasculaire pour surlever la veine, permettant une visualisation claire à la fois de la lumière veineuse et de la lumière interne du brassard. (B) Après avoir fixé la veine au bracelet avec des sutures en nylon 9-0 interrompues, confirmer la fixation circonférentielle de la paroi veineuse au brassard (pointe de flèche bleue). (C) Après fixation, restaurez la manche à sa forme d’origine en libérant la déformation avec la pince vasculaire (pointe de flèche verte). Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Greffon prélevé montrant l’allogreffe partielle du membre postérieur et le pédicule vasculaire. Le côté gauche de l’image correspond au côté proximal du greffon, et le côté droit correspond au côté distal. Les vaisseaux iliaques externes et communs sont préservés en continuité avec la coiffe musculaire et l’os fémoral. L’artère et la veine restent séparées sur plusieurs millimètres pour éviter la torsion et permettre une orientation optimale lors de l’insertion. Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
3. Chirurgie du receveur
- Assurez-vous que la bouillotte (100 °F) fonctionne correctement.
- Induire une anesthésie avec 2,5 % d’isoflurane et maintenir avec 2 %.
- Positionnez le membre supérieur droit vers le bas plutôt qu’horizontalement pour faciliter l’exposition du champ chirurgical.
- Administrez 0,5 mL de solution saline par voie sous-cutanée pour l’hydratation.
- Appliquez un lubrifiant ophtalmique avant l’opération, car il s’agit d’une procédure de survie.
- Retirez les poils de la région cervicale à l’aide d’une crème dépilatoire, d’au moins 1 cm autour du site de l’incision prévu.
- Réalisez une petite incision circulaire de la peau (environ 10 mm). Insérez les ciseaux en caudal à travers l’incision et ouvrez-les doucement pour disséquer le tissu sous-cutané de la poitrine, créant ainsi une poche pour la pose des greffons.
- Exposez la veine jugulaire externe en cautérisant et en divisant ses branches avec une cautérisation monopolaire plus grande.
- Uteriser le muscle sternocléidomastoïdien en utilisant la cautérisation bipolaire, puis le diviser.
- Identifiez et disséquez soigneusement l’artère carotide commune.
- Réaliser des anastomoses vasculaires :
- Anastomose artérielle : pincez l’artère carotide commune aussi prossimement que possible avec un pince vasculaire, puis ligatez et divisez-la à 8-0 Prolène à un site juste proximal de la bifurcation des artères carotides externe et interne.
- Anastomose artérielle : Effectuer une anastomose de bout en bout avec du nylon 11-0 ou 12-0 en utilisant six points de suture interrompus (quatre points antérieurs au début, inverser l’artère, puis compléter la paroi postérieure). Insérez du nylon 5-0 dans les deux vaisseaux et utilisez-le comme stent (Figure 4).
REMARQUE : Lors des dernières étapes de l’anastomose, les deux derniers points doivent être passés mais non attachés. Le nylon 5-0 est ensuite retiré avant de nouer ces points pour compléter la fermeture.
- Anastomose veineuse : pincez la veine jugulaire externe aussi proximalement que possible avec une pince vasculaire, liguez-la aussi distalement que possible avec 8-0 Prolène, puis divise-le.
- Anastomose veineuse : Insérez la brassette dans la veine jugulaire externe et fixez-la avec du nylon 9-0, en veillant à éviter la torsion du pédicule.
REMARQUE : Compléter l’anastomose veineuse avant le déclampage artériel, car la réperfusion précoce peut prédisposer à la thrombose.
- Administrez 0,5 mL de solution physiologique par voie sous-cutanée pour l’hydratation et placez de l’alginate autour de l’anastomose artérielle pour minimiser les saignements du site.
- Déclampez d’abord la veine, puis l’artère (Figure 5).
- Positionnez soigneusement le greffon dans la poche thoracique sous-cutanée, en évitant le déplacement de la trachée ou la restriction des mouvements du membre antérieur. Assurez-vous que le perforateur est bien non torsad.
- Administrez des analgésies à ce stade (Meloxicam 5 mg/mL, 100 μL injection sous-cutanée ; Buprénorphine 0,3 mg/mL, 80 μL injection sous-cutanée).
- Fermez la peau avec des points de suture 6-0 Ethilon, placés fermement pour éviter le desserrement lors des mouvements postopératoires (Figure 6).

Figure 4 : Anastomose artérielle. La direction crânienne est indiquée en haut de l’image. Des monofilaments en nylon sont insérés dans la lumière du récipient. La suture de maintien artérielle placée lors du prélèvement du greffon sert de marqueur d’orientation lors de l’anastomose pour éviter la torsion artérielle. L’anastomose est réalisée avec du nylon 11-0 et des pinces n°5 (Étape 3.11.2). Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 5 : Reperfusion du greffon après le déclampage artériel et veineux. La direction crânienne est indiquée en haut de l’image. Une fois les anastomoses artérielles et veineuses terminées (artère : de bout en bout ; veine : à base de manche), confirmez l’orientation artérielle et veineuse correcte sans torsion, et les pinces sont relâchées — d’abord sur la veine, puis sur l’artère — pour rétablir la circulation sanguine. Un changement immédiat de couleur de la palette de la peau confirme la réussite de la perfusion (Étape 3.13). Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 6 : Apparition finale immédiate postopératoire. La greffe est positionnée hétérotopiquement dans la région cervicale sans tension ni déviation trachéale (Étape 3.14). L’incision cutanée est fermée avec des sutures Ethilon 6-0 interrompues, après confirmation immédiate d’une pulsation artérielle adéquate et d’un retour veineux (Étape 3.16). Cette configuration minimise l’automutilation et facilite l’inspection quotidienne des greffes. Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
4. Soins postopératoires
- Surveillez la souris une fois par jour.
REMARQUE : Ajustez la surveillance à l’état de l’animal et du greffon en consultation avec le vétérinaire. Les souris réceptrices de la maison individuellement pour éviter les blessures par greffe.
- Administrez des analgésiques (Meloxicam 5 mg/mL, 100 μL d’injection sous-cutanée ; Buprénorphine 0,3 mg/mL, 80 μL injection sous-cutanée). De plus, si des signes de déshydratation sont observés, administrez une solution saline normale par voie sous-cutanée pour une supplémentation en liquides.
- Évaluez la greffe et effectuez des examens physiques quotidiens, en documentant les résultats avec des photographies prises à l’aide du même appareil (Figure 7).

Figure 7 : Évolution clinique du paddle cutané de greffe au fil du temps. Les photographies frontales en série illustrent l’évolution postopératoire. (A) Jour de l’opération, bonne perfusion de greffons. (B) POD 7, montrant la résolution de l’érythème et la stabilisation de la couleur de la peau. (C) POD14, la palette cutanée reste viable, avec une repousse visible des poils au jour 14 postopératoire. Cette étude se concentre sur la technique chirurgicale, et les schémas immunosuppresseurs variaient selon les cas. Dans le cas montré à la Figure 7, CTLA-4-Ig (500 μg) a été administré intrapéritonéalement sur DOS et POD 2, 4, 7 et 9, suivi de Lag3 BiTS intrapéritonéal sur POD 11, 13, 16, 18 et 21 (50 μg sur POD 11 ; 100 μg par la suite). Imprimé avec permission ; droits d’auteur détenus par Eduardo D. Rodriguez, MD, DDS. Abréviations : DOS = jour de l’opération ; POD = jour postopératoire ; BiTS = Suppresseurs bi-fonctionnels à restriction tissulaire. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.