Ce protocole expérimental démontre un modèle de rat canulé par canulation profonde du canal lymphatique cervical qui permet une évaluation directe et quantitative du drainage lymphatique depuis la région de la tête. Le modèle facilite une analyse détaillée des solutés dérivés du système nerveux central (SNC), des populations de cellules immunitaires, ainsi que la distribution et le nettoyage des traitements ciblant le SNC.
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Article de méthode
Modèle de rat canulé par canal lymphatique cervical pour évaluer le transport lymphatique depuis la tête et le cerveau
Dans cet article
Résumé
Résumé
La lymphe s’écoule du système nerveux central (SNC) via une série de vaisseaux lymphatiques (LV) et de ganglions qui convergent vers les canaux lymphatiques cervicaux. En plus de maintenir l’équilibre des fluides, ces canaux lymphatiques jouent un rôle clé dans le transport d’une grande variété de substances, notamment des métabolites endogènes, des molécules de signalisation, des cellules immunitaires et des médicaments petits et macromoléculaires. Cela est essentiel pour l’homéostasie physiologique et le fonctionnement immunitaire tant dans les régions intracrâniennes (par exemple, le cerveau) que dans les cavités nasale et buccale. Le drainage lymphatique altéré du cerveau a de plus en plus été associé à une série de troubles neurologiques et neurodégénératifs. La canulation des voies lymphatiques cervicales permet de collecter la lymphe drainant la tête et le cerveau, permettant de mesurer la concentration et le taux de transport de diverses substances via le système lymphatique. Des changements dans ces facteurs en réponse à différents défis (par exemple, médicaments, stress, traumatismes) et maladies (par exemple, AVC, infection, maladie d’Alzheimer) peuvent également être détectés. Ici, nous décrivons un modèle anesthésié de rat canulé par canal lymphatique cervical profond, qui permet la collecte de la lymphe pendant plusieurs heures après l’opération. La méthode peut être combinée avec des technologies d’imagerie et multi-omiques pour mesurer un large éventail de paramètres d’intérêt dans la lymphe. Cela facilite la recherche physiologique et pathophysiologique fondamentale sur la région de la tête et du cou, ainsi que des études pharmacokinétiques/pharmacodynamiques de médicaments, en particulier pour le traitement des maladies du SNC.
Introduction
Le système lymphatique, qui est réparti dans tout le corps, est essentiel pour maintenir l’homéostasie des fluides, réguler les réponses immunitaires et faciliter le transport des nutriments et des molécules designalisation 1. Les lymphatiques périphériques commencent dans les capillaires lymphatiques, qui collectent le liquide interstitiel et les solutés et s’écoulent dans de plus grands vaisseaux lymphatiques collecteurs (LV) possédant une couche musculaire lisse environnante ; Ces vaisseaux livrent ensuite la lymphe aux ganglions locaux pour le traitementimmunitaire 2,3. Le réseau lymphatique qui draine la région de la tête est important pour l’homéostasie des organes à la fois intracrânien (par exemple, le cerveau) et extracrâniens (par exemple, les cavités nasales et buccales). La structure et l’organisation du réseau lymphatique extracrânien sont considérées comme similaires à celles des lymphatiques périphériques dans tout le corps, tandis que le système lymphatique intracrânien présente des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles uniques (voir Figure 1 pour une représentation schématique détaillée dans les modèles de rats)4,5. Bien que les VE typiques soient absents dans le parenchyme cérébral, les fonctions lymphatiques sont médiées par le système spécialisé de transport lymphatique glial-dépendant (glymphatique) qui facilite l’échange entre le liquide céphalorachidien (LCR) et le liquide interstitiel (ISF)6. Alors que le système glymphatique permet le mélange de la FIS dans le parenchyme cérébral avec le LCR, les VE méningée, périvasculaire et nasopharyngée transportent les solutés du LCR loin de la cavité crânienne. Plus précisément, la voie lymphatique méningée dirige le LCR de l’espace sous-arachnoïdien vers les VE méningées, reliant la dynamique des liquides intracrâniens à la clairance lymphatiquepériphérique 7. Parallèlement, les voies périneuronales permettent l’écoulement de LCR et de solutés associés le long des gaines crâniennes et spinales, notamment via les nerfs olfactifs jusqu’au plexus lymphatiquenasopharyngé 5,8. Le travail simultané de ces systèmes maintient l’homéostasie fluide dans lecerveau 6,7,8. Les avancées récentes dans la compréhension du système lymphatique drainant le SNC ont apporté de nouvelles perspectives sur la physiologie et la physiopathologie cérébrales. Ces résultats pourraient offrir de nouvelles voies d’intervention thérapeutique dans les maladies duSNC 9.
Figure 1 : Représentation schématique des voies de dégagement lymphatique du SNC. Ces voies comprennent (A) la voie glymphatique via les espaces périvasculaires ; (B) la voie lymphatique nasopharyngée, et (C) les VE méningées. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Les réseaux lymphatiques qui s’épuisent de la tête et du SNC convergent vers les canaux lymphatiques cervicaux situés dans le cou, où la lymphe est filtrée à travers les ganglions cervicales avant d’entrer dans la circulation systémique. Les ganglions lymphatiques cervicaux sont classés en ganglions superficiels (SLN) et profonds (dCLN) selon leur localisation anatomique dans le cou. Des modifications de la composition du liquide lymphatique au sein des canaux lymphatiques cervicaux reflètent des variations physiopathologiques sous-jacentes dans le cerveau, la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (MP), les traumatismes crâniens (TCC) et le trouble cognitif post-AVC (PSCI) comme exemplesreprésentatifs 9,10,11,12,13 . Notamment, dans la MA, un drainage altéré des protéines amyloïdes-β (Aβ) et des protéines tau phosphorylées (P-tau) via ces voies lymphatiques a été impliqué comme un facteur contribuant à la progressionde la maladie 9,10,14. En reliant directement les conduits lymphatiques aux veines adjacentes pour rediriger le drainage lymphatique, l’anastomose veineuse lymphatique (LVA) est étudiée chez les animaux comme chez l’humain comme stratégie thérapeutique pour améliorer le flux lymphatique depuis le SNC, facilitant ainsi la clairance de l’Aβ dans le cerveau et retardant potentiellement la progression de l’AD6, 15, 16. L’importance de cette voie est également illustrée par des observations chez des souris soumises à une ablation chirurgicale des ganglions lymphatiques cervicaux (lymphadénectomie), ce qui a entraîné une réduction de la dégagement lymphatique cervical. Une dégagement altérée conduit à une accumulation toxique d’Aβ et de P-tau, avec activation ultérieure des voies de signalisation kinase pathologiques. Ces changements sont associés à une aggravation progressive de la tauopathie de type AD et à un risque accru de comportements anxieux etdépressifs 14,16. De plus, des études basées sur le LCR suggèrent que les tumeurs du SNC, telles que les lymphomes cérébraux, peuvent physiquement obstruer la clairance lymphatique par les voies lymphatiques profondes du col tout en augmentant simultanément les concentrations d’oncoprotéines dans leLCR 9,17,18. Les preuves issues d’études basées sur l’inflammation du SNC indiquent également que les cellules issues des méninges peuvent migrer via les VE méningées vers les ganglions lymphatiquescervicales 8,19. Ces cellules sont principalement composées de lymphocytes, avec des populations plus petites de cellules dendritiques, de macrophages et de cellulesendothéliales 19,20. Lors de l’inflammation ou après une lésion ou une chirurgie du SNC, le trafic cellulaire immunitaire lymphatique devient manifestement renforcé, accompagné de niveaux élevés de biomarqueurs immunitaires tels que les cytokines, les chimiokines et d’autres médiateursinflammatoires 21.
En plus de ses rôles pathophysiologiques, le réseau lymphatique cervical est de plus en plus reconnu comme un canal important pour la disposition des médicaments. Des études animales antérieures ont démontré que plusieurs formulations de médicaments conçues pour l’administration du SNC peuvent subir une dégagement du cerveau via les conduits lymphatiques et ganglions du col de l’utérus (à des degrés divers), illustré par des agents à base de nanoparticules administrés intracérébralement (par exemple, lamotrigine, talazoparib) et des biologiques (par exemple, anticorps monoclonaux, protéines tracantes radiomarquées)22,23,24,25. Chez l’humain, des études d’imagerie IRM ont démontré que certaines molécules, comme le gadobutrol, subissent un transport actif du système glymphatique vers les voies lymphatiquescervicales.
Comme mentionné précédemment, les ganglions lymphatiques cervicaux, qu’ils soient les SNL et les n°C d, drainent la lymphe à partir de régions distinctes de la tête ; cependant, les régions crâniennes spécifiques drainées par chaque ganglion restentinconnues 27,28. Les zones de drainage qui se chevauchent, la variabilité anatomique interindividuelle et les différences structurelles interespèces potentielles compliquent davantage la description des schémas de drainage lymphatique cervical chez les animaux etles humains 29. Au sein du réseau lymphatique cervical complexe, les voies lymphatiques profondes du col ont été identifiées comme les principales voies de sortie du LCR, situées en aval des LV nasopharyngé etméningé 8. Comparé aux canaux lymphatiques superficiels cervicaux, qui forment des réseaux fins et variables dans le tissu sous-cutané et diffèrent fortement en taille et en ramifications entre les rats individuels, le canal lymphatique cervical profond offre une voie plus accessible et pratique pour collecter la lymphe dérivée du SNC dans des modèles animauxde petite taille 20,30. Le protocole actuel vise donc à établir une méthode fiable pour collecter la lymphe du canal lymphatique profond du col de l’utérus.
Seul un nombre limité d’études menées au cours de la dernière décennie ont décrit la collecte de liquides lymphatiques cervicaux pour étudier les maladies du SNC ou analyser la distribution des médicaments. Une étude précédente décrivait la mesure des concentrations de médicaments dans la lymphe cervicale par rinçage ou pressement de liquide provenant de sections de tissu isolées (comme celles adjacentes à un seul dCLN)31. Cependant, les protocoles expérimentaux pour la collecte continue de lymphe des canaux cervicales chez les petits animaux de laboratoire, en particulier les rats, restent sous-développés. Ce protocole établit une méthode facilement accessible et reproductible pour la canulation du canal lymphatique cervical (rat) afin de permettre une collecte continue de la lymphe et d’étudier le transport lymphatique du SNC, les réponses immunitaires et la pharmacocinétique. Son principal avantage réside dans la capacité à quantifier le flux et la composition lymphatique sur des intervalles de temps définis, permettant ainsi la mesure quantitative des médicaments, lipides, acides gras et constituants cellulaires. En particulier, ce modèle capture les processus de transport lymphatique qui ne sont pas suffisamment représentés par des techniques d’échantillonnage ou d’imagerie plasma/LCR, offrant ainsi de nouvelles perspectives sur la disposition des médicaments du SNC, le transport des lipides et nutriments, ainsi que la signalisationimmunitaire 20.
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Protocole
La ou les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par le comité d’éthique animale de l’université et ont été réalisées conformément aux directives éthiques expérimentales de l’Université pharmaceutique de Chine. Avant de commencer toute procédure liée aux animaux, obtenez les approbations nécessaires du comité d’éthique institutionnel ou organisationnel concerné. Des rats mâles Sprague-Dawley (SD) pesant entre 220 et 250 g sont utilisés comme animaux expérimentaux. Les animaux sont approvisionnés auprès de fournisseurs d’animaux expérimentaux autorisés (voir le Tableau des matériaux) et sont logés dans des cages dédiées avec un accès libre à la nourriture et à l’eau jusqu’au début de l’expérience. Dans ce protocole, la canulation du canal lymphatique profond du col gauche est décrite comme un exemple représentatif. Actuellement, il existe peu de preuves décrivant des différences anatomiques entre les canaux lymphatiques profonds gauche et droit. D’après les observations d’expériences précédemment réalisées, aucune différence significative n’a été notée entre les deux camps, y compris au niveau des débits lymphatiques.
1. Précautions et procédures de sécurité
- Effectuer toutes les procédures conformément aux directives institutionnelles de biosécurité, et tout le personnel doit recevoir une formation adéquate aux techniques microchirurgicales, à la manipulation expérimentale des animaux et à la sécurité chimique avant de mettre en œuvre ce protocole.
- Portez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié, y compris une blouse de laboratoire, des gants chirurgicaux et des lunettes de protection, tout au long de la procédure. Comme un anesthésique volatil (isoflurane) est utilisé et peut provoquer une dépression du système nerveux central et une toxicité cardiovasculaire chez l’humain après une exposition prolongée, effectuer la procédure dans un environnement bien ventilé. Les aliments et boissons ne doivent pas être apportés au laboratoire, et il faut garantir que l’eau courante soit facilement accessible en permanence.
- Manipuler tous les objets tranchants, y compris les seringues, les lames de rasoir et les microciseaux, avec soin et les jeter immédiatement après utilisation dans des récipients à objets tranchants désignés ; En aucun cas les objets tranchants jetables ne doivent être réutilisés.
- Considérez tous les échantillons biologiques (par exemple, la lymphe collectée) et les fluides corporels animaux (par exemple, le sang) comme potentiellement dangereux, et manipulez tout le matériel de collecte avec soin tout en éloignant les échantillons de la zone chirurgicale. En cas de blessure accidentelle par piqûre d’aiguille ou de contact cutané avec des substances dangereuses, lavez immédiatement la zone affectée avec de l’eau et du savon et signalez l’incident conformément aux protocoles de sécurité institutionnels.
2. Préparation la veille de l’opération
- Jeûne ou nourrissez les rats selon les exigences de l’expérience spécifique. Ce protocole ne prescrit pas un état spécifique de jeûne ou d’alimentation alimentée.
- Préparez une solution anticoagulante en diluant de l’héparine ou de l’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) à une concentration finale de 10 UI/mL. Préchargez ce mélange (environ 0,7 mL) dans une seringue d’insuline stérile de 1 mL équipée d’une aiguille de 30 G, pour pré-enrober la face interne de la canule en polyéthylène (PE) (utilisée pour la canulation des canaux lymphatiques). Conservez ce mélange préparé dans des conditions stériles jusqu’à utilisation.
- Préparez des canules pour la collecte d’échantillons de lymphe en assemblant une canule PE en configuration tête-queue, utilisant un tube de 0,5 mm de diamètre extérieur (OD), 0,3 mm de diamètre intérieur (DI) pour les deux sections terminales et un tube de 0,6 mm d’extérieur et 0,5 mm de diamètre intérieur pour la section centrale.
- Coupez les segments de la canule à des longueurs de 2 cm pour la partie proximale reliant l’aiguille de la seringue, 40 cm pour la partie médiane, et 8 cm pour la partie distale destinée à la canulation.
- Coupez et biseautez l’extrémité distale de l’ensemble de la canule à un angle d’environ 45° afin de faciliter une insertion fluide dans le canal lymphatique cervical. Voir la Figure 2 pour une illustration détaillée de l’assemblage de la canule.
REMARQUE : Ce biseau facilite une insertion fluide dans le canal lymphatique et réduit le risque d’obstruction en augmentant la surface transversale efficace. Après une canulation réussie, la section proximale (2 cm) est déconnectée, et la lymphe est collectée directement à l’extrémité proximale exposée de la section centrale (comme décrit en détail aux étapes 4.9 & 4.10).
Figure 2 : Schéma de l’ensemble de la canule (hors échelle). Le schéma illustre les dimensions de chaque composant du tube en PE assemblé utilisé pour construire la canule. De gauche à droite, la canule assemblée sera désormais désignée respectivement comme l’extrémité proximale, la section centrale et l’extrémité distale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
- Préparez le système d’inhalation d’anesthésie en préchargeant de l’isoflurane liquide dans le récipient pressurisé équipé d’un vaporisateur. Avant utilisation, effectuez un test (amorçage) du vaporisateur pour confirmer l’étanchéité à l’air et garantir un débit de gaz stable et constant.
- Si nécessaire, préparez le candidat à un test dans un véhicule adapté. Réaliser des études de stabilité pour confirmer l’intégrité de la formulation pendant le stockage et tout au long de la période d’administration. Inclure des agents supplémentaires (par exemple, des colorants biologiques comme Evans Blue) lorsque cela est applicable.
- Préparez les contenants pour la collecte de la lymphe en pré-pesant les tubes stériles de microcentrifuge et en enregistrant leur poids initial. Étiquetez chaque tube séquentiellement selon les moments de collecte prévus (par exemple, intervalles horaires). Ajoutez de l’héparine concentrée (ou EDTA) à chaque tube et retirez le solvant par évaporation par dépression d’azote, laissant 2 à 5 UI d’héparine séchée (ou EDTA) par tube pour éviter une dilution inégale de la lymphe collectée.
3. Préparatifs immédiats avant l’opération
- Vérifiez la perméabilité de chaque canule en rinçant avec la solution anticoagulante préparée. Fixez une seringue à l’extrémité proximale de la canule assemblée et libérez doucement un petit volume de solution. Assurez-vous que la solution sorte en douceur par l’extrémité distale sans signe de fuite. Si une fuite est détectée, comme l’indique généralement le liquide s’échappant au ou aux points de connexion, il faut abandonner tout l’ensemble de la canule et en reconstruire un nouveau selon l’étape 2.3.
REMARQUE : Cette étape pré-enduit simultanément la surface interne de la canule avec un anticoagulant (cette étape peut également être réalisée la veille de l’opération, afin que la canule soit pré-enduite toute la nuit). - Commencez à administrer de l’isoflurane inhalé à travers un masque à cône de nez environ 5 minutes avant le début de l’opération. Maintenir l’anesthésie tout au long de la procédure à un débit d’accouchement de 0,4 à 0,6 L/min sous une pression de 101,3 kPa à 20 °C. Assurez-vous de la profondeur de l’anesthésie en évaluant la réponse au pincement des orteils.
- Surveillez en permanence la profondeur de l’anesthésie. Euthanasiez immédiatement le rat si des signes de détresse ou d’instabilité physiologique sont observés.
- Placez le rat sur le dosé sur un coussin chirurgical chauffé maintenu à 37 °C. Inclinez la tête et étendez le cou, en utilisant un petit support (oreiller) si nécessaire, pour maximiser l’exposition de la région cervicale. Sécuriser la tête dans le masque anesthésique pour assurer une administration continue d’isoflurane et maintenir doucement les membres antérieurs à l’aide d’élastiques ou de rubans chirurgicaux pour minimiser les mouvements pendant l’intervention.
- Rincez la fourrure de la région cervicale avec une solution stérile normale pour faciliter le rasage. Raser soigneusement tout le site chirurgical (à l’aide d’une lame de rasoir de sécurité à double tranchant), généralement la région du cou et de la clavicule, afin d’assurer l’élimination complète du poil avant l’incision (voir la Figure 3A pour un exemple de la zone rasée du cou).
- Nettoyez toute la zone rasée avec des désinfectants, comme un agent contenant de l’iode.
- Marquez le site de l’opération en traçant une ligne pointillée de 2,5 cm pour confirmer la longueur de l’incision initiale. Placez la ligne légèrement à droite de la ligne médiane du corps du rat. Placez l’extrémité supérieure de l’incision environ 1 à 1,5 cm sous la lèvre inférieure (voir la Figure 3B pour un exemple du site de l’incision, avec des mesures aidées par une règle).
Figure 3 : Préparation du site chirurgical. (A) La région du cou est rasée en préparation de l’incision ; (B) longueur et emplacement approximatifs de l’incision, indiqués par la ligne pointillée de 2,5 cm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
4. Canulation du canal lymphatique cervical
- Placez le rat la tête pointée vers l’opérateur. Utilisez un microscope pour cette étape en raison du diamètre relativement petit du canal lymphatique cervical.
- À l’aide d’un scalpel stérile, incisez soigneusement la couche superficielle de la musculature cervicale le long de la marque de 2,5 cm mentionnée précédemment, orientée presque parallèlement à la ligne médiane (voir la Figure 4A pour la couche superficielle de peau ouverte).
- Séparez doucement les couches musculaires restantes, principalement le fascia cervical superficiel, pour exposer l’artère cervicale, généralement reconnaissable à sa coloration rouge.
- Rétractez le muscle sternomastoïdien et la glande sous-mandibulaire et inclinez-les délicatement du champ chirurgical pour faciliter l’identification du canal lymphatique cervical. Utilisez un expanseur tissulaire pour maintenir la fenêtre chirurgicale et un coton tige pour maintenir temporairement le tissu musculaire à distance tout en localisant le ganglion lymphatique et le canal lymphatique associé. Assurez-vous que l’expanseur tissulaire est en place tout au long de la canulation (voir la Figure 4B pour la fenêtre chirurgicale ouverte avec l’expanseur tissulaire en place).
- Localiser le canal lymphatique cervical (de préférence au microscope) : Le canal apparaît comme un vaisseau opaque, incolore, d’environ 0,2 à 0,5 mm de diamètre, et s’étend immédiatement parallèlement à l’artère carotide. Un ou plusieurs dCLN adjacents, couleur chair, peuvent souvent être observés le long du canal lymphatique cervical (voir la Figure 4C pour une vue microscopique du canal lymphatique cervical profond exposé et d’un dCLN adjacent).
REMARQUE : Les canaux lymphatiques cervicales ont généralement une couleur très similaire à celle des tissus environnants, et leur identification nécessite souvent une inspection attentive, en particulier chez les rats ayant plus de tissu adipeux. Pour la pratique chirurgicale (mais pas pour les études sur le transport lymphatique de médicaments ou de substances endogènes), l’Evans Blue peut être injecté sous le cou sous le cou au début de l’opération afin que le canal lymphatique cervical soit mieux visualisé lorsque le colorant s’écoule via les lymphatiques. - À l’aide d’une paire de pinces émoussées, faites doucement passer à travers les tissus conjonctifs séparés et maintenez les pinces en position afin de garantir que le canal lymphatique cervical reste clairement visible dans le champ chirurgical.
- Isolez soigneusement le canal lymphatique cervical des tissus conjonctifs et adipeux environnants par dissection contondante, en prenant particulièrement soin d’éviter les dommages, car le vaisseau est extrêmement fragile.
- Utilisez une paire de microciseaux pour faire une petite incision dans la moitié supérieure du canal exposé. Ne détachez pas complètement le conduit ; Les deux moitiés doivent rester intactes.
- Vérifiez et assurez-vous que la canule préparée, préalablement enrobée d’une solution anticoagulante (comme décrit à l’étape 2.3), est exempte de bulles d’air en effectuant un rinçage doux. Juste avant l’insertion, saisir soigneusement l’extrémité distale de la canule avec des pinces, en l’orientant de façon à ce que la face biseautée soit orientée vers le haut. Ensuite, avancez doucement la canule d’environ 2 mm dans le canal à travers l’incision, en la dirigeant vers la tête (voir la Figure 4D pour une illustration de la canulation réussie). La profondeur réelle d’insertion peut varier selon le rat individuel.
REMARQUE : Comme l’insertion de la canule est relativement peu profonde dans cette procédure, un point de fixation supplémentaire sur la zone environnante peut être utile. Cela se fait en créant une petite perforation secondaire cutanée (trou) à environ 1,5 cm de la fenêtre chirurgicale à l’aide de ciseaux. Cette ouverture sera stabilisée davantage lors des étapes suivantes (par exemple, avec une suture ou un adhésif). La figure 4E illustre cette étape dans le contexte de l’utilisation de l’adhésif de tissu. La canule doit être passée à travers le trou pour aider à sécuriser sa position. - Détachez la seringue d’insuline ainsi que le segment proximal court (2 cm) de la canule du reste de l’ensemble de la canule. La lymphe peut alors être collectée directement à l’extrémité proximale exposée du segment central de plus grand diamètre. Surveillez la pointe distale de ce segment collecteur pendant 1 à 2 minutes. Confirmez la réussite de la canulation par un écoulement visible, lent et régulier du liquide lymphatique par le canal canulé.
- Une fois la canulation confirmée comme étant réussie, sécuriser la canule en appliquant une petite goutte d’adhésif tissulaire cyanoacrylate avec une pipette à la fois au site de l’incision du canal lymphatique et au trou de fixation secondaire (voir la figure 4E pour une démonstration de fixation de la canule). Faites particulièrement attention à éviter d’obstruer le vaisseau ou d’altérer le flux lymphatique.
- Observez le flux lymphatique pendant plusieurs minutes pour confirmer un écoulement régulier (une gouttelette visible se forme généralement à l’extrémité de la canule en moins d’une minute). Une fois vérifié, retirez soigneusement l’expanseur tissulaire de la fenêtre chirurgicale et repositionnez la glande sous-mandibulaire à son emplacement d’origine.
- Fixez un tube microcentrifuge pré-marqué recouvert d’anticoagulant (voir Étape 2.6) à l’extrémité distale de la canule pour collecter la lymphe en flux libre.
Figure 4 : Canulation du canal lymphatique cervical. (A) Site d’incision dans la région du cou ; (B) fenêtre chirurgicale ouverte avec un expanseur tissulaire en place et la glande sous-mandibulaire rétractée vers la droite ; (C) canal lymphatique cervical et un dCLN visualisés au microscope. (D) Canulation réussie, indiquée par la ligne pointillée verte (vue microscopique). (E) Un adhésif tissulaire a été appliqué sur le site de l’incision, et une ponction cutanée secondaire a été réalisée à l’aide d’une pipette. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
5. Période post-chirurgicale et administration des médicaments
- À la fin de la canulation des canus lymphatiques cervicaux, repositionnez toutes les couches musculaires à leur emplacement initial. Ensuite, fermez l’incision cutanée avec des points de suture et/ou un adhésif tissulaire ; En général, une incision de 2,5 cm de long peut être correctement fermée avec 8 points de suture (voir la figure 5A pour une fenêtre chirurgicale fermée par suture). Retirez le(s) élastique(s) ou les rubans chirurgicaux de contrainte sur les membres antérieurs à l’issue de cette étape.
- Administrez les médicaments dans le LCR par une voie appropriée, telles que l’intra-cisterna magna (ICM), l’intra-cervébraventriculaire (ICV) ou l’injection intrathécale lombaire (LIT). En prenant l’administration de la MCI comme exemple, identifiez le site d’injection à la citerne magna, située à la base du crâne et visible comme la seule dépression molle sur la surface dorsale. Raser la fourrure environnante selon les besoins pour faciliter la visualisation (voir la Figure 5B pour une zone indiquée et appropriée pour l’injection ICM).
REMARQUE : Pour maintenir la pression intracrânienne (ICP) lors de l’injection ICM, un volume équivalent de LCR est souvent prélevé avant l’administration du médicament. Il est recommandé d’utiliser une nouvelle seringue pré-remplie pour l’injection. Plier l’aiguille de la seringue peut faciliter l’administration (voir la Figure 5C pour une démonstration de l’injection ICM avec une aiguille de seringue pliée). - Gardez le rat allongé sur le coussin chirurgical chauffé (maintenu à 37 °C) pour préserver la température corporelle après l’injection et tout au long de la période de prélèvement.
Figure 5 : Prise en charge post-opératoire. (A) Site d’incision fermé utilisant une suture en soie. (B) Emplacement approximatif de la citerne magna avec la fourrure autour rasée. (C) Administration d’un candidat médicament en ICM à l’aide d’une seringue à insuline avec une aiguille pliée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
6. Collecte et analyse d’échantillons de lymphe
- Collectez la lymphe en continu dans des tubes microcentrifuges recouverts d’anticoagulant, en les remplaçant à intervalles prédéterminés (généralement toutes les heures). Conservez les échantillons collectés dans des poches de glace à l’aide d’une glacière. Voir la Figure 6 pour un échantillon de lymphe cervicale collecté dans un tube de microcentrifuge.
- À la fin du processus de prélèvement de la lymphe, euthanasiez le rat de manière humaine selon les protocoles appropriés.
- Déterminez le débit lymphatique en mesurant le volume de lymphe collecté à chaque intervalle planifié (horaire).
- Mesurer les concentrations de médicaments (ou de substances d’intérêt) dans la lymphe à l’aide de méthodes analytiques appropriées, y compris le HPLC, HPLC-MS ou des kits de test disponibles dans le commerce, afin de caractériser leur cinétique de dégagement du SNC via le système lymphatique.
- Calculez le transport de masse du médicament lymphatique en multipliant les concentrations mesurées par les volumes lymphatiques correspondants.
Figure 6 : Prélèvement d’échantillons de lymphe. Photographie d’un échantillon collecté (environ 100 μL) dans un tube de microcentrifuge. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.
7. Manipulation post-procédure et élimination des déchets
- Stockez temporairement des rats euthanasiés dans des conteneurs dédiés à déchets médicaux dans une zone de stockage frigorifique dédiée (par exemple, un réfrigérateur) jusqu’à ce qu’ils soient collectés et éliminés par une équipe professionnelle de traitement des déchets médicaux.
- Collectez tous les objets tranchants jetés dans un contenant désigné pour objets tranchants, séparé de tous les autres déchets.
- Jetez tous les autres objets non tranchants utilisés dans l’expérience (par exemple, coton-tige-coton, élastiques, canules en PE) dans des sacs médicaux, et ne les jetez pas avec des déchets ménagers ou généraux. Veillez à ce qu’aucun objet tranchant ne soit placé dans ce sac.
- Nettoyez et désinfectez tous les outils réutilisables restants conformément aux protocoles de laboratoire.
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Résultats
Un ensemble de données représentatif des débits lymphatiques horaires (mL/h) a été obtenu à l’aide du modèle de canulation lymphatique cervicale (voir la Figure 7 pour le tableau correspondant). Dans cette expérience impliquant trois rats d’étude (n = 3), la lymphe a été collectée en continu dans des tubes microcentrifuge, qui ont été remplacés toutes les heures sur une période de 6 heures.
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Discussion
Ce protocole établit une méthode reproductible pour canuler le canal lymphatique cervical chez les rats, permettant une collecte continue de lymphe sur de longues périodes. Avec une formation microchirurgicale adéquate, la procédure peut être réalisée efficacement et permet d’obtenir des échantillons lymphatiques constants dans des conditions physiologiques stables, maintenues par une anesthésie continue, ce qui la rend adaptée à un usage expérimental de routine. Une fois maîtrisée, la p...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrent ou relation personnelle connue qui aurait pu influencer le travail rapporté dans cet article.
Remerciements
Les auteurs remercient sincèrement M. Zhenglin Hao et Mme Jie Zhao du Centre d’expérimentation animale de l’Université pharmaceutique de Chine pour leur soutien dans la conduite d’expériences animales.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguille de calibre 30 | Yushou Santé | Utilisé pour connecter l’extrémité proximale de la canule (0503) avec la seringue d’héparine | |
| Distributeur d’anesthésie avec vaporisateur | Société d’instruments YYUN | ||
| Pinces contondantes | Sciences de la vie RWD | F22002-10 ; | |
| Cotonne-tiges | Biotechnologie Shultz de Qingdao | MQ-02 | Utilisé pour maintenir temporairement le tissu musculaire en place |
| Coussinet chirurgical chauffant | Shanghai Yiheng Instruments | Dimension 15 et les périodes ; 20 cm | |
| Héparine sodique | Technologie biochimique Shanghai Aladdin | H123383 | Dilution requise avant utilisation |
| Seringue à insuline (1 mL) | Yushou Santé | U100-1ML | Utilisé uniquement pour le pré-revêtement d’héparine |
| Solution d’isoflurane pour inhalation | Sciences de la vie RWD | R510-22-10 | Utilisé pour l’anesthésie via vaporisateur |
| Stylos marqueurs | N’importe quelle marque | N/A | |
| Tube microcentrifuge (1,5 mL) | Équipement expérimental de Nantong Hairui | HR10003 | Utilisé pour la collecte de la lymphe |
| Micro-ciseaux | Sciences de la vie RWD | GD234BA0007925 | |
| Suture chirurgicale en nylon ; | Shanghai Yiheng Instruments | 4-0 35CM | |
| Pipette (réglable en volume, plage de mesure de 5 à 50 et mu ; L) | Dragon Laboratory Instruments Limited | 7030301006 | Utilisé uniquement pour mesurer l’adhésif de tissu |
| Pointes de pipette ; | Biosharp Sciences de la Vie | BS-10-T | Utilisé uniquement pour transférer de l’adhésif de tissu, sans volume spécifique requis |
| Canule en polyeyhylène (PE) 0,5 mm de diamètre, 0,3 mm de diamètre intérieur (0503) | AniLab Instruments Scientifiques (Ningbo) | PE-0503 | |
| Canule en polyeyhylène (PE) 0,6 mm de diamètre, 0,5 mm de diamètre intérieur (0605) | AniLab Instruments Scientifiques (Ningbo) | PE-0605 | |
| Lames de rasoir | Gillette Shanghai | Q31/0115000301C004 | Utilisé uniquement pour le rasage de fourrure |
| Élastique | N’importe quelle marque | N/A | Utilisé pour retenir les membres antérieurs des rats |
| Souverain | N’importe quelle marque | N/A | |
| Lames scapel (#23) | Sciences de la vie RWD | S31010-01 | |
| Solution de chlorure de sodium (0,9 %) pour perfusion | Shijiazhuang n° 4 pharmaceutique | H20066533 (numéro d’approbation) | Utilisé uniquement pour rincer la fourrure |
| Sprague-Dawley Rats | Technologie animale de laboratoire de la rivière Pékin Vital | 101 | Poids de 220 à 250 grammes, pas d’exigence d’âge |
| Lumière chirurgicale | Bio-Tech Heo de Pékin | XHA011-1 | |
| Microscope chirurgical | Technologie optoélectronique Shanghai Cewei | SMZ755T | Microscope disséquant sans étage mécanique peut être équipé d’un support rétractable |
| Adhésif de tissu | Vétérinaire 3 ans | 1469SB | Ingrédient principal cyanoacrylate ; |
| Expanseur tissulaire (colibri) | Sciences de la vie RWD | R22029-04 | Plage d’expansion 20 mm/4 cm |
Références
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