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Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de l’hôpital Liyuan, du Collège médical Tongji, de l’Université des sciences et technologies Huazhong [Approbation n° : 2026IEC(RYJ016)]. Tous les patients ont donné leur consentement éclairé, et la collecte ainsi que l’utilisation des échantillons cliniques ont respecté les directives éthiques pertinentes de la Déclaration d’Helsinki. Les principaux matériaux expérimentaux et instruments utilisés dans cette étude sont listés dans le tableau des matériaux.
Collecte d’échantillons de tissus cliniques et détection de l’expression de CDCP1
Des échantillons de tissu chirurgical ont été prélevés sur sept patients diagnostiqués avec un carcinome nasopharyngé dans notre hôpital entre janvier 2019 et décembre 2019. Simultanément, des échantillons de tissu nasal de six patients atteints de rhinite ont été prélevés comme contrôles. Tous les échantillons de tissu ont été immédiatement congelés dans de l’azote liquide après la collecte pour une extraction ultérieure d’ARN.
Extraction d’ARN et détection quantitative par PCR en temps réel
L’ARN total a été extrait d’échantillons de tissu selon les instructions du fabricant. Pour chaque échantillon, 50 à 100 mg de tissu ont été traités sur glace dans 1 mL de réactif d’extraction à l’aide d’un homogénéiseur tissulaire. L’homogénéisation a été effectuée pendant 30 secondes puis répétée 3 fois pour assurer une perturbation complète du tissu. Après la perturbation tissulaire, chaque lysat recevait 200 μL de chloroforme. Les tubes étaient secoués vigoureusement en vortex pendant 15 secondes, maintenus à température ambiante pendant 3 minutes, puis tournés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C pour séparer les phases. La couche aqueuse claire a été retirée sans perturber l’interphase et transférée dans un nouveau tube.
L’ARN a été récupéré à partir de cette fraction aqueuse en ajoutant de l’isopropanol à un rapport volumique de 1:1. Après une incubation de 10 minutes à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C pour pelleter l’ARN. Le surnageant a été jeté, et la pellete a été rincée une fois avec 1 mL d’éthanol à 75 %. Après une seconde étape de centrifugation à 7 500 × g pendant 5 minutes à 4 °C, le lavage à l’éthanol a été retiré. Le pellet d’ARN a ensuite été séché à l’air pendant 5 à 10 minutes à température ambiante puis resuspendu dans 20 μL d’eau sans RNase. La quantité et la pureté de l’ARN ont été déterminées spectrophotométriquement.
Pour la préparation de l’ADNc, 1 μg d’ARN total a été utilisé pour la transcription inverse. La réaction a été effectuée à 37 °C pendant 15 minutes puis chauffée à 85 °C pendant 5 secondes. La PCR quantitative en temps réel (qPCR) a ensuite été réalisée avec TB Green Premix Ex Taq II sur un système de PCR en temps réel. Chaque réaction de 20 μL contenait 2 μL de gabarit d’ADNc, des amorces avant et arrière à 0,4 μmol/L chacune, 10 μL de prémix SYBR Green, et de l’eau sans nucléase. Le protocole d’amplification commençait par une dénaturation à 95 °C pendant 30 secondes. Cela a été suivi de 40 cycles, chaque cycle comprenant 95 °C pendant 5 s et 60 °C pendant 30 s pour le recuit/extension. Les séquences d’amorces sont listées dans le tableau 1.
Détection immunohistochimique de l’expression de la protéine CDCP1
Les échantillons de tissu ont d’abord été fixés dans du paraformoldéhyde à 4 % pendant 24 heures, suivis d’une déshydratation standard, d’un plongement en paraffine et de la préparation de sections de 4 μm d’épaisseur. Les sections de paraffine ont ensuite été traitées avec du xylène pour retirer la paraffine et réhydratées séquentiellement à l’aide de solutions d’éthanol graduées. Pour le démasquage antigénique, les lames étaient placées dans un tampon de citrate (pH 6,0) et chauffées dans un autocuiseur pendant 3 minutes après que la solution ait atteint l’ébullition. L’activité endogène de la peroxydase a été éteinte en exposant les sections à 3 % de peroxyde d’hydrogène pendant 10 minutes.
Après blocage de l’activité enzymatique endogène, les sections ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire anti-CDCP1 dilué à 1:200. Le lendemain, les lames ont été traitées avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort pendant 30 minutes à température ambiante. La visualisation du signal a été réalisée à l’aide d’un kit de substrat DAB, et les coupes ont ensuite été contre-colorées à l’hématoxyline. Enfin, les lames ont été déshydratées, montées et examinées au microscope optique.
Culture cellulaire et regroupement
Les cellules de carcinome nasopharyngé humain CNE2 et HK1 ont été maintenues dans du DMEM à haute glycémie, complété avec 10 % de sérum fœtal bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine. Les cellules ont été cultivées à 37 °C dans un incubateur contenant 5 % de CO₂. Lorsque les cellules atteignaient une confluence de 70 % à 80 %, elles étaient transfectées selon les groupes suivants : Groupe témoin (Témoin) : transfectées avec un vecteur vide ou un siARN témoin négatif ; Groupe de surexpression CDCP1 (CDCP1-OE) : transfecté avec un plasmide de surexpression CDCP1 ; Groupe de silencieux CDCP1 (si-CDCP1) : transfecté avec le siRNA CDCP1 ; Groupe expérimental de sauvetage (CDCP1-OE + U0126) : traité avec l’inhibiteur spécifique à ERK1/2 U0126 (10 μmol/L) pendant 48 heures sur la base de la surexpression de CDCP1 .
La transfection a été effectuée conformément aux instructions du fabricant. Les cellules ont été placées 24 h avant la transfection dans des plaques à 6 puits à 2 × 10cellules de 5 par puits, chaque puits contenant 2 mL de milieu sans antibiotiques. La transfection a commencé lorsque les cultures ont atteint environ 70 % de confluence. Le milieu de culture a ensuite été retiré et remplacé par un milieu frais sans sérum. Pour chaque puits, soit 2 μg d’ADN plasmidique soit 100 pmol de siRNA ont été préparés séparément de 5 μL de réactif de transfection, chaque composant étant dilué dans 250 μL de milieu contenant du sérum réduit. Les deux mélanges ont été conservés à température ambiante pendant 5 minutes. L’acide nucléique dilué et le réactif de transfection ont ensuite été combinés et laissés reposer pendant 20 minutes à température ambiante pour générer les complexes de transfection. Ces complexes ont été ajoutés aux cellules goutte à goutte, distribués doucement dans le puits, puis incubés avec les cellules pendant 6 heures. Une fois la période d’incubation terminée, le mélange de transfection était retiré et les cellules recevaient un milieu complet contenant 10 % de FBS.
Essai de prolifération cellulaire
48 h après la transfection, les cellules CNE2 et HK1 de chaque groupe ont été collectées et semées dans des plaques de 96 puits à une densité de 3 × 10cellules de 3 puits avec 100 μL de milieu par puits, avec cinq puits réplicatifs par groupe. Après la culture des cellules pendant 24, 48 ou 72 heures, 10 μL de solution MTT à 5 mg/mL ont été ajoutés à chaque puits. Les plaques ont ensuite été de nouveau incubées à 37 °C avec 5 % de CO₂ pendant 4 heures supplémentaires. Après cette incubation, le surnageant de culture a été soigneusement écarté, et 100 μL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) ont été ajoutés à chaque puits pour dissoudre les cristaux de formazan. Les assiettes ont été agitées pendant 10 minutes pour assurer la dissolution complète. L’absorbance était ensuite enregistrée avec un lecteur de microplaques à 570 nm, en utilisant 630 nm comme longueur d’onde de référence.
Analyse d’activité d’apoptose
48 h après la transfection, des cellules CNE2 de chaque groupe ont été prélevées, et l’activité de Caspase-3 a été détectée à l’aide d’un kit d’analyse d’activité Caspase-3 selon les instructions du fabricant. Un total de 100 μL de tampon de lyse a été ajouté à 1 × 106 cellules, lysé sur glace pendant 15 minutes, puis centrifugé à 12 000 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Le surnageant résultant a été transféré pour une analyse ultérieure. Pour le test Caspase-3, chaque puits a reçu 50 μL de tampon de réaction et 5 μL de substrat Caspase-3 (DEVD-pNA). La plaque était ensuite maintenue à 37 °C pendant 2 heures, et l’absorbance mesurée à 405 nm avec un lecteur de microplaques.
Analyse du western blot
48 h après la transfection, les cellules CNE2 et HK1 de chaque groupe expérimental ont été prélevées pour l’extraction des protéines. Les cellules ont été perturbées dans un tampon contenant des inhibiteurs de protéases RIPA et maintenues sur glace pendant 30 minutes. Les lysats obtenus ont été centrifugés à 12 000 × g pendant 15 minutes à 4 °C, après quoi les fractions surnageantes ont été collectées. La concentration en protéines a été mesurée à l’aide d’un kit de test protéique BCA.
Pour l’analyse western blot, 30 μg de protéines totales de chaque échantillon ont été mélangés avec 5x tampon de charge et chauffés à 100 °C pendant 10 minutes pour dénaturer les protéines. Les échantillons ont été séparés sur des gels SDS-PAGE à 10 % à 120 V pendant 90 minutes, suivis d’un transfert sur des membranes PVDF à un courant constant de 300 mA pendant 90 minutes. Après le transfert, les membranes étaient bloquées avec 5 % de lait écrémé pendant 1 h à température ambiante.
Les membranes ont été incubées toute la nuit à 4 °C avec des anticorps primaires contre CDCP1 (1:1 000), E-cadherin (1:1 000), Vimentin (1:1 000), p-ERK1/2 (1:2 000), ERK1/2 (1:1 000) et GAPDH (1:5 000).
Le lendemain, les membranes ont été rincées en TBST 3 fois, chaque lavage durant 10 minutes. Ils ont ensuite été exposés pendant 1 h à des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort à température ambiante. Après trois lavages supplémentaires de TBST, les signaux protéiques ont été visualisés à l’aide d’un substrat chimioluminescence ECL. L’intensité de bande était mesurée avec le logiciel ImageJ, et GAPDH était utilisé comme contrôle de normalisation.
Analyse statistique
Toutes les expériences ont été menées indépendamment 3 fois. Les résultats sont présentés sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (DS). Les différences entre plusieurs groupes ont été évaluées par analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA), et la méthode de Tukey a été utilisée pour des comparaisons post-hoc par paires. Une valeur P de < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.