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Article de recherche
Cette étude identifie une diminution de la diversité du microbiote intestinal et des voies métaboliques modifiées dans le diabète de type 2 (DT2), mettant en lumière une augmentation des protéobactéries et une diminution des taxons bénéfiques, suggérant que la dysbiose microbienne est associée au DT2DM et pourrait contribuer à sa physiopathologie.
La hausse mondiale du diabète de type 2 (DT2DM) souligne la nécessité de mieux comprendre ses mécanismes biologiques sous-jacents, en particulier ceux impliquant les interactions hôte-microbiome. Cette étude visait à caractériser la diversité microbienne intestinale, la composition taxonomique et les voies métaboliques prédites chez les patients nouvellement diagnostiqués DT2 par rapport au groupe non diabétique apparié (NM). Des échantillons de selles fraîches ont été analysés à l’aide du séquençage 16S rDNA. La diversité alpha (indices de Chao, ACE, Shannon et Simpson) et la diversité bêta ont été calculées pour évaluer la structure des communautés microbiennes. Les différences taxonomiques ont été évaluées à l’aide de tests de Wilcoxon à somme des rangs et de l’analyse linéaire discriminante taille de l’effet (LEfSe). La prédiction des voies fonctionnelles a été réalisée à l’aide d’une investigation phylogénétique des communautés par reconstruction d’états non observés (PICRUSt2) à partir des annotations KEGG et MetaCyc. L’analyse de randomisation mendélienne (RM), incluant la pondération inverse de la variance, la MR-Egger et les méthodes de médiane pondérée, a été appliquée pour évaluer les associations génétiquement prédites entre les taxons microbiens et le DT2DM. Les résultats ont montré une richesse microbienne réduite, comme en témoignent des indices de Chao et d’ACE plus faibles, ainsi qu’une structure de diversité modifiée, comme en témoignent des indices de Shannon plus bas et de Simpson plus élevés, chez les patients atteints de diabète de type 2, accompagnés de changements de composition significatifs. Une augmentation de l’abondance relative des Protéobactéries et une diminution de l’abondance de taxons bénéfiques tels que Lachnospiraceae et Blautia ont été observées. La prédiction fonctionnelle a indiqué une diminution de l’abondance des voies liées à la voie du phosphate pentose non oxydative, à la biosynthèse de l’isobutanol et à la biosynthèse de la L-isoleucine. L’analyse par IRM a fourni des preuves complémentaires soutenant des associations entre des taxons microbiens spécifiques et la susceptibilité au DT2DM. En conclusion, la DT2DM est associée à une richesse microbienne réduite, à une structure de diversité modifiée et à des changements taxonomiques et fonctionnels distincts. Ces résultats soulignent la pertinence du microbiote intestinal dans la DT2DM et soutiennent l’utilité potentielle des biomarqueurs basés sur le microbiome et des stratégies thérapeutiques. D’autres études sont nécessaires pour valider ces résultats et clarifier les mécanismes sous-jacents.
Le diabète sucré de type 2 (DT2DM) est devenu l’une des maladies chroniques à la croissance la plus rapide au monde, provoquée par une urbanisation rapide, des régimes alimentaires occidentalisés et des modes de vie de plus en plussédentaires 1,2. Il est un facteur majeur de la morbidité et de la mortalité mondiales et impose un fardeau important pour la santépublique 3. Bien que la susceptibilité génétique joue un rôle, l’augmentation rapide de l’incidence du DT2DM met en lumière l’importance des déterminants environnementaux etmétaboliques 4. L’identification des mécanismes biologiques modifiables est donc essentiel pour améliorer les stratégies précoces de détection et de prévention. Des avancées récentes ont identifié le microbiote intestinal comme un régulateur clé de l’homéostasiemétabolique 5. L’écosystème microbien intestinal influence le métabolisme du glucose, la fonction immunitaire, l’intégrité de la barrière intestinale et l’inflammation chronique de faible intensité, autant de facteurs centraux dans la pathogenèse duDT2DM 6. La dysbiose a été associée à l’obésité, à la résistance à l’insuline, à l’endotoxémie et à un bilan énergétique altéré, suggérant un lien mécaniste entre les altérations microbiennes et la progression de lamaladie 7. De plus, des métabolites microbiens, dont les acides gras à chaîne courte, les acides biliaires et les acides aminés à chaîne ramifiée, ont été impliqués dans la modulation de la sensibilité à l’insuline et du métabolisme del’hôte 8.
Bien que l’accumulation de preuves soutiennent le rôle du microbiome intestinal dans le DT2DM, la plupart des études existantes reposent sur des conceptions observationnelles, qui limitent l’inférence causale. Des approches alternatives, telles que la métagénomique shotgun et la métabolomique ciblée, peuvent fournir des informations fonctionnelles à plus haute résolution mais sont souvent limitées par le coût, la complexité computationnelle et la faisabilité limitée dans les études exploratoires ou à l’échelle pilote. En revanche, le séquençage 16S rDNA est une méthode rentable et largement adoptée pour profiler la composition des communautés microbiennes, bien que sa résolution taxonomique soit limitée au niveau de l’espèce et qu’elle ne puisse pas quantifier directement les métabolites fonctionnels. Ainsi, le séquençage 16S rDNA a été sélectionné pour cette étude comme une approche rentable et évolutive adaptée aux cohortes cliniques exploratoires, tout en permettant une intégration avec la prédiction fonctionnelle en aval et des cadres analytiques complémentaires. Ainsi, l’intégration du profilage microbien basé sur le 16S avec la prédiction fonctionnelle en bioinformatique et des approches complémentaires telles que la randomisation mendélienne (MR) peut fournir un cadre équilibré pour explorer à la fois les relations compositionnelles et potentiellement causales.
Notamment, il subsiste un manque relatif de données ciblant spécifiquement les patients nouvellement diagnostiqués et atteints de diabète de type 2 naïfs au traitement. Dans ces populations, les altérations microbiennes sont moins susceptibles d’être perturbées par des interventions pharmacologiques, en particulier la metformine, connue pour remodeler significativement la composition et la fonction du microbioteintestinal 9. Cela représente une lacune importante dans la littérature actuelle, car de nombreuses études actuelles incluent des populations de patients hétérogènes avec des expositions au traitement variables et une intégration limitée du profilage du microbiome avec des approches analytiques génétiquement informées.
Dans ce contexte, la présente étude visait à caractériser la diversité du microbiote intestinal, la composition taxonomique et les voies fonctionnelles prédites chez les patients nouvellement diagnostiqués atteints de DT2 par rapport au groupe NM, en utilisant le séquençage de l’ADNr16S et une analyse bioinformatique. De plus, la randomisation mendélienne a été appliquée à partir de données d’association génomique accessibles publiquement pour explorer les associations génétiquement prédites potentielles entre des taxons microbiens spécifiques et le risque de DT2DM. Cette stratégie analytique combinée permet des insights complémentaires issus du profilage des communautés microbiennes et des données génétiques au niveau de la population. Plus précisément, le séquençage 16S rDNA permet une caractérisation directe de la composition microbienne dans la population étudiée, tandis que la randomisation mendélienne utilise des instruments génétiques issus de cohortes indépendantes pour évaluer si les associations observées sont cohérentes avec les relations génétiquement prédites. Cette intégration vise à répondre à une limitation clé des études sur le microbiome d’observation en fournissant des preuves complémentaires soutenant la robustesse des associations microbiote–DT2. Par conséquent, l’intégration de ces approches vise à fournir une validation croisée plutôt qu’une redondance, renforçant ainsi l’interprétabilité des associations microbiote–DT2.
La présente étude se concentre sur trois aspects. Premièrement, elle évalue les altérations du microbiote intestinal chez des patients DT2 nouvellement diagnostiqués et naïfs au traitement afin de réduire la confusion due aux interventions pharmacologiques. Deuxièmement, il intègre le profilage taxonomique avec les voies fonctionnelles prédites afin de fournir une vue au niveau systémique des changements métaboliques associés au microbiote. Troisièmement, il intègre une analyse de randomisation mendélienne pour évaluer si les associations observées sont compatibles avec des relations génétiquement prédites, fournissant ainsi une triangulation méthodologique. Collectivement, ces aspects fournissent un cadre complémentaire et reproductible pour l’analyse du microbiome plutôt qu’une étude purement descriptive, distinguant ce travail des études antérieures qui reposent généralement sur des plans d’observation à méthode unique et n’intègrent pas le profilage microbien, la prédiction fonctionnelle et l’inférence génétiquement informée dans un cadre analytique unifié.
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Toutes les procédures impliquant des participants humains ont été examinées et approuvées par le Comité d’éthique de l’hôpital Chongqing Chenjiaqiao (approbation n° 20240131). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant la collecte de l’échantillon. Tous les échantillons de selles et les informations sur les participants ont été traités à l’aide de codes d’étude désidentifiés, comme indiqué dans le tableau des matériaux.
Sélection et inscription des participants
Les patients nouvellement diagnostiqués atteints de DT2 ayant visité l’hôpital Chongqing Chenjiaqiao entre juin 2023 et décembre 2023 ont été dépistés pour leur éligibilité. Les participants étaient inscrits dans le groupe DM s’ils avaient entre 20 et 65 ans, avaient reçu un nouveau diagnostic de DT2, acceptaient de fournir un échantillon de selles frais et avaient complété l’évaluation des antécédents médicaux et les examens cliniques requis. Les volontaires en bonne santé recrutés durant la même période ont été inclus dans le groupe non diabétique (NM) et ont été appariés au groupe DM aussi étroitement que possible en termes d’âge, de sexe et de caractéristiques démographiques générales. Les participants étaient exclus s’ils présentaient des troubles hématologiques, des maladies du système nerveux central, des maladies rhumatismales actives, des maladies auto-immunes, des infections gastro-intestinales aiguës ou chroniques, de diarrhée chronique, de constipation, d’ulcères gastro-intestinaux actifs ou en cicatrisation, de maladie inflammatoire de l’intestin, du syndrome de l’intestin irritable, de la tuberculose intestinale, des tumeurs gastro-intestinales, d’autres malignités, d’une insuffisance cardiaque sévère, d’une insuffisance hépatique sévère, d’une insuffisance rénale sévère, d’autres métaboliques sévères maladies, malnutrition, immunodéficience, troubles métaboliques congénitales, maladies psychiatriques, usage de sédatifs-hypnotiques ou abus de drogues. Les participants étaient également exclus s’ils avaient reçu des antibiotiques, des agents suppresseurs d’acide, des médicaments pour la motilité gastro-géniale, des probiotiques, des glucocorticoïdes ou des immunosuppresseurs dans le mois précédant la prélèvement des selles. De plus, les personnes ayant eu de la diarrhée, subi une chirurgie gastro-intestinale ou une endoscopie gastro-intestinale, ou signalé des changements soudains de l’environnement de vie ou des habitudes alimentaires dans le mois précédant la prélèvement des selles ont été exclues. Un code d’étude unique a été attribué à chaque participant éligible avant la collecte de l’échantillon. Parmi la cohorte éligible, 12 participants nouvellement diagnostiqués DT2 et 12 participants NM ont été sélectionnés pour un séquençage en aval de l’ADNr 16S et des analyses du microbiome basées sur la disponibilité des échantillons et les exigences de qualité du séquençage.
Collecte et stockage des échantillons de selles
Chaque participant a reçu un récipient stérile de collecte de selles, étiqueté uniquement avec le code d’étude attribué afin d’assurer la désidentification. Les participants ont reçu l’instruction de vider leur vessie avant de déféquer afin de minimiser la contamination urinaire et de prélever les selles fraîches directement dans le récipient stérile sans contact avec l’eau des toilettes, l’urine, les désinfectants ou d’autres contaminants potentiels. Immédiatement après la collecte, environ 1 à 2 g de selles étaient transférées dans un tube cryogénique stérile à l’aide d’une cuillère d’échantillonnage jetable stérile. Le tube était hermétiquement fermé et immédiatement placé sur de la glace sèche ou dans un récipient de transfert pré-refroidi. Tous les échantillons ont été transportés au laboratoire dans les 2 heures suivant la collecte. À leur arrivée au laboratoire, le code de l’étude a été vérifié, et chaque tube a été inspecté pour détecter toute fuite ou contamination visible. Les temps de collecte et de stockage étaient enregistrés pour tous les échantillons. Les échantillons de selles étaient ensuite stockés à −80 °C jusqu’à l’extraction d’ADN génomique. Les échantillons étaient considérés comme acceptables pour une analyse en aval uniquement s’ils restaient complètement gelés pendant le stockage et le transport et ne présentaient aucune trace de fuite de tube ou de contamination externe.
Extraction d’ADN génomique
Les échantillons de selles étaient retirés de la zone de stockage à −80 °C et placés sur la glace avant le traitement. Chaque échantillon n’a été décongelé que jusqu’à ce que l’homogénéisation soit possible afin de minimiser la dégradation associée aux cycles répétés de gel-dégel. Environ 200 mg de selles ont été transférés dans un tube stérile de microcentrifuge, et le tampon de lyse fourni dans la trousse d’extraction d’ADN des selles a été ajouté conformément aux instructions du fabricant dans le tableau des matériaux. Les échantillons ont été vigoureusement vortexés pendant 30 secondes pour obtenir une homogénéisation complète, puis incubés à température ambiante pendant 5 à 10 minutes pour faciliter la lyse cellulaire. Après la lyse, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant a été soigneusement transféré dans un nouveau tube stérile de microcentrifuge sans déranger la pastille. L’ADN génomique a ensuite été émis à l’aide du tampon d’élution fourni avec le kit ou de l’eau sans nucléase selon le protocole du fabricant. L’ADN extrait était stocké à −20 °C pour un usage à court terme ou à −80 °C pour une conservation à long terme. Des échantillons d’ADN jugés adaptés à une analyse en aval sont apparus clairs et exempts de particules visibles.
Évaluation de la qualité de l’ADN
La qualité de l’ADN a été évaluée par électrophorèse sur gel d’agarose et une quantification basée sur la fluorescence. Un gel d’agarose à 1 % a été préparé dans un tampon d’électrophorèse, et les échantillons d’ADN extraits, mélangés avec un tampon de chargement, ont été chargés dans les puits de gel. L’électrophorèse était réalisée jusqu’à ce que les bandes d’ADN soient suffisamment séparées, après quoi le gel était examiné sous lumière ultraviolette ou bleue. L’intégrité de l’ADN était considérée comme acceptable lorsqu’une bande génomique intacte était observée sans dégradation marquée ni étalement excessif. La concentration d’ADN a ensuite été quantifiée à l’aide d’un système de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence. Les échantillons ont ensuite été dilués à la concentration requise pour l’amplification PCR en aval. Les échantillons d’ADN de haute qualité présentaient généralement une bande distincte sur électrophorèse en gel d’agarose et étaient suffisamment concentrés pour les procédures d’amplification ultérieures.
Amplification PCR de la région 16S rDNA V3–V4
La région hypervariable V3–V4 de l’ADNr bactérien 16S a été amplifiée à l’aide d’amorces codées à barres. Les séquences d’amorce étaient les suivantes : amorce avant 5′-ACTCCTACGGGAGGCAG-3′ et amorce inverse 5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′. Des réactions PCR ont été préparées sur glace dans un volume final de 20 μL contenant 4 μL de tampon PCR, 2 μL de mélange de nucléotides (2,5 mmol/L), 0,8 μL de amorces avant et arrière (5 μmol/L), 0,4 μL d’ADN polymérase haute fidélité, 10 ng d’ADN modèle et de l’eau sans nucléase jusqu’au volume. Les mélanges de réaction étaient doucement mélangés par pipetage puis brièvement centrifugés pour recueillir le liquide au fond du tube. L’amplification PCR a été réalisée en utilisant les conditions de cyclage suivantes : dénaturation initiale à 95 °C pendant 5 minutes, suivie de 25 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit à 55 °C pendant 30 s, et extension à 72 °C pendant 30 s, avec une dernière étape d’extension à 72 °C pendant 10 min. Pour minimiser le biais d’amplification, chaque échantillon était amplifié en réactions tripliquées, et les produits PCR résultants du même échantillon étaient ensuite regroupés dans un seul tube. L’amplification réussie a été confirmée par la présence d’une bande d’amplicons claire de taille attendue lors de l’électrophorèse en gel d’agarose.
Vérification et purification des produits PCR
Les produits PCR ont été vérifiés par électrophorèse sur gel d’agarose à 2 %. Les produits PCR combinés de chaque échantillon ont été chargés sur le gel et électrophorisés jusqu’à ce que les bandes d’amplicon cible soient clairement séparées. Les bandes correspondant à la taille prévue de l’amplicon ont été excisées à l’aide d’une lame stérile propre et purifiées avec un kit d’extraction gel selon les instructions du fabricant dans le Tableau des matériaux. Les produits PCR purifiés ont ensuite été élués dans un tampon d’élution ou de l’eau sans nucléase. La concentration de chaque produit PCR purifié a été quantifiée à l’aide d’un système de quantification de l’ADN à base de fluorescence, et les valeurs de concentration ont été enregistrées pour la préparation en continu de la bibliothèque. Une amplification et une purification réussies ont été confirmées par une bande claire unique à la taille d’amplicon attendue lors de l’électrophorèse en gel d’agarose.
Préparation de la bibliothèque et mise en commun
Les bibliothèques de séquençage ont été préparées à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque ADN selon les instructions du fabricant listées dans le tableau des matériaux. Les séquences adaptateurs de séquençage étaient ligaturées aux amplicons purifiés selon le flux de travail standard de préparation de la bibliothèque. Les produits ligés par adaptateur étaient ensuite purifiés soit par extraction par gel, soit par une méthode de purification à base de billes, selon le protocole de préparation de la bibliothèque choisi. Les produits purifiés de la bibliothèque ont été évalués par électrophorèse en gel d’agarose à 2 % afin de confirmer une distribution appropriée des fragments. Les concentrations en bibliothèque ont été quantifiées à l’aide d’un système de quantification de l’ADN basé sur la fluorescence. En fonction de la concentration d’ADN et de la taille des fragments, chaque bibliothèque a été normalisée à la même concentration molaire afin d’assurer un séquençage équilibré entre les échantillons. Des quantités molaires égales de bibliothèques individuelles ont ensuite été regroupées à un ratio 1:1 pour générer le pool final de bibliothèques de séquençage. Avant le séquençage, la bibliothèque poolée était dénaturée selon le protocole de la plateforme de séquençage avant le chargement de l’échantillon. Les bibliothèques jugées adaptées au séquençage présentaient une distribution claire des fragments dans la plage de taille attendue et une concentration suffisante pour une analyse de séquençage en aval.
Séquençage par extrémités jumelées
La bibliothèque finale poolée était chargée sur une plateforme de séquençage à extrémités jumelées selon les procédures opérationnelles standard du fabricant. Le séquençage par extrémités jumelées a été réalisé soit en utilisant une configuration de 2 × 250 pb, soit 2 × 300 pb, afin d’assurer une profondeur de séquençage suffisante pour une caractérisation complète de la diversité microbienne dans chaque échantillon. La qualité du séquençage a été surveillée tout au long de la série à l’aide de métriques de qualité générées par la plateforme. Après la fin du séquençage, des fichiers FASTQ bruts en binôme ont été exportés pour chaque échantillon pour une analyse bioinformatique en amont. Les jeux de données de séquençage étaient considérés comme acceptables lorsqu’ils démontraient une profondeur de lecture suffisante par échantillon, des scores de qualité Q30 appropriés et une attribution réussie du code-barres.
Traitement brut des séquences
Les fichiers FASTQ bruts en binôme étaient importés dans un pipeline d’analyse bioinformatique du microbiome pour le traitement en aval. Les séquences ont été démultiplexées en fonction des codes-barres attribués à chaque échantillon. Un filtrage de qualité a ensuite été effectué pour supprimer les lectures contenant des scores de faible qualité, des bases ambiguës ou des artefacts de séquençage. Les bases de faible qualité situées à la fin des lectures ont été découpées en fonction de la distribution des scores de qualité afin d’améliorer la fiabilité globale des séquences. Après le contrôle qualité, les lectures en binôme ont été fusionnées entre les régions qui se chevauchent pour reconstituer des séquences de longueur complète. Seules des séquences fusionnées de haute qualité ont été conservées pour les analyses ultérieures du microbiome.
Génération de variantes de séquence d’amplicons (ASV) et annotation taxonomique
Le débruit de séquence a été réalisé à l’aide d’un algorithme validé de débruitage, incluant DADA2 ou Deblur, afin de corriger les erreurs de séquençage et d’améliorer la précision des séquences. Des séquences chimériques ont été identifiées et retirées lors du processus de débruitage. Des séquences représentatives d’ASV et des tables d’abondance ASV correspondantes ont ensuite été générées pour chaque échantillon. L’attribution taxonomique des séquences ASV a été réalisée à l’aide d’un classificateur Naive Bayes, et une annotation taxonomique a été réalisée à partir de la base de données de référence SILVA 138. Des tableaux d’abondance taxonomique ont été exportés aux niveaux de phylum, de famille et de genre pour une analyse en aval. Le jeu de données final de l’ASV comprenait des séquences représentatives, des informations d’abondance et des annotations taxonomiques correspondantes pour chaque échantillon.
Analyse de la diversité alpha et bêta
Les indices de diversité alpha, incluant les indices de Chao, ACE, Shannon, Simpson et Couverture, ont été calculés pour évaluer la diversité et la richesse microbiennes au sein de l’échantillon. Les indices de diversité alpha étaient exprimés en moyenne ± écart-type. La normalité des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk. Les variables normalement distribuées ont été comparées entre les groupes DM et NM à l’aide des tests t de Student, tandis que les variables anormalement distribuées ont été analysées à l’aide des tests de somme de rang de Wilcoxon. Les distances de diversité bêta ont ensuite été calculées à l’aide d’une matrice de distances appropriée pour évaluer les différences de composition des communautés microbiennes entre les échantillons. L’analyse des coordonnées principales (PCoA) a été réalisée pour visualiser les différences dans la structure des communautés microbiennes entre les groupes. De plus, une analyse des similarités (ANOSIM) a été réalisée pour déterminer si les différences entre groupes dépassaient la variation intragroupe, et les valeurs R et p ANOSIM correspondantes ont été rapportées. L’analyse de la diversité alpha a reflété la diversité microbienne au sein de l’échantillon, tandis que l’analyse de la diversité bêta a évalué les différences dans la composition des communautés microbiennes entre les groupes.
Analyse taxonomique différentielle
La composition des communautés microbiennes a été résumée au niveau du phylum, de la famille et du genre. Des graphiques en barres empilées ont été générés pour visualiser l’abondance relative des taxons dominants à travers des échantillons individuels et des groupes d’étude. Des courbes Pan/Core et des diagrammes de Venn ont été également construits pour comparer les ASV partagés et spécifiques à chaque groupe entre les groupes DM et NM. Les différences d’abondance taxonique entre les groupes ont été évaluées à l’aide des tests de Wilcoxon à somme de rangs. L’analyse LEfSe a ensuite été réalisée pour identifier les taxons microbiens qui contribuaient le plus fortement à la discrimination entre groupes. L’analyse taxonomique différentielle a permis d’identifier des taxons microbiens enrichis soit dans le groupe DM, soit dans le groupe NM.
Prédiction fonctionnelle
PICRUSt2 ou un pipeline de prédiction fonctionnelle validé équivalent a été utilisé pour déduire les voies fonctionnelles microbiennes à partir des profils de séquençage 16S rDNA. Les données d’abondance d’ASV ont été normalisées selon les exigences du pipeline analytique sélectionné, et les fonctions prédites ont été mappées aux annotations de la voie KEGG ou MetaCyc. Les abondances prédites des voies ont ensuite été comparées entre les groupes DM et NM. Des chemins significativement différents ont été visualisés à l’aide de cartes thermiques ou d’autres approches graphiques appropriées. Les fonctions prédites ont été interprétées comme un potentiel métabolique microbien inféré plutôt que comme une abondance métabolique directement mesurée. L’analyse de prédiction fonctionnelle a permis d’identifier des voies microbiennes candidates qui différaient entre les groupes, y compris les voies associées au métabolisme des glucides et des acides aminés.
Analyse de randomisation mendélienne
Les statistiques résumées de l’étude d’association génomique (GWAS) pour le microbiote intestinal ont été obtenues à partir de jeux de donnéespublics 10. Les données d’association significatives à l’échelle du génome pour les taxons microbiens ont été extraites du catalogue GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/) du NHGRI-EBI en utilisant des numéros d’accession allant de GCST90032172 à GCST90032644. Des données métagénomiques supplémentaires ont été consultées depuis la cohorte FINRISK 2002 via l’European Genome-Phenome Archive (ID de recherche : EGAS00001005020). Les statistiques résumées GWAS pour le diabète de type 2 ont également été obtenues à partir du catalogue NHGRI-EBI GWAS (numéro d’acquisition : ebi-a-GCST006867). Les variantes génétiques associées aux taxons microbiens ont été sélectionnées comme variables instrumentales selon des seuils statistiques prédéfinis, et les variantes dans le déséquilibre de liaison ont été exclues. Les ensembles de données d’exposition et de résultats ont été harmonisés pour garantir une orientation cohérente des allèles. L’analyse de randomisation mendélienne a ensuite été réalisée en utilisant la méthode pondérée par l’inverse de la variance (IVW) comme approche analytique principale. Les analyses de sensibilité ont été réalisées à l’aide des méthodes de la RM-Egger et de la médiane pondérée. L’intensité de l’instrument a été évaluée à l’aide de F-statistiques, tandis que l’hétérogénéité entre les variables instrumentales a été évaluée à l’aide du test Q de Cochran. La pléiotropie horizontale a été examinée à l’aide du test d’interception MR-Egger. La correction de Bonferroni a été appliquée pour tenir compte des comparaisons multiples. Les résultats de randomisation mendélienne ont été interprétés comme des associations génétiquement prédites plutôt que comme des preuves définitives de causalité.
Sortie des données et point final
Les résultats analytiques finaux comprenaient des tableaux d’abondance ASV, des graphiques de composition taxonomique, des métriques de diversité alpha, des analyses de diversité bêta, des résultats taxonomiques différentiels, des profils de voies fonctionnelles prédits, et des estimations de randomisation mendélienne. Tous les identifiants d’échantillons dans les ensembles de données de séquençage ont été vérifiés afin d’assurer la cohérence avec les codes d’étude dé-identifiés correspondants. Les fichiers de séquençage bruts, les tables ASV traitées, les sorties statistiques et les fichiers sources de figures étaient archivés pour l’analyse en aval et la gestion des données. Le protocole a été considéré comme complet une fois que des données de séquençage de haute qualité, des profils taxonomiques, des métriques de diversité, des analyses de voies fonctionnelles prédites et des résultats de randomisation mendélienne avaient été générés et vérifiés avec succès.
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Les caractéristiques démographiques et cliniques de référence de la cohorte clinique initialement dépistée sont présentées dans le Tableau 1. Un sous-groupe représentatif composé de 12 participants nouvellement diagnostiqués DT2 et 12 participants NM a ensuite été sélectionné pour le séquençage de l’ADNr 16S et des analyses du microbiome en aval.
Évaluation de la profondeur de séquençage
L’indice de...
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Ces dernières années, le microbiome humain, en particulier le microbiote intestinal, s’est imposé comme un facteur complexe et influent dans le métabolisme de l’hôte, la régulation immunitaire et le développement des maladies. Dans un hôte sain, le microbiote intestinal contribue à l’homéostasie immunitaire et à l’intégrité de la barrièreintestinale 11. La dysbiose a été associée à une gamme de pathologies, notamment des troubles métaboliques, des maladies auto-im...
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Les auteurs affirment que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière pouvant être considérée comme un conflit d’intérêts potentiel.
CONTRIBUTIONS DES AUTEURS :
Linrui Xie et Kemiao Chen ont réalisé l’analyse des données et rédigé le manuscrit. Xican Pan a participé à la collecte d’échantillons et aux procédures expérimentales. Xuemei Zhong et Xiaoyu Li ont conçu et conçu l’étude, supervisé le projet et révisé de manière critique le manuscrit. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final.
Les auteurs remercient tous les participants et le personnel impliqués dans la collecte d’échantillons et le traitement des données pour leurs contributions à cette étude.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 16S rRNA Primers (V3–V4) | Sangon Biotech | Custom | Primers universels pour la région 16S bactérienne |
| 80 °C Freezer | Haier Biomedical | DW-86L626 | Stockage à long terme des échantillons |
| Agarose Gel System (Sub-Cell GT) | Bio-Rad | 170-4401 | Validation du produit PCR |
| AMPure XP Magnetic Beads | Beckman Coulter | A63880 | Purification de l'ADN et sélection par taille |
| Bead-beating Tubes (Lysing Matrix E) | MP Biomedicals | 116913050 | Lyse mécanique des cellules microbiennes |
| Bioinformatics Workstation | Dell | Precision 7920 | Analyse des données à l'aide de QIIME2 et R |
| DADA2 pipeline | Bioconductor | Version 1.28 | Débruitage des séquences et génération d'ASV ; https://benjjneb.github.io/dada2 |
| Deblur | QIIME2 | Version 2023.5 | Débruitage des séquences et correction d'erreur ; https://docs.qiime2.org |
| European Genome-Phenome Archive | EMBL-EBI | EGAS00001005020 | Référentiel public de jeux de données métagénomiques ; https://ega-archive.org |
| GWAS Catalog | NHGRI-EBI | Accessions GCST90032172–GCST90032644 | Base de données publique de statistiques de synthèse d'association pangénomique ; https://www.ebi.ac.uk/gwas |
| Illumina MiSeq Sequencing System | Illumina | SY-410-1003 | Plateforme de séquençage à haut débit |
| KEGG database | Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes | Release 107 | Base de données d'annotation de voies fonctionnelles ; https://www.genome.jp/kegg |
| MetaCyc database | SRI International | Version 27.1 | Base de données de voies métaboliques ; https://metacyc.org |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5424R | Centrifugeuse de refroidissement pour la préparation des échantillons |
| Nextera XT Library Prep Kit | Illumina | 20018705 | Préparation de la bibliothèque pour le séquençage |
| PCR Master Mix (2x PrimeSTAR Max Premix) | Takara Bio | RR350A | Pour la PCR haute-fidélité |
| PCR Thermocycler | Bio-Rad | T100 | Instrument d'amplification PCR |
| PICRUSt2 | PICRUSt2 Development Team | Version 2.5.2 | Prédiction des voies fonctionnelles à partir des données de séquençage de l'ADNr 16S ; https://github.com/picrust/picrust2 |
| QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit | QIAGEN | 51504 | Extraction de l'ADN à partir d'échantillons fécaux |
| QIAquick Gel Extraction Kit | QIAGEN | 28704 | Purification de l'ADN à partir du gel d'agarose |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33226 | Quantification de l'ADN |
| R software | R Foundation for Statistical Computing | Version 4.3.1 | Analyse statistique et analyse de randomisation mendélienne ; https://www.r-project.org |
| SILVA 138 database | SILVA ribosomal RNA database project | Release 138 | Base de données de référence pour l'annotation taxonomique ; https://www.arb-silva.de |
| Stool Collection Tube | Sarstedt | 76.9923.001 | Tube de collecte stérile pour les échantillons fécaux |
| Stool DNA Kit | Omega | D4015-02 | Kit d'extraction d'ADN |
| TwoSampleMR package | MR-Base | Version 0.5.7 | Analyse de randomisation mendélienne dans R ; https://mrcieu.github.io/TwoSampleMR |