Une étude de randomisation mendélienne des traits des cellules immunitaires et des métabolites plasmatiques dans la thyroïdite de Hashimoto

Résumé

À l’aide d’analyses de randomisation mendélienne et de médiation sur deux échantillons, cette étude identifie 32 phénotypes des cellules immunitaires et 9 métabolites plasmatiques causalement associés à la thyroïdite de Hashimoto et soutient un axe immunométabolique partiel CD39+Treg-isovalérylcarnitine (C5)-HT. La cytométrie en flux préliminaire et les données métabolomiques fournissent une plausibilité biologique initiale compatible avec cette voie.

Résumé

La thyroïdite de Hashimoto (TH) est une maladie auto-immune de la thyroïde. Bien que les cellules immunitaires soient impliquées dans sa pathogenèse, leurs rôles spécifiques restent à clarifier complètement. Une analyse de randomisation mendélienne (RM) sur deux échantillons a été réalisée intégrant des statistiques résumées de l’étude d’association génomique (GWAS) issues de grands ensembles de données publics pour les caractéristiques des cellules immunitaires (ebi-a-GCST90001391 à ebi-a-GCST90002121), les métabolites plasmatiques (GCST90199621-9020102) et HT (ebi-a-GCST90018855). Les effets causals ont été estimés à l’aide de méthodes pondérées par l’inverse de la variance (IVW), avec des analyses MR-Egger, médiane pondérée et laisse-un-dehors, pour évaluer la pléiotropie et la robustesse. Les analyses IRM bidirectionnelles et médiatrices ont été appliquées pour tester la directionnalité et identifier les voies potentielles médiées par les métabolites. Les cellules de Treg-Treg CD3⁺CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Treg ont été quantifiées dans des échantillons sanguins périphériques à l’aide de cytométrie en flux. L’isovalérylcarnitine (C5) a été mesurée par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem. L’analyse de la FIV a identifié 32 phénotypes de cellules immunitaires significativement associés au risque de TH (P < 0,05 après correction FDR). L’analyse IRM inversée a montré que la TH était positivement liée causalement à 2 caractéristiques immunitaires, tandis que 4 caractéristiques immunitaires ( toutes P < 0,05) étaient inversement associées à la TH. Les analyses de sensibilité n’ont révélé aucune pléiotropie horizontale ni hétérogénéité. De plus, la méthode IVW a identifié de manière préliminaire 9 métabolites plasmatiques comme causalement liés à la TH, incluant le C5 augmentant le risque (OR = 1,120, IC 95 % : 1,032-1,215, P = 0,006) et l’ergothionéine protectrice (OR = 0,958, IC 95 % : 0,927-0,990, P = 0,010). La médiation IRM en deux étapes a identifié C5 comme un médiateur candidat reliant CD3⁺ CD39⁺ Treg à HT (proportion de médiation 8,89 %, IC 95 % : 2,34 %-15,4 %, P = 0,008). La cytométrie de flux a élevé les niveaux de CD39⁺Treg et le C5 plasmatique chez les patients HT, avec un taux de C5 positivement corrélé à la proportion des cellules CD39⁺Treg. Cette étude établit de nouveaux liens causaux entre les phénotypes des cellules immunitaires et la TH, et met en lumière les métabolites plasmatiques, en particulier le C5, comme médiateurs potentiels dans la pathogenèse de la HT. Ces résultats approfondissent la compréhension mécaniste des maladies auto-immunes de la thyroïde et peuvent guider la découverte future de biomarqueurs et de cibles thérapeutiques.

Introduction

La thyroïdite de Hashimoto (TH) est une maladie auto-immune courante dans laquelle le système immunitaire attaque la glande thyroïde, entraînant une hypothyroïdie ^1,2. Des études récentes ont rapporté une augmentation annuelle régulière de l’incidence de la TH. En Chine, sa prévalence est estimée entre 0,2 % et 1,3 ^%. La cause exacte de la TH est inconnue, bien que sa pathogenèse soit supposée inclure une interaction complexe de composants génétiques, environnementaux et^{immunitaires 4,5}.

Le développement de la TH est fortement influencé par le système ^{immunitaire 6,7,8}. Des réponses immunitaires aberrantes ciblent le tissu thyroïdien, déclenchant la production d’autoanticorps, notamment la peroxydase anti-thyroïdienne (anti-TPO) et l’anti-thyroglobuline (anti-Tg⁾⁹. Ces autoanticorps interagissent avec les cellules thyroïdiennes, induisant la mort cellulaire médiée par le système immunitaire et des réactions inflammatoires, ce qui entraîne une altération de la fonction^{thyroïdienne 10}. Les voies pathogènes spécifiques, en particulier les signaux métaboliques qui entraînent la dysfonction des cellules immunitaires, restent encore incomprises. Les lymphocytes T régulateurs (Treg), en particulier ceux exprimant CD39, jouent un rôle clé dans le maintien de la tolérance immunologique en hydrolysant l’ATP extracellulaire en adénosine immunosuppressive. Les perturbations de la fonction du Treg ou de leur environnement métabolique peuvent entraîner une défaillance de l’auto-tolérance, mais la relation causale entre certains sous-ensembles de Treg et la HT reste à^élucider 11,12,13,14,15,16.

Les études observationnelles traditionnelles sont souvent limitées par des variables de confusion et le potentiel de causalité inverse, ce qui complique la capacité à déterminer des relations causales définitives entre les phénotypes des cellules immunitaires et HT¹⁷. De plus, comme la TH est une maladie systémique influencée par divers sous-ensembles immunitaires et intermédiaires métaboliques, un focus étroit sur les candidats individuels peut négliger de nouveaux facteurs^{pathogènes 18}. Par conséquent, une approche de dépistage à grande échelle est nécessaire afin de fournir un paysage impartial et complet des facteurs immunométaboliques contribuant à la TH. Les avancées récentes dans les études d’association génomique (GWAS) ont fourni des données complètes sur les phénotypes des cellules immunitaires et les métabolites plasmatiques, offrant de nouvelles voies pour explorer les mécanismes sous-jacents de HT¹⁹. La randomisation mendélienne (RM) suit les principes de l’attribution aléatoire de gamètes mendéliens et des combinaisons^{libres 16}, et l’utilisation de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) comme variables instrumentales (IV) pour déduire les effets causaux potentiels des expositions sur les résultats^20,21. Cette méthode aide à atténuer l’influence des facteurs de confusion et la causalité inverse, qui compliquent fréquemment les études observationnelles^{traditionnelles 16,22}.

À la lumière de ces développements, l’objectif de cette étude est double. Tout d’abord, une analyse exploratoire générant des hypothèses a été réalisée à l’aide d’un cadre IRM à deux échantillons pour dépister systématiquement 731 phénotypes des cellules immunitaires et 1 400 métabolites plasmatiques afin d’identifier de nouveaux facteurs de risque candidats pour la TH. Deuxièmement, une transition a été effectuée vers une étude basée sur des hypothèses pour évaluer le rôle médiateur spécifique des métabolites identifiés, tels que l’isovalérylcarnitine, dans la voie reliant les lymphocytes T régulateurs au risque de TH. Cette étude intègre donc un dépistage IRM à grande échelle avec une analyse de médiation et une validation clinique préliminaire afin de fournir des preuves génétiquement étayées cohérentes avec un cadre immunométabolique supposé (Treg–métabolite–HT), tout en mettant l’accent sur la nature exploratoire de ces résultats. En identifiant ces chaînes causales précises, on obtient de nouvelles perspectives sur la régulation métabolique de l’auto-immunité thyroïdienne, ainsi que des candidats solides pour une future ciblisation thérapeutique.

Protocole

L’étude a été approuvée par le Comité d’éthique médicale de l’Hôpital affilié de l’Université médicale de Mongolie intérieure. Toutes les procédures ont été menées conformément à la Déclaration d’Helsinki et aux directives éthiques pertinentes. Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants avant le début de toute procédure liée à l’étude. Cette étude a inclus deux groupes de participants : le groupe de la thyroïdite de Hashimoto (TH, n = 10) et le groupe témoin sain (En bonne santé, n = 10). Les deux groupes étaient appariés selon leur âge et leur sexe. Tous les échantillons de sang périphérique ont été prélevés auprès de patients ambulatoires ou de personnes subissant des examens de santé de routine, avec une prise de sang le matin après un jeûne nocturne.

Conception de l’étude

Dans cette étude, une analyse IRM sur deux échantillons et une analyse de médiation ont été utilisées pour évaluer la relation causale entre 731 phénotypes des cellules immunitaires (7 groupes) et la TH, et explorer le rôle modulateur potentiel des métabolites plasmatiques dans cette relation. Le flux de travail analytique comprenait 5 étapes séquentielles : (1) sélection des ensembles de données GWAS d’exposition pour les phénotypes immunitaires ; (2) sélection du jeu de données GWAS pour les résultats pour la TH ; (3) identification et harmonisation des variables instrumentales ; (4) analyse IRM primaire à deux échantillons et validation bidirectionnelle ; et (5) analyse IRM par médiation en deux étapes. Un aperçu schématique de la conception de l’étude est présenté dans la Figure Supplémentaire 1. Dans l’analyse IRM, les variants génétiques servent de substituts aux expositions modifiables. Pour une inférence causale valide, les variables instrumentales (IV) doivent satisfaire à trois critères fondamentaux : (1) elles sont fortement associées à l’exposition d’intérêt ; (2) ils sont indépendants de tout facteur de confusion pouvant influencer à la fois l’exposition et le résultat ; et (3) ils influencent le résultat uniquement par l’exposition, sans voies causales alternatives.

GWAS de la source de données HT

Pour garantir la compatibilité des jeux de données et minimiser la stratification de population, toutes les statistiques sommaires GWAS ont principalement été dérivées d’individus d’ascendance européenne. La base de données GWAS (https://gwas.mrcieu.ac.uk/) fournissait les données de résultats HT, et le jeu de données ebi-a-GCST90018855 était utilisé. L’étude a réalisé des GWAS sur 395 640 Européens (_cas N = 15 654,_{N contrôle} = 379 986), après contrôle qualité et interpolation, 24 146 037 SNP ont été analysés. Pour les facteurs de confusion spécifiques à HT (par exemple, sexe, âge), le GWAS original (ebi-a-GCST90018855) incluait ces covariables dans leurs modèles, comme étant standard dans les pipelines GSA.

Sources de données GWAS pour les cellules immunitaires

Les statistiques résumées pour GWAS liées aux caractéristiques des cellules immunitaires ont été obtenues à partir du catalogue GSA, couvrant des ensembles de données avec des numéros d’accès allant d’ebi-a-GCST90001391 à ebi-a-GCST90002121 (disponibles sur https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Un total de 731 phénotypes immunologiques ont été inclus dans l’analyse, incluant le nombre relatif de cellules (n = 192), le paramètre morphologique (MP) (n = 389), les coefficients d’activation (AC, n = 118) et l’intensité moyenne de fluorescence (MFI, n = 389) représentant le degré d’antigène de^{surface 23}. L’impact de près de 22 millions de polymorphismes sur 731 phénotypes des cellules immunitaires chez 3 757 Sardes a été documenté par le GWAS initial sur les cellules immunitaires.

Sources de données GWAS pour les métabolites plasmatiques

Les données résumées GWAS pour un total de 1 400 métabolites plasmatiques ont été extraites du catalogue GWAS (https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020), comprenant 1 091 concentrations individuelles de métabolites et 309 traits de ratio métabolites. Les ensembles de données GWAS utilisés pour l’analyse IRM dans la présente étude ont été dérivés d’individus d’ascendance européenne. Les caractéristiques détaillées des données GWAS du métabolite plasmatique utilisées sont fournies dans le Tableau Supplémentaire 1.

Les ensembles de données GWAS pour les phénotypes des cellules immunitaires (cohorte sarde), HT (FinnGen/EBI-a-GCST90018855) et métabolites plasmatiques (cohortes européennes) sont indépendants sans chevauchement d’échantillons, comme le confirment les publications du consortium respectifs. Cela satisfait l’hypothèse d’indépendance pour la MR à deux échantillons.

Sélection des variables instrumentales (IV)

Les IV étaient supposées être fortement associées à l’exposition tout en restant indépendantes des variables de résultat. De plus, seul le facteur d’exposition a été hypothétique comme ayant un effet direct sur le résultat. Pour identifier les IV appropriés, les SNP associés aux facteurs d’exposition ont été sélectionnés avec un niveau de signification fixé à 5 × ^10-8. Pour tenir compte du déséquilibre de liaison (LD), les SNP ont été regroupés en utilisant un seuil de^R2 de 0,001 dans une taille de fenêtre de 10 000 kilobases (kb). Les variantes présentant^{R 2} par paires > 0,001 dans cette distance ont été exclues afin d’assurer l’indépendance des variables instrumentales sélectionnées et d’éliminer les corrélations potentielles de LD. Les tests d’hétérogénéité ont exclu les SNP significativement hétérogènes avec une statistique F < 10. Enfin, pour contrôler l’effet des confondeurs sur les IV, P < 1×^10-5 a été pris pour éliminer les SNP palindromes et les SNP incompatibles, et les SNP valides ont été conservés comme variables instrumentales.

Analyse de randomisation mendélienne à deux échantillons

Pour évaluer la relation causale bidirectionnelle entre les phénotypes des cellules immunitaires et la TH, des analyses de randomisation mendélienne (RM) à deux échantillons et des analyses IRM par médiation ont été réalisées. Plus précisément, une IRM sur deux échantillons a été appliquée pour évaluer plusieurs traits liés aux cellules immunitaires. Pour ces analyses, plusieurs méthodes IRM complémentaires ont été utilisées, notamment la pondération inverse de la variance (IVW⁾²⁴, la régression de^{MR-Egger 25}, l’estimateur médian pondéré (WME⁾²⁶, l’estimation simple^{basée sur les modes 27}, et l’estimation pondérée basée sur les modes. Parmi celles-ci, la VV a été désignée comme approche analytique principale, avec une signification statistique définie comme P < 0,05. La méthode IVW a été choisie comme estimateur principal de l’IRM en raison de son équilibre optimal entre la précision et l’hypothèse d’une pléiotropie équilibrée. La méthode de la VV améliore la précision en attribuant un plus grand poids aux SNP avec des variances plus faibles, produisant ainsi des estimations causales plus fiables. La régression MR-Egger a été utilisée pour l’évaluation de la pléiotropie, un processus dans lequel les gènes influencent plusieurs phénotypes. Si l’interception indiquait qu’il n’y avait pas de pléiotropie horizontale significative (P > 0,05), cette approche combinait l’évaluation de l’interception pour déterminer la pléiotropie. L’hétérogénéité a été évaluée à l’aide de la statistique Q des méthodes MR-Egger et IVW, qui mesure dans quelle mesure la variation génétique affecte le phénotype, si P > 0,05 indique qu’il n’y a pas d’hétérogénéité significative dans les effets de la variation génétique. Des seuils ajustés par Bonferroni ont été appliqués pour prendre en compte 731 phénotypes immunitaires (P < 6,84 × 10⁻⁵) et 1 400 métabolites (P < 3,57 × 10⁻⁵). Les résultats significatifs ont survécu à la correction sauf indication contraire. De plus, la causalité inverse a été évaluée à l’aide de la même méthode IRM pour déterminer si les caractéristiques des cellules immunitaires étaient affectées par la TH. Lors de l’étude IRM inversée, la TH a été considérée comme facteur d’exposition et différentes caractéristiques des cellules immunitaires ont été prises en compte comme résultat.

Dans cette étude, une analyse de médiation a été réalisée à l’aide d’un cadre IRM en deux étapes pour explorer si les métabolites plasmatiques agissent comme intermédiaires dans la voie causale reliant les phénotypes des cellules immunitaires à la TH. Cette approche permet de répartir l’effet causal total des phénotypes des cellules immunitaires sur la TH en un effet direct et un effet indirect transmis via les intermédiaires métaboliques identifiés. L’effet total des cellules immunitaires sur la TH a d’abord été estimé, suivi de l’effet des cellules immunitaires sur les métabolites (β1), de l’effet des métabolites sur la TH (β2) et de l’effet médiateur (β1*β2), l’effet direct étant calculé comme l’effet total moins l’effet médiateur. Effet total (_{β total}) = Effet direct (β_direct) + Effet indirect (β_indirect) ; Effet indirect = β1 × β2 ; La proportion médiée ( %) = (β1 × β2)/β total × 100 %, où β1 est l’effet causal du phénotype des cellules immunitaires sur le métabolite plasmatique, et β2 est l’effet causal du métabolite plasmatique sur la TH. La méthode delta a été utilisée pour estimer des intervalles de confiance à 95 % pour l’effet indirect. De plus, une analyse IRM intermédiaire inverse a été réalisée pour étudier les effets causaux de la TH sur les métabolites et les métabolites sur les cellules immunitaires, afin de compléter les résultats de l’IRM directe et d’améliorer la fiabilité de l’inférence causale. Toutes les analyses ont été réalisées par un environnement informatique statistique et des logiciels liés à la RM pertinents, qui sont listés dans le tableau des matériaux.

Détection de Treg 3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺

50 μL de sang total anticoagulé ont été soigneusement mélangés dans un tube à essai avec 10 μL chacun ciblant les anticorps monoclonaux CD3, CD4, CD25 et CD39. Le mélange était protégé de la lumière et maintenu à température ambiante pendant 15 minutes. Par la suite, 2 mL d’une solution FACS Lysing diluée 1:10 ont été ajoutés. Le tube a été incubé pendant 10 minutes supplémentaires à température ambiante tout en étant protégé de la lumière pendant la lyse. Le tube a été centrifugé à ~300 x g pendant 5 minutes, et le surnageant a été retiré. Après avoir ajouté 2 mL de solution tampon phosphate (PBS), le tube a de nouveau été centrifugé à ~300 x g pendant 5 minutes. Le surnageant a été retiré et 500 μL de PBS a été ajouté pour la détection. La détection a été réalisée à l’aide d’un cytomètre à flux multi-laser, puis analysée par le logiciel d’acquisition et d’analyse associé pour obtenir la proportion de CD3⁺CD4⁺CD25⁺Tregs et le sous-ensemble exprimant CD39 (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺Tregs).

Mesure des niveaux d’isovalérylcarnitine (C5)

Les données sur les niveaux de C5 des patients ont été obtenues auprès du Département de laboratoire clinique de l’Hôpital de l’Université Médicale de Mongolie Intérieure. Plus précisément, le C5 a été mesuré dans le cadre de la chromatographie liquide de routine – spectrométrie de masse tandem (LC–MS/MS), suivant des procédures de laboratoire standardisées et des protocoles de contrôle qualité.

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un environnement logiciel statistique. Les variables continues ont été comparées à l’aide du test t de Student pour les données normalement distribuées ou du test de Wilcoxon de la somme des rangs pour les données non distribuées normalement. Les variables catégorielles ont été analysées à l’aide du test du chi carré. L’analyse de corrélation de Pearson a été utilisée pour réaliser une analyse de corrélation. Une valeur p < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Effets causaux génétiques des phénotypes des cellules immunitaires sur la TH

Après l’exclusion des facteurs de confusion potentiels et l’absence de pléiotropie horizontale (P > 0,05), une analyse IRM sur deux échantillons a été réalisée afin d’évaluer les effets causaux des phénotypes des cellules immunitaires sur le risque de TH. Pour chaque phénotype de cellule immunitaire utilisé comme exposition, la statistique F a été calculée afin d’évaluer la force des variables instrumentales. Tous les instruments dépassaient le seuil conventionnel de F > 10, indiquant un biais faible minimal de l’instrument. Des statistiques F détaillées pour les principaux traits immunitaires discutés dans le texte principal sont fournies dans le Tableau Supplémentaire 2. Au total, 32 phénotypes liés à l’immunité ont montré des associations significatives avec le risque de TH (P < 0,05) (Figure 1). La robustesse de ces résultats a été confirmée par des analyses de nuages de points (Figure supplémentaire 2A,B) et des analyses de sensibilité utilisant l’approche « laisse-un-out » (Figure supplémentaire 3A,B).

Parmi les principales conclusions, le phénotype Treg a montré une implication la plus étendue, avec CD3 sur CD39+ sécrétant Treg (OR = 1,063 ; IC à 95 % : 1,023–1,105 ; P = 0,002) et CD39+ activé Treg % activé (OR = 1,081 ; IC 95 % : 1,008–1,161 ; P = 0,030) émergeant comme caractéristiques clés associées au risque qui ont ensuite été priorisées pour l’analyse de médiation. Aux stades de maturation des lymphocytes T, CD3 sur CM CD8br a montré la plus grande taille d’effet parmi les caractéristiques associées au risque (OR = 1,094 ; IC à 95 % : 1,040–1,150 ; P < 0,001), tandis que TD DN (CD4⁻CD8⁻) AC montrait une association protectrice notable (OR = 0,930 ; IC à 95 % : 0,881–0,982 ; P = 0,009). Parmi les phénotypes des cellules B, les sous-ensembles de cellules myéloïdes exprimant HLA-DR ont constamment montré des effets d’élévation du risque, HLA DR sur CD33dim HLA DR+ CD11b⁻ atteignant OR = 1,095 (IC 95 % : 1,032–1,162 ; P = 0,003). Les résultats complets pour les six catégories de cellules immunitaires : cDC, Treg, stades de maturation des cellules T, TBNK, phénotypes des monocytes, des cellules B et des cellules myéloïdes sont résumés à la Figure 1.

Les analyses de sensibilité ont également validé les résultats. Aucune preuve significative d’hétérogénéité et de pléiotropie horizontale n’a été détectée sur la base d’évaluations statistiques pertinentes (Tableau Supplémentaire 3 et Tableau Supplémentaire 4). Ces résultats ont été corroborés par l’analyse « laisse-en un de côté ».

Les effets causaux de la TH sur les cellules immunitaires

Les résultats ont révélé que la TH était positivement associée causalement à deux caractéristiques immunitaires : le lymphocyte T régulateur sécréteur CD4 (1,143 : 1,023-1,277 ; P = 0,018) et des cellules suppressrices d’origine myéloïde monocytaire (1,373 : 1,058-1,782 ; P = 0,017). En revanche, la TH était associée causalement négativement à 4 caractéristiques immunitaires : le lymphocyte T régulateur CD4 activé (0,818 : 0,679-0,987 ; P = 0,036), activé CD4+ cellule T régulatrice (0,790 : 0,676-0,924 ; P = 0,003), cellule T régulatrice CD4 activée et au repos (0,871 : 0,780-0,974 ; P = 0,015) et CD25++ CD4+ T (0,855 : 0,747-0,980 ; P = 0,017) (Figure 2). Ces résultats suggèrent une relation réciproque entre les états d’activation de HT et Treg, ce qui pourrait refléter un remodelage immunitaire causé par la maladie. Les nuages de points (Figure supplémentaire 4) et la méthode « laisse-en un dehors » (Figure supplémentaire 5) ont confirmé la stabilité des résultats. Les analyses de sensibilité ont également validé les résultats. La force de ces résultats a été confirmée par des évaluations de l’hétérogénéité et de la multiplicité horizontale (Tableau supplémentaire 5 et Tableau supplémentaire 6). Ces conclusions sont étayées par l’analyse « laisse-en un de côté ».

Effets causaux génétiques des métabolites plasmatiques sur la TH

Après sélection de variables instrumentales appropriées et exclu les déséquilibres de chaînes et les instruments faibles, un total de 34 843 SNP associés aux métabolites plasmatiques ont été identifiés, le F-statistique minimal atteignant 19,50 (Tableau supplémentaire 7). En utilisant la méthode de la FIV, 9 métabolites plasmatiques ont été identifiés de manière causale à la TH. Parmi ceux-ci, 4 métabolites étaient positivement associés à un risque accru de TH : rapport glucose/maltose (1,195 : 1,082-1,319 ; P < 0,001), acide taurocholique (1,190 : 1,073-1,321 ; P = 0,001), 5-hydroxyméthyl-2-furoylcarnitine (1,127 : 1,046-1,215 ; P = 0,002), et C5 (1,120 : 1,032-1,215 ; P = 0,006) (Tableau 1).

Inversement, 5 métabolites peuvent être négativement associés au risque de TH, y compris l’ergothionéine (0,958 : 0,927-0,990 ; P = 0,010), ratio carnitine / propionylcarnitine (C3) (0,895 : 0,825-0,970 ; P = 0,007), rapport adénosine 5'-diphosphate (ADP) à N-acétylneuraminate (0,890 : 0,823-0,963 ; P = 0,004), le rapport arginine/glutamate (0,882 : 0,802-0,968 ; P = 0,009), et 1-(1-ényl-palmitoyl)-2-linoleoyl-GPE (p-16:0/18:2) (0,873 : 0,798-0,955 ; P = 0,003).

Les analyses de sensibilité ont également validé les résultats. La force de ces résultats a été confirmée par des évaluations de l’hétérogénéité et de la multiplicité horizontale (Tableau Supplémentaire 8 et Tableau Supplémentaire 9). Ces conclusions sont étayées par l’analyse « laisse-en un de côté ».

Médiation du risque de cellules immunitaires - HT par les métabolites plasmatiques

S’appuyant sur les phénotypes des cellules immunitaires et les métabolites plasmatiques déjà identifiés, une stratégie IRM à deux échantillons a été appliquée pour estimer les effets médiateurs potentiels. Lors de la première étape, des analyses IRM ont été réalisées en utilisant 32 phénotypes des cellules immunitaires comme expositions et 9 métabolites plasmatiques comme résultats, révélant 12 associations causales significatives impliquant 10 phénotypes des cellules immunitaires et 8 métabolites plasmatiques, avec des estimations d’effet correspondantes β1 des cellules immunitaires vers les métabolites. Parmi celles-ci, l’association la plus significative a été identifiée entre le CD3 sur les cellules Treg sécrétantes du CD39+ et les niveaux de C5 (1,050 : 1,016-1,085 ; P = 0,004). Dans la deuxième étape, C5 était traité comme l’exposition et HT comme le résultat. Des analyses IRM ont été réalisées, incluant la détection des valeurs aberrantes MR-PRESSO et des évaluations d’hétérogénéité et de pléiotropie horizontale. Aucun SNP atypique ni preuve d’hétérogénéité ou de pléiotropie n’a été détecté (Tableau 2), ce qui nous permet d’estimer l’effet causal du métabolite plasmatique à HT (β2) (Figure supplémentaire 6).

À la dernière étape de l’analyse IRM, des analyses de médiation ont été réalisées pour clarifier si l’effet causal des phénotypes des cellules immunitaires sur la TH était médié par des métabolites plasmatiques. Les résultats ont indiqué que des niveaux accrus de C5 agissaient comme médiateur dans la voie reliant le CD3 sur les cellules Treg sécrétaires de CD39+ à un risque accru de développement de TH (Suppléments Figure 7 et Figure 3). Les tests de détection, d’hétérogénéité et de pléiotropie MR-PRESSO n’ont révélé aucun SNP biaisé ni signe d’hétérogénéité ou de pléiotropie horizontale (Tableau 3, Tableau Supplémentaire 10 et Tableau Supplémentaire 11). Parmi eux, la proportion médiatrice des niveaux de C5 était de 8,89 % (2,34 % à 15,4 %) (P = 0,008). Enfin, des analyses IRM par médiation inverse ont été réalisées pour tester rigoureusement les hypothèses de directionnalité. Pour les métabolites des cellules immunitaires, l’IRM inversée (niveaux de C5 jusqu’à CD3 sur le Treg sécrétaire du CD39+) n’a montré aucun effet causal significatif (P de la FIV > 0,05 après correction de Bonferroni), soutenant l’unidirectionnalité (Tableau 4). Pour la TH vers les métabolites, l’IRM inversée (TH jusqu’aux niveaux C5) n’a révélé aucune association causale (IVW P > 0,05 après correction de Bonferroni), ce qui soutient la directionnalité supposée (Tableau 5). Compte tenu de l’effet total modeste et du manque de preuves réciproques dans l’IRM bidirectionnelle, ces résultats de médiation doivent être considérés comme exploratoires.

Détection de cytométrie en écoulement CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺ Treg

Pour valider les résultats de l’analyse métabolomique, une validation expérimentale in vitro a été réalisée afin d’évaluer les caractéristiques d’expression du Treg CD39⁺ et du plasma C5. La cytométrie en flux a été utilisée pour quantifier les cellules Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) et leurs sous-ensembles CD39⁺ (CD3⁺CD4⁺CD25⁺CD39⁺) dans le sang périphérique chez des patients atteints de TH et des témoins sains. Comme le montre la figure 4A–C, les cellules Treg (CD3⁺CD4⁺CD25⁺) et CD39⁺ Treg étaient significativement élevées chez les patients HT par rapport aux individus en bonne santé (P < 0,001). Le profilage métabolomique du plasma ciblé utilisant la spectrométrie de masse tandem a également montré que les niveaux de C5 étaient nettement plus élevés dans le groupe HT (P < 0,001, Figure 4D). De plus, l’analyse de corrélation de Pearson a révélé une association positive entre les niveaux de C5 plasmatique et la fréquence du sous-ensemble CD39⁺Treg (Figure 4E), cohérente avec la voie supposée CD39⁺Treg-C5-HT identifiée par IRM. Cependant, la conception transversale et la petite taille de l’échantillon empêchent toute inférence causale à partir de ces données seules.

DISPONIBILITÉ DES DONNÉES :

Les statistiques résumées de l’étude d’association génomique (GWAS) pour la thyroïdite de Hashimoto ont été obtenues à partir du catalogue GWAS (ebi-a-GCST90018855 ; https://gwas.mrcieu.ac.uk/). Les statistiques résumées des caractéristiques des cellules immunitaires ont été extraites du catalogue GWAS (ebi-a-GCST90001391 to ebi-a-GCST90002121 ; https://www.ebi.ac.uk/gwas/). Les données GWAS sur les métabolites plasmatiques ont été obtenues à partir du catalogue GWAS (GCST90199621-GCST90201020 ; https://www.ebi.ac.uk/gwas/studies/GCST90199621-90201020). Les données soutenant les résultats de cette étude sont fournies dans le Fichier Supplémentaire 1.

Figure 1 : Graphique forestier montrant les effets causaux des caractéristiques des cellules immunitaires sur la thyroïdite de Hashimoto. Graphique forestier résumant les effets causaux de tous les traits des cellules immunitaires évalués dans cette étude sur la thyroïdite (HT) de Hashimoto. Abréviations : nsnp, nombre de polymorphismes mononucléotidiques (SNP) ; pval, valeur P ; OU, rapport des chances ; IC, intervalle de confiance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 2 : Graphique forestier montrant les effets causaux de la thyroïdite de Hashimoto sur les phénotypes des cellules immunitaires. Graphique forestier résumant les effets causaux de la TH sur divers phénotypes des cellules immunitaires. Abréviations : nsnp, nombre de SNP ; pval, valeur P ; OU, rapport des chances ; IC, intervalle de confiance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 3 : Graphique forestier montrant l’effet de médiation de l’isovalérylcarnitine plasmatique (C5) entre CD39+ et la thyroïdite de Hashimoto. Graphique forestier résumant les effets causaux du plasma C5 qui médiatisent l’association entre CD39+ et HT. Abréviations : OR, rapport de chances ; IC, intervalle de confiance. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Figure 4 : Expression des lymphocytes T régulateurs CD39+ et des niveaux plasmatiques d’isovalérylcarnitine (C5) chez les patients atteints de thyroïdite de Hashimoto. (A) Stratégie de contrôle de cytométrie en flux pour la T régulatrice (Treg ; CD3+CD4+CD25+) et CD39+ cellules Treg. (B) Niveaux totaux de cellules Treg. (C) Niveaux de cellules Treg CD39+. (D) Niveaux d’isovalérylcarnitine (C5) en plasma mesurés par spectrométrie de masse en tandem. (E) Analyse de corrélation de Pearson entre les niveaux plasmatiques d’isovalérylcarnitine (C5) et la proportion de cellules Treg-Clon CD39+. Abréviations : SSC-A, zone de dispersion latérale ; FSC-A, zone de diffusion avant ; FSC-H, hauteur de diffusion avant. P < 0,001 contre des témoins sains. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Effets causaux de neuf métabolites plasmatiques significativement associés sur la thyroïdite de Hashimoto.  Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 2 : Effet causal des niveaux d’isovalérylcarnitine (C5) sur la thyroïdite de Hashimoto (β₂). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 3 : Effet causal des lymphocytes T régulateurs CD3+CD39+ sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 4 : Effet causal des niveaux d’isovalérylcarnitine (C5) sur les lymphocytes T régulateurs CD3+CD39+. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau 5 : Effet causal de la thyroïdite de Hashimoto sur les niveaux d’isovalérylcarnitine (C5). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 1 : Conception de l’étude et flux de travail analytique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 2 complémentaire : Diagrammes de dispersion montrant des estimations causales des associations entre 32 traits des cellules immunitaires et la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 3 : Analyses Leave-one-out évaluant la robustesse des effets causaux de 32 caractéristiques des cellules immunitaires sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 4 complémentaire : Diagrammes de points montrant les effets causaux de la thyroïdite de Hashimoto sur six phénotypes des cellules immunitaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure complémentaire 5 : Analyses sans filtre évaluant la robustesse des effets causaux de la thyroïdite de Hashimoto sur six phénotypes des cellules immunitaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : Association causale entre les niveaux d’isovalérylcarnitine (C5) et le risque de thyroïdite de Hashimoto. (A) Graphique forestier montrant l’effet causal des niveaux d’isovalérylcarnitine (C5) sur le risque de TH (β₂). (B) Graphique de la zone montrant l’estimation de l’effet causal pour chaque SNP sur le risque de HT. (C) Diagramme d’entonnoir évaluant l’hétérogénéité des estimations de randomisation mendélienne (RM) de l’effet des niveaux de C5 sur le risque de TH. (D) Analyse à l’exception démontrant que l’estimation globale du risque n’a pas été substantiellement influencée par un SNP individuel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure 7 complémentaire : Association causale entre les lymphocytes T régulateurs CD3+CD39+ et le risque de thyroïdite de Hashimoto. (A) Graphique forestier montrant l’effet causal total des lymphocytes T régulateurs CD3+CD39+ sur le risque de TH. (B) Graphique de la zone montrant l’estimation de l’effet causal pour chaque SNP sur le risque de HT. (C) Graphique en entonnoir évaluant l’hétérogénéité des estimations de la RM pour l’effet des lymphocytes T régulateurs CD3+CD39+ sur le risque de TH. (D) Analyse à l’exception démontrant que l’estimation globale du risque n’a pas été substantiellement influencée par un SNP individuel. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 1 : Caractéristiques des ensembles de données d’études d’association génomique à l’échelle du génome pour les métabolites plasmatiques utilisés dans l’analyse de randomisation mendélienne.  Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 2 : Caractéristiques des variables instrumentales (SNP) et des F-stats pour les principaux phénotypes des cellules immunitaires utilisés lors des expositions dans l’analyse de randomisation mendélienne. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 3 : Évaluation de la pléiotropie pour les analyses de randomisation mendélienne des phénotypes cellulaires immunitaires sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 4 : Évaluation de l’hétérogénéité pour les analyses de randomisation mendélienne des phénotypes des cellules immunitaires sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 5 : Évaluation de la pléiotropie pour les analyses de randomisation mendéliennes de la thyroïdite de Hashimoto sur les phénotypes des cellules immunitaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 6 : Évaluation de l’hétérogénéité pour les analyses de randomisation mendélienne de la thyroïdite de Hashimoto sur les phénotypes des cellules immunitaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau supplémentaire 7 : Polymorphismes mononucléotidiques associés aux métabolites plasmatiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 8 : Évaluation de la pléiotropie pour les analyses de randomisation mendélienne des métabolites plasmatiques sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 9 : Évaluation de l’hétérogénéité pour les analyses de randomisation mendéliennes des métabolites plasmatiques sur la thyroïdite de Hashimoto. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 10 : Évaluation de la pléiotropie pour les analyses de médiation des associations phénotype cellulaire–thyroïdite de Hashimoto par les métabolites plasmatiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Tableau complémentaire 11 : Évaluation de l’hétérogénéité pour les analyses de médiation des associations phénotype cellulaire–thyroïdite de Hashimoto par les métabolites plasmatiques. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Données soutenant les résultats de cette étude. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, la randomisation mendélienne a été appliquée pour étudier l’impact causal des phénotypes des cellules immunitaires sur la thyroïdite de Hashimoto (HT) et pour explorer le rôle médiateur potentiel des métabolites plasmatiques. Trente-deux phénotypes immunitaires ont été identifiés comme étant associés au risque de TH, incluant les cellules dendritiques, les lymphocytes T régulateurs, les stades de maturation des lymphocytes T, les cellules B et les cellules myéloïdes, avec des effets à la fois favorisants et protecteurs. De plus, 9 métabolites plasmatiques ont montré des liens causaux avec la TH, et ont également observé que le C5 pourrait en partie médier l’association entre l’expression du CD3 sur les cellules Treg sécrétaires du CD39⁺ et la HT. Ces résultats doivent être interprétés comme des preuves d’effets causaux supposés déduits d’instruments génétiques, plutôt que comme une confirmation mécaniste directe.

Parmi les phénotypes cDC, CD62L-plasmacytoïde DC %DC et HLA DR sur DC plasmacytoïde étaient associés à un risque accru de TH, tandis que CCR2 sur CD62L+ myéloïde DC, CD39+ Treg %activé et CD62L sur monocyte. Les associations identifiées entre des phénotypes spécifiques des cellules immunitaires et la TH offrent de nouvelles perspectives sur la pathogenèse de la maladie. Par exemple, le risque de TH a été corrélé à des caractéristiques telles que HLA DR sur la DC plasmacytoïde et la DC plasmacytoïde CD62L, indiquant que ces types cellulaires peuvent être essentiels pour initier ou maintenir des réactions auto-immunes contre la glande ^{thyroïde 28}. De nombreuses études ont démontré que les cellules épithéliales thyroïdiennes HLA DR+ stimulent activement les réponses immunitaires au sein de la glande thyroïde chez les patients atteints de HT 28,29,30,31. Cette étude a révélé une corrélation entre HLA DR sur les plasmacytoïdes et un risque accru de TH, indiquant que HLA DR sur les plasmacytoïdes pourrait être un facteur causal dans HT. Des études antérieures ont identifié des gènes clés avec une grande précision diagnostique pour la TH par des méthodes bioinformatiques, et des immunotests ont montré que l’infiltration des monocytes est négativement corrélée à l’expression génique pivot. Xu et ^al.32 ont rapporté que des niveaux plus élevés d’expression de CD62L sur les monocytes étaient associés à un risque réduit de TH, conformément aux résultats actuels. Plus précisément, des phénotypes tels que CCR2 sur les cellules dendritiques myéloïdes CD62L+ et CD62L sur les monocytes étaient liés à un effet protecteur, indiquant des rôles régulateurs ou suppresseurs potentiels pouvant atténuer l’auto-immunité thyroïdienne.

De nombreuses sources de preuve soulignent le rôle crucial que joue l’équilibre des cellules Th17 et Treg dans le développement de HT^33,34. Cette étude a identifié un lien causal entre la TH et plusieurs caractéristiques de Treg. Plus précisément, le risque de développer une HT était inversement associé à l’expression de CD25 sur les lymphocytes T régulateurs CD39+ au repos, tandis que le rapport Th17/Treg a été observé augmenter avec la progression de HT³⁵. La fonction complexe des lymphocytes T régulateurs dans la préservation de la tolérance immunologique et la prévention des maladies auto-immunes est mise en évidence par les fortes corrélations de différents phénotypes de Treg, avec un risque à la fois élevé et réduit de TH. Les cellules Treg sont doubles, certains sous-groupes pouvant aggraver les réponses auto-immunes tandis que d’autres les suppriment. Cela souligne la nécessité de recherches supplémentaires pour définir précisément leurs rôles en HT.

De plus, au sein des stades de maturation des lymphocytes T, des groupes TBNK, monocytes et B, un schéma cohérent a été observé dans lequel certains phénotypes immunitaires étaient liés à un risque plus élevé de TH, tandis que d’autres semblaient conférer un effet^protecteur 32,36,37,38. Cela souligne l’implication complexe des cellules immunitaires dans le développement de la TH. Une analyse IRM inverse a également été réalisée pour examiner l’effet de la TH sur les caractéristiques des cellules immunitaires. L’analyse a révélé que la TH était associée à des niveaux accrus de certains phénotypes des cellules immunitaires, tels que la sécrétation de cellules T régulatrices CD4 et de MDSC monocytiques, ainsi qu’une diminution des niveaux d’autres, notamment les lymphocytes T régulateurs CD4 activés et les cellules T CD25+ CD4+.

Notamment, l’analyse de médiation met en lumière le rôle causal des niveaux de C5 dans la progression des phénotypes des cellules immunitaires au développement de la TH. Des études antérieures ont montré que les niveaux plasmatiques de C5 contribuent au développement de la neuropathie périphérique^{diabétique 39} et sont corrélés à la fois à la sarcopénie et à la baisse de l’indice musculaire^{squelettique 40}. De plus, en termes de métabolisme lipidique, des concentrations plus faibles d’isovalérylcarnitine ont été observées chez des individus présentant un phénotype de^{fragilité 41}. La proportion de médiation de 8,89 % observée dans cette étude suggère que le C5 pourrait représenter un lien mécaniste présumé dans la voie Treg–HT CD39⁺ , et mérite une investigation approfondie en tant que biomarqueur candidat et cible thérapeutique dans des études expérimentales et cliniques prospectives.

Bien que cette étude apporte des informations précieuses, certaines limitations méritent d’être prises en compte. Premièrement, l’approche RM repose sur l’hypothèse que les variables instrumentales utilisées sont valides et non influencées par des facteurs de confusion ou par la pléiotropie 42,43,44. Deuxièmement, les analyses IRM primaires étaient basées sur des données GWAS d’ascendance européenne, et le GWAS de cellules immunitaires a été dérivé d’une population fondatrice sarde dont la structure distincte de déséquilibre de liaison peut limiter la généralisation ; Des études futures sur des cohortes diverses et non européennes sont nécessaires pour confirmer l’applicabilité spécifique à chaque population. Troisièmement, l’analyse de médiation a identifié le C5 comme un facteur pouvant représenter un lien exploratoire. De futures études intégrant des cohortes plus diversifiées sont nécessaires pour confirmer ces associations et explorer les effets potentiels spécifiques à chaque population. Enfin, des expériences de cytométrie en flux et de validation du plasma ont fourni des preuves solides pour les résultats de l’IRM ; cependant, la taille de l’échantillon était relativement limitée. Des études expérimentales et cliniques plus larges sont nécessaires pour valider ces interactions métaboliques immunitaires et explorer si cibler les cellules CD39⁺Treg ou les voies métaboliques apparentées pourrait offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques pour la TH.

Conclusion

En conclusion, cette étude apporte de nouvelles perspectives sur les relations causales entre les phénotypes des cellules immunitaires, en particulier les Tregs CD39⁺ , et la HT, avec le C5 identifié comme un médiateur candidat dans cette voie sur la base d’une analyse de médiation exploratoire. Ces résultats révèlent un nouvel axe immunométabolique, offrant des perspectives mécanistes et des cibles potentielles pour le développement de biomarqueurs et l’intervention thérapeutique dans les maladies auto-immunes de la thyroïde. De futures études avec des cohortes prospectives plus larges pourront valider davantage ces résultats et explorer la valeur potentielle d’application de l’immunomodulation dans le traitement de la TH.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps monoclonal CD25-PE	BD Biosciences	340938	Anticorps pour cytométrie en flux pour la détection humaine CD25
Anticorps monoclonal CD39-PE-Cy7	BD Biosciences	567526	Anticorps pour cytométrie en flux pour la détection humaine CD39
Anticorps monoclonal CD4-FITC	BD Biosciences	340133	Anticorps pour cytométrie en flux pour la détection humaine CD4
Anticorps monoclonal D3-APC	BD Biosciences	555333	Anticorps pour cytométrie en flux pour la détection humaine CD3
Solution FACS Lysing	BD Biosciences	349202	Tampon de lyse des globules rouges pour la préparation d'échantillons en cytométrie en flux
Cytomètre à flux	BD Biosciences	FACSCanto II	Instrument de cytométrie en flux multicolore pour l'immunophénotypage
Logiciel d'analyse de cytométrie en flux (FACSDiva)	BD Biosciences	—	Logiciel pour l'acquisition et l'analyse des données de cytométrie en flux
Package gwasglue	Package R	—	Harmonisation des jeux de données GWAS
Package ieugwasr	Package R	—	Interface vers la base de données GWAS IEU
Système de chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem (LC–MS/MS)	Thermo Fisher Scientific	—	Utilisé pour la quantification de l'isovalérylcarnitine (C5) plasmatique
Tampon de phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9624	PBS stérile, pH 7,4, utilisé pour le lavage et la resuspension
Logiciel R	Logiciel open source	Version 4.4.1	Environnement d'analyse statistique
Package TwoSampleMR	Package R	—	Package d'analyse par randomisation mendélienne
Package VariantAnnotation	Bioconductor	—	Annotation des données de variantes