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Article de recherche

Effets sur la qualité de l’ARN des PBMC sous différents temps de cryoconservation et méthodes de traitement chez les patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules avancés

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DOI :

10.3791/70261

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21 avril 2026

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1Biobank, Jilin Cancer Hospital, 2Medical Oncology Translational Research Lab, Jilin Cancer Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Cette étude compare le Triple Isolation Reagent (TRIzol) et la solution classique (FBS + DMSO) pour la cryoconservation des PBMC des patients atteints de NSCLC. TRIzol maintient une intégrité satisfaisante de l’ARN jusqu’à 6 mois, ce qui le rend recommandé pour une conservation de l’ARN de haute qualité.

Résumé

Les cellules mononucléaires du sang périphérique cryopréservé (PBMC) sont largement utilisées dans le séquençage de l’ARN (RNA-seq), et la qualité de leur ARN influence directement les résultats des tests. Cependant, la cryoconservation peut facilement entraîner la dégradation de l’ARN dans les PBMC, et la question de l’amélioration de la qualité de l’ARN lors de la cryoconservation à long terme reste non résolue. Les PBMC à partir d’échantillons de sang frais prélevés chez des patients atteints d’un cancer du poumon avancé non à petites cellules (NSCLC) ont été utilisés comme témoins. L’efficacité de la conservation de l’ARN des échantillons de PBMC a été comparée entre la solution classique de cryoconservation cellulaire (90 % de sérum bovin fœtal [FBS] + 10 % de diméthylsulfoxyde [DMSO]) et le réactif d’extraction d’ARN courant (TRIzol) à -80 °C pendant 1, 3 et 6 mois. La concentration, la pureté et l’intégrité de l’ARN (mesurées par le numéro d’intégrité ARN [RIN]) ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis micro-volume multi-échantillons et d’un bioanalyseur électrophorétique microfluidique automatisé afin de fournir une base théorique pour la préservation d’échantillons d’ARN de haute qualité. Cette étude a démontré que la concentration, la pureté et l’intégrité de l’ARN dans les PBMC diminuaient avec une durée prolongée de cryopréservation. Bien que les deux méthodes de traitement n’aient eu aucun effet sur la concentration d’ARN, elles affectaient la pureté et l’intégrité de l’ARN. L’intégrité ARN des PBMC cryopréservés avec TRIzol pendant 6 mois est restée satisfaisante. Nos résultats indiquent que TRIzol contribue à une cryoconservation efficace et maintient un ARN de haute qualité.

Introduction

L’ARN-seq de la CMP chez les patients atteints de CPNPC joue un rôle crucial dans l’évaluation de l’efficacité de l’immunothérapie. Le cancer du poumon non à petites cellules (CPNM) est une tumeur maligne courante dans le monde, et environ 70 % des patients sont diagnostiqués à un stade avancé avec un pronosticmauvais 1,2. L’immunothérapie a révolutionné le paradigme thérapeutique des CPNPC en proposant des stratégies thérapeutiquesinnovantes 3,4. Dans le traitement des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI), le séquençage ARN (RNA-seq) des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) obtenu auprès de patients atteints de CPNPC peut surveiller les changements dynamiques des bénéfices cliniques del’immunothérapie 5. Les sources d’échantillons pour l’ARN-seq incluent le tissu tumoral et les PBMC 6,7, les PBMC servant d’échantillon biologique essentiel tant dans les essais cliniques que dans la recherche scientifiquefondamentale 8. La cryoconservation représente la méthode principale de stockage à long terme des échantillons, maintenant les cellules et les tissus dans un état de repos tout en préservant leur potentiel biologique et leurs caractéristiques. Par conséquent, la cryopréservation des PBMC s’est imposée comme une approche réalisable et largement adoptée. Le PBMC cryopréservé facilite l’analyse par lots des échantillons, minimise la variabilité intra-laboratoire et inter-laboratoire, et optimise l’utilisation desressources 8,9. Par exemple, des études ont montré que l’utilisation d’un milieu RPMI-1640 congelé complété avec 40 % de sérum de veau fœtal (FCS) et 20 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) pour la cryoconservation PBMC démontre que les proportions de cellules T et B exprimant la combinaison CD39 et CD73 restaient relativement stables dans les six mois suivant le stockage10. Une étude a comparé trois kits de cryoconservation commerciaux et deux agents cryoprotecteurs (90 % RPMI-10 % DMSO, 90 % plasma-10 % DMSO), révélant une viabilité cellulaire similaire (81,0 %) et des taux de récupération similaires (73,7 %) entre différentes méthodes. Cependant, tous les PBMC cryopréservés ont montré une viabilité significativement réduite par rapport aux échantillons frais5. Des recherches supplémentaires ont démontré que le PBMC en suspension précipite dans le réactif TRIzol et les congele immédiatement à -80 °C. Après 1 à 2 jours, ils ont observé que la valeur RIN des PBMC était supérieure à celle des échantillons de sangtotal 11.

Une autre étude a comparé des échantillons de leucocytes traités avec du TRIzol, de l’RNAlater et d’autres réactifs, montrant que toutes les méthodes ont atteint des valeurs de nombre d’intégrité ARN (RIN) >7. L’intégrité de l’ARN a été évaluée à l’aide d’un bioanalyseur électrophorétique microfluidique automatisé, et le RIN a été calculé comme mesure quantitative de la qualité de l’ARN. Les échantillons avec RIN ≥7 ont été jugés adaptés à l’analyseARN-seq 12. Notamment, le groupe leucocytes + ARN plus tard a montré un rendement d’ARN significativement plus faible que le groupe leucocytes+ TRIzol 12. Cependant, les recherches actuelles sur la cryopréservation des PBMC se concentrent principalement sur la viabilité cellulaire et l’analyse des phénotypes des cellules immunitaires après dégel ; une attention limitée a été portée à l’évaluation systématique et à long terme de la qualité de l’ARN sous différentes conditions de préservation. De plus, les protocoles standardisés pour la cryoconservation des échantillons de PBMC afin de préserver l’intégrité de l’ARN restentsous-développés 13,14,15. Cette lacune est particulièrement pertinente pour l’immunothérapie des CPNPC, où l’ARN de haute qualité issu de PBMC collectés longitudinalement est essentiel pour la découverte fiable de biomarqueurs et le suivi de la réponse au traitement.

Dans cette étude, nous émettons l’hypothèse que le choix de la méthode de cryopréservation influence significativement l’intégrité et la qualité à long terme de l’ARN dérivé des PBMC, et qu’un protocole optimisé peut maintenir l’adéquation de l’ARN pour des tests sensibles tels que le RNA-seq. Pour y remédier, des PBMC fraîchement isolés à partir d’échantillons sanguins prélevés sur des patients atteints de CPNPC avancés ont été utilisés comme témoins. L’efficacité de la préservation de l’ARN des échantillons de PBMC a été comparée entre deux méthodes de traitement (FBS à 90 % + 10 % DMSO et TRIzol) à -80 °C pendant 1, 3 et 6 mois (Figure 1). La concentration, la pureté et l’intégrité de l’ARN (mesurées par le RIN) ont été évaluées à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis micro-volume multi-échantillon et d’un bioanalyseur électrophorétique microfluidique automatisé. Cette étude vise à fournir une base théorique pour la préservation des échantillons d’ARN de haute qualité et à faire progresser la recherche translationnelle et la préservation des échantillons en médecine de précision tumorale.

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Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons de tissus humains et des échantillons cliniques dans cette étude ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et approuvées par le Comité d’éthique de l’hôpital du cancer de Jilin (Approbation éthique n° 202507-002-01). Un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les participants ou de leurs tuteurs légaux avant la collecte de l’échantillon. Des échantillons de sang périphérique (10 mL par patient) ont été prélevés sur 19 patients atteints de cancer du poumon non à petites cellules avancés (NSCLC) à l’hôpital du cancer de Jilin, pour un total de 133 échantillons d’ARN. Pour garantir la sécurité des laboratoires, toutes les opérations impliquant des produits chimiques dangereux étaient réalisées dans un cabinet de sécurité biologique.

Des informations détaillées sur les instruments, réactifs et consommables utilisés dans l’expérience ont été fournies dans le Tableau des matériaux.

Isolement du PBMC
Des échantillons de sang périphérique ont été prélevés pour l’isolement de la PBMC dans les 2 heures suivant la collecte. Les PBMC ont été isolés et purifiés par centrifugation à gradient de densité Ficoll-Paque à 400 × g pendant 25 minutes à température ambiante avec le frein désactivé. Après centrifugation, la couche intermédiaire de lymphocytes blancs laiteux (contenant les PBMC) a été soigneusementaspirée 16. Il est important de noter que nous avons strictement standardisé la concentration d’entrée PBMC pour chaque échantillon et chaque groupe afin d’assurer un nombre de cellules cohérent dans toutes les conditions expérimentales, minimisant ainsi la variation causée par l’entrée et le traitement des cellules. Cela garantit que les différences observées reflètent les effets réels des différentes méthodes de conservation plutôt que la variabilité technique. Pour chaque patient, les PBMC isolées ont été divisées en 7 tubes : un tube a été utilisé pour l’extraction immédiate d’ARN, et la concentration, la pureté et l’intégrité ont été évaluées. Les six tubes restants ont été cryopréservés à un taux de refroidissement de -1 °C/min : trois ont été traités avec 1 mL de 90 % FBS + 10 % de DMSO, et les trois autres avec 1 mL de TRIzol, suivis d’un stockage à -80 °C. L’extraction d’ARN et l’évaluation de la qualité ont été réalisées après 1, 3 et 6 mois de stockage congelé.

Extraction d’ARN
Les échantillons étaient retirés de leur stockage à -80 °C et décongelés à 4 °C jusqu’à17 °C complètement. Les échantillons conservés avec 90 % de FBS + 10 % de DMSO ou de solution de cryoconservation TRIzol ont été lavés une fois avec du PBS, centrifugés à 200 × g pendant 5 minutes à 4 °C, puis le surnageant a été éliminé pour conserver la granule cellulaire. L’ARN total a été extrait à l’aide de TRIzol. Plus précisément, un réactif TRIzol a été ajouté au tube de microcentrifuge contenant l’échantillon traité, mélangé par inversion, puis incubé à température ambiante pendant 5 minutes pour assurer une lyse complète. Par la suite, 200 μL de chloroforme ont été ajoutés, mélangés soigneusement par secouage, puis incubés à température ambiante pendant 15 minutes. Après centrifugation à 2400 × g pendant 15 minutes à 4 °C, la phase aqueuse supérieure a été soigneusement aspirée et transférée dans un nouveau tube Eppendorf. De l’isopropanol (0,5 mL) a ensuite été ajouté, bien mélangé, puis incubé à température ambiante pendant 5 à 10 minutes. Après centrifugation à 2400 × g pendant 10 minutes à 4 °C, le surnageant a été éliminé, laissant l’ARN précipité au fond du tube.

Le précipité a été resuspendu à 75 % d’éthanol (1 mL) avec un léger secouement, suivi d’une centrifugation à 1600 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Le surnageant était jeté et la pellete d’ARN laissée à sécher à l’air libre à température ambiante pendant 5 à 10 minutes. Enfin, les échantillons d’ARN ont été dissous dans de l’eau traitée à 50 μL au DEPC et incubés dans un bain-marie à 55–60 °C pendant 5 à 10 min18. Détection de la concentration et de la pureté de l’ARN. La concentration et la pureté de l’ARN ont été mesurées à l’aide de la méthode d’absorption ultraviolette à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis microvolume multi-échantillons (plage de mesure : 2,5–3000 ng/μL). La concentration d’ARN a été déterminée sur la base de la valeur d’absorption à 260 nm, tandis que la pureté de l’ARN a été évaluée à l’aide du rapport A260/A280. Le logiciel de mesure a été lancé ; « Acide Nucléique » fut cliqué sur l’interface principale. La plateforme de détection a été rincée deux fois avec de l’eau double distillée, puis 1,5 μL de l’échantillon d’ARN a été pipetté dessus. L’ARN-40 a été sélectionné pour le type d’échantillon, « Mesurer » a été cliqué, et les valeurs de concentration ainsi que de pureté A260/280 ont été enregistrées. Un rapport A260/A280 entre 1,9 et 2,1 indiquait une haute pureté de l’ARN, tandis que des valeurs inférieures à 1,8 suggéraient une contamination protéique, et des valeurs supérieures à 2,2 indiquaient une dégradation potentielle de l’ARN ou un isothiocyanaterésiduel 19.

Détection de l’intégrité de l’ARN
L’intégrité de l’ARN (RIN) a été évaluée à l’aide d’un bioanalyseur électrophorétique microfluidique automatisé et d’un kit de détection. Le RIN varie de 1 à 10, 1 indiquant un ARN fortement dégradé et 10 un ARN intact. Pour analyse, 1,2 μL d’ARN a été placé dans un tube PCR, dénaturé thermiquement à 70 °C pendant 2 minutes à l’aide d’un thermocycleur, puis immédiatement placé sur glace. Par la suite, 1 μL d’ARN dénaturé a été ajouté aux puits de détection de la puce pour l’analyse20. Le logiciel a été lancé, « Tests » sélectionné, et « ARN » sélectionné dans le menu déroulant. Le programme « Eucaryote Total RNA Nano Series II.xsy » a été sélectionné en fonction du réactif utilisé. « Démarrer » fut cliqué pour déclencher la détection. Après environ 10 minutes, le nombre et la hauteur du pic de l’échelle ont été vérifiés pour vérifier leur normalité.

Méthodes statistiques
Des tests de normalité ont été réalisés pour toutes les données. Les données normalement distribuées étaient exprimées en moyenne ± écart-type (DE), tandis que les données anormalement distribuées étaient exprimées en médiane (intervalle interquartile, IQR). Les comparaisons entre deux groupes ont été analysées à l’aide du test t par paires pour les données normalement distribuées et du test non paramétrique des échantillons apparentés pour les données anormalement distribuées. Pour les comparaisons entre trois groupes ou plus, une analyse de variance par mesures répétées a été utilisée pour les données distribuées normalement, et le test non paramétrique des échantillons apparentés a été utilisé pour les données distribuées anormalement. Toutes les analyses statistiques ont été réalisées avec SPSS 19.0 et GraphPad Prism 9.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001.

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Résultats

Effets des différents temps de cryoconservation et méthodes de traitement sur la concentration d’ARN dans les échantillons de PBMC
L’effet des différents temps de cryoconservation : Les échantillons frais de PBMC provenant de patients avancés en CPNPC ont servi de groupe témoin. Les échantillons ont été traités soit avec du TRIzol, soit avec 90 % FBS + 10 % DMSO et conservés à -80 °C pendant 1, 3 et 6 mois ; l’ARN total a été extrait pour mesurer la concentration d’AR...

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Discussion

De nombreux facteurs influencent la qualité de l’ARN dans les échantillons biologiques, notamment les variables pré-analytiques, les conditions de transport, la durée du traitement à température ambiante, la nécrose tissulaire, la température et les produits de congélation, la taille et le nombre d’aliquotes, ainsi que la durée de stockage, ont un impact significatif sur la qualité del’ARN 21. Pour des échantillons identiques, les variations dans le temps de cryoc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous reconnaissons chaleureusement les participants pour leur aide à l’expérience et leur soutien au fonds. Cette étude a été soutenue par des subventions du Département provincial des sciences et technologies du Jilin (Subvention n°YDZJ202501ZYTS691), Commission de la santé de la province du Jilin (Subvention n°2023jc064).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bioanalyseur Agilent 2100AgilentG2939BDétection de l’intégrité de l’ARN, évaluation de la qualité de l’ARN par génération du Nombre d’Intégrité de l’ARN (RIN)
Nanokit Agilent ARN 6000Agilent5067-1511  ;   ;   ;   ;   ;En collaboration avec le bioanalyseur Agilent 2100, fournissant des réactifs et des puces dédiés pour l’intégrité de l’ARN
Centrifuge  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Eppendorf  ;   ;5424RPour l’extraction de l’ARN
Centrifuge  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Eppendorf  ;   ;5810RPour extraire PBMC
Chloroforme  ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;   ;Société nationale du groupe pharmaceutique chinois20191031Pour l’extraction d’ARN par la méthode Trizol, utilisée pour séparer la phase aqueuse contenant l’ARN de la phase organique contenant les impuretés
DiméthylsulfoxydeBeijing Dingguo ChangshengDH105-2En tant que solution de cryoconservation pour les PBMC, permettant un stockage à long terme des échantillons à -80 °C ; C
TubeCorningMCT-150-CPour le stockage d’échantillons, le mélange de réactifs, la centrifugation et d’autres opérations expérimentales
ÉthanolShandong Lierkang25071901AExtraction d’ARN IIn par la méthode Trizol, utilisée pour laver les précipitations d’ARN afin d’éliminer les résidus
Sérum bovin fœtalXpbiomedC04001-500En tant que solution de cryoconservation pour les PBMC, permettant un stockage à long terme de
Solution de séparation de FicollBeijing Dingguo Changsheng Biotechnology CO., LTDCC0161Pour l’isolement et la purification du PBMC via centrifugation à gradient de densité
Cycleur thermique GeneTouch (Plus)BioerTC-EA-48DAPour la dénaturation thermique de l’ARN (70 & degrés ; C pendant 2 minutes), suivi d’une détection avec le bioanalyseur
IsopropanolSociété nationale du groupe pharmaceutique chinois20210929En extraction d’ARN par la méthode Trizol, utilisée pour la précipitation de l’ARN
Spectrophotomètre Nanodrop 8000GeneCompanyND-8000Pour la concentration d’ARN (basée sur l’absorbance à 260 nm) et la pureté (basée sur le rapport A260/A280) en utilisant la méthode d’absorption ultraviolette
PCR TubesCorningPCR-02-CPour la dénaturation thermique de l’ARN (70 & degrés ; C pendant 2 minutes), suivi d’une détection avec le bioanalyseur
Solution saline tamponnée phosphate   ;Système ProcellPB180327Pour la lyse directe et la préservation des PBMC, ou de l’ARN total ultérieur
Réactif d’isolation triple & nbsp ;Adsinads60154Pour la lyse directe et la préservation des PBMC, ou de l’ARN total ultérieur

Références

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