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Article de recherche
Cette recherche a révélé des niveaux accrus de HMGA1 et une diminution de l’expression de HAND1 dans le cancer du laryngée, indiquant une relation inverse et des associations significatives avec la métastase et le stade clinique, suggérant que les deux contribuent à la progression tumorale.
Cette étude a étudié les profils d’expression des gènes HMGA1 et HAND1 dans le carcinome épidermoïde laryngé (LSCC) ainsi que dans les tissus muqueuseux laryngés normaux adjacents grâce à l’application d’immunohistochimie et de méthodologies RT-PCR. L’objectif était d’étudier leurs rôles possibles dans l’initiation, l’avancement, l’invasion et la métastase du LSCC. HMGA1 et HAND1 ont été détectées dans des tissus cancéreux et normaux adjacents. Néanmoins, HMGA1 a montré une expression significativement élevée dans les tissus LSCC, tandis que HAND1 a montré des niveaux d’expression considérablement réduits. Une expression élevée de HMGA1 était positivement associée à la métastase ganglionnaire (100,0 % contre 50,0 %) et à un stade clinique avancé (91,7 % contre 44,4 %), mais n’était pas associée au grade histologique tumoral, au type clinique ou à l’âge du patient. En revanche, une expression réduite de la protéine HAND1 était associée à la métastase des ganglions lymphatiques, au stade clinique et au grade pathologique, suggérant un rôle dans la progression et la métastase tumorales. De plus, une corrélation linéaire négative a été observée entre les expressions de HMGA1 et HAND1, suggérant une interaction régulatrice potentielle dans laquelle HMGA1 pourrait supprimer l’expression de HAND1. Ces résultats impliquent que HMGA1 et HAND1 ont des fonctions complémentaires dans la pathogenèse des CCL, HMGA1 pouvant faciliter le développement tumoral et HAND1 agissant comme suppresseur. L’interaction entre ces deux gènes pourrait offrir de nouvelles perspectives sur les mécanismes moléculaires qui entraînent la progression et la métastase des LSCC.
Le cancer du larynge est la deuxième tumeur maligne primaire la plus courante de la tête et du cou, après le cancer du nasopharyngé, représentant entre 26 % et 30 % de toutes les tumeurs de la tête et du cou dansle monde. Plus de 90 % des cancers du larynge sont classés comme carcinomes épidermoïdes du larynge (LSCC)2. Les principaux traitements du cancer du larynge sont la chirurgie et la radiothérapie. La récidive locale et la métastase ganglionnaire sont les principales causes de décès chez les patients atteints de cancer du laryngée. Par conséquent, une gestion efficace de la récidive et des métastases reste un défi clinique majeur. Avec l’avancement de la biologie moléculaire, divers gènes présentant une expression anormale dans le cancer du larynge ont été identifiés. Cependant, les mécanismes sous-jacents à l’invasion tumorale et à la métastase dans le cancer du larynge restent incertains et restent un domaine nécessitant des recherches supplémentaires.
Les protéines du groupe A à haute mobilité (HMGA) sont des protéines liant la chromatine non histones situées dans le noyau cellulaire. HMGA1 se lie à l’ADN et aux protéines associées, induisant des altérations structurales de la chromatine qui régulent la transcriptiongénique 3. En tant que régulateur transcriptionnel associé à la chromatine, HMGA1 module l’expression de plusieurs gènes liés aux tumeurs impliqués dans la prolifération et la métastase. Des études antérieures ont démontré que HMGA1 est surexprimé dans un large éventail de cancers humains, notamment les tumeurs de la thyroïde, du colorectal, du pancréas, ainsi que des cancers de la tête etdu cou 4,5,6,7, ainsi que d’autres tumeurs épithéliales et solides rapportées dans la littérature. HMGA1 régule la tumorigenèse en modulant l’expression de plusieurs gènes cibles en aval impliqués dans la prolifération et lamétastase 8.
Les gènes exprimés par le cœur et les dérivés de la crête neurale (HAND) font partie de la famille bHLH (hélice–boucle–hélice basique), incluant HAND1 et HAND2. HAND1, en tant que facteur de transcription, joue un rôle dans la différenciation des trophoblastes et le développement ducœur 9. Cependant, le mécanisme d’expression de HAND1 dans la couche cellulaire extra-embryonnaire reste incertain. Il a été confirmé que HMGA1 se lie directement au promoteur HAND1, inhibant ainsi son activité à la fois in vivo et invitro 10. HAND1, en tant que protéine répresseure, a été impliquée dans la régulation de la différenciation cellulaire et de la formation du cancer. Des études ont montré que l’expression de HAND1 est silencieuse et hyperméthylée dans le cancer gastriquehumain 11, le cancer dupancréas 12, le cancer de l’ovaire13 et le cancer de la thyroïde14. Cependant, à notre connaissance, peu d’études ont étudié l’expression de HAND1 dans les tissus du cancer du laryngée.
Dans la présente étude, l’immunohistochimie (méthode de détection en deux étapes) et la réaction en chaîne par transcription inverse de la polymérase (RT-PCR) ont été utilisées pour détecter l’expression des protéines HMGA1 et HAND1 ainsi que de l’ARNm dans les LSCC et les tissus muqueuseux normaux adjacents. L’immunohistochimie permet de visualiser la localisation des protéines dans l’architecture tissulaire, tandis que la RT-PCR permet une détection sensible de l’expression génique au niveau transcriptionnel, fournissant des informations complémentaires sur les schémas d’expression des protéines et des ARNm. Comparé à la PCR quantitative (qPCR), qui offre une sensibilité et une quantification plus précise, au Western bloting, qui permet la validation au niveau protéique mais sans contexte spatial, et au séquençage ARN (RNA-seq), qui offre un profilage transcriptomique complet mais nécessite une analyse computationnelle avancée, l’utilisation combinée de l’immunohistochimie et de la RT-PCR représente une stratégie rentable et cliniquement applicable pour l’investigation des biomarqueurs. L’étude visait à explorer le rôle et la corrélation de ces deux facteurs dans l’occurrence, le développement, la progression et la métastase des CCL. De plus, l’évaluation de l’expression de HMGA1 et HAND1 peut fournir des biomarqueurs pour le diagnostic et l’évaluation pronostique du cancer du laryngée, améliorant potentiellement la stratification du risque et facilitant la prise de décision clinique.
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Cette étude a été examinée et approuvée par le Comité d’éthique de la recherche de l’Hôpital du Peuple Shijiazhuang (Approbation n° YKLS 2026 n° 041 ; 27 mars 2026). L’étude a été menée conformément au Règlement sur l’examen éthique de la recherche biomédicale impliquant des sujets humains, aux Règlements sur l’examen éthique des sciences de la vie et de la recherche médicale impliquant des sujets humains, à la Déclaration d’Helsinki, ainsi qu’aux Lignes directrices éthiques internationales pour la recherche médicale impliquant des humains. Des échantillons de tissus humains ont été prélevés à partir de spécimens chirurgicaux archivés conformément aux exigences éthiques institutionnelles, garantissant l’anonymisation et la confidentialité des données des patients. Un consentement éclairé écrit a été obtenu des participants, ou une renonciation au consentement a été accordée par le comité d’éthique pour l’utilisation de spécimens archivés anonymisés, selon le cas.
Matériaux expérimentaux
Source des spécimens
Un total de 42 cas de tissus de LSCC et 25 cas de tissus muqueuseux laryngés adjacents normals ont été prélevés à partir d’échantillons de résection chirurgicale de LSCC au département d’oto-rhino-laryngologie-chirurgie de la tête et du cou du Hebei entre février 2011 et août 2012. Parmi ceux-ci, 25 cas de muqueuse normale adjacente (prélevés sur un site > 1,0 cm du bord du cancer) ont été confirmés pathologiquement comme étant une muqueuse inflammatoire ou normale. Les 42 échantillons de LSCC ont tous été confirmés pathologiquement comme carcinomes à cellules squameuses. Tous les tissus étaient stockés à -80 °C. Les 42 patients étaient des hommes, sans aucune patiente féminine. Parmi les cas de la LSCC, 15 étaient bien différenciés, 18 modérément différenciés et 9 faiblement différenciés. Dix-huit cas présentaient des métastases ganglionnaires, tandis que 24 cas n’en avaient pas. La stadification clinique était basée sur le système de classification et de stadification TNM (UICC, 2002), avec 20 cas aux stades I et II, et 22 cas aux stades III et IV. Il y avait 30 cas de type supraglottique, 11 cas de type glottique et 1 cas de type sous-glottique. La tranche d’âge des patients était de 40 à 75 ans, avec un âge médian de 60 ans. Aucun des patients n’a reçu de radiothérapie ou de chimiothérapie avant l’opération, et les données cliniques étaient complètes.
Méthodes expérimentales et étapes
Procédure de coloration en HE
Préparation des lames et coloration à l’hématoxyline–éosine
Les lames en verre pour l’immunohistochimie ont d’abord été trempées dans un acide concentré pendant 24 heures, suivies d’un lavage approfondi sous l’eau du robinet courante pendant au moins 10 minutes pour éliminer l’acide résiduel, puis d’une immersion dans de l’eau distillée pendant 30 minutes à deux reprises, avec une légère agitation pour assurer un rinçage complet. Après un trempage à 95 % d’éthanol pendant 2 heures, les lames ont été séchées dans un four à 60 °C, puis immergées dans un mélange APES : acétone (1:49, v/v) pendant 1 minute avec un léger secouement pour assurer un revêtement uniforme, puis rinçées à l’acétone pure. Enfin, elles ont été séchées à l’air à température ambiante (20–25 °C) afin d’assurer une bonne adhérence tissulaire lors des séances de coloration ultérieures.
Les sections tissulaires enrobées à la paraffine ont été immergées séquentiellement dans le xylène I et le xylène II pendant 10 minutes chacune pour retirer la paraffine, suivies d’une réhydratation par éthanol gradué (100 %, 95 %, 80 %) pendant 5 à 10 minutes chacune, puis rincées dans de l’eau distillée pendant 2 minutes. Les sections ont ensuite été soumises à une coloration à l’hématoxyline–éosine (HE) comme suit : coloration à l’hématoxyline pendant 4 minutes, rinçage sous l’eau courante du robinet pendant 3 minutes avec un flux continu pour éliminer l’excès de teinture, différenciation à l’aide d’acide chlorhydrique à 1 % dans l’éthanol pendant 30 s, lavage trois fois à l’eau du robinet pour terminer la différenciation, et coloration à l’éosine pendant 10 s. La déshydratation graduée de routine a été effectuée séquentiellement en utilisant successivement 70 % d’éthanol, 80 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, d’éthanol anhydre I et d’éthanol anhydre II pendant 5 minutes chacun. Après séchage, la culasse était montée à l’aide d’un baume neutre.
Procédure d’immunohistochimie
Des sections de paraffine d’une épaisseur de 4 μm ont été coupées, posées à plat sur des lames recouvertes d’APES, puis placées dans un four à 67 °C toute la nuit, suivies d’une déparaffinisation avec Xylène I et II pendant 10 minutes chacune. La déshydratation progressive a été réalisée avec de l’alcool à 100 %, 90 % et 70 % pendant 5 minutes chacun, suivie d’un lavage avec de l’eau du robinet et de l’eau distillée pendant 3 minutes. Pour bloquer l’activité endogène de la peroxydase, des lames ont été incubées avec une solution fraîchement préparée de méthanol et peroxyde d’hydrogène, assurant une couverture complète de la section tissulaire à température ambiante (20–25 °C) pendant 20 minutes, suivies de trois lavages à l’eau distillée pendant 5 minutes dans un PBS de 0,01 M.
La récupération d’antigènes a été réalisée en immergeant des lames dans un tampon de citrate (pH 6,0) et en chauffant dans un autocuiseur à ~ 95–100 °C pendant 8 minutes pour HMGA1 et 10 minutes pour HAND1 avec les couvercles bien fermés afin de maintenir des conditions de pression constantes. Les sections ont ensuite été refroidies à température ambiante (20–25 °C) et lavées trois fois en 0,01 M PBS pendant 3 minutes chacune sous une légère agitation. Les anticorps primaires contre HMGA1 et HAND1 ont été dilués dans un diluant anticorps (respectivement 1:150 et 1:100) et mélangés doucement par pipetage avant d’être appliqués uniformément pour recouvrir complètement chaque section tissulaire. Les lames ont été incubées toute la nuit à 4 °C dans une chambre humidifiée. Après une incubation nocturne, les lames ont été retirées de la chambre humidifiée et laissées à s’équilibrer à température ambiante pendant 10 minutes. Les lames ont été lavées trois fois avec 0,01 M PBS (5 min par lavage) sous une légère agitation pour éliminer les anticorps non liés. L’excès de liquide a été retiré, et un anticorps secondaire (polymère anti-lapin/souris marqué par HRP) a été ajouté pour recouvrir entièrement la surface des sections tissulaires. Une incubation supplémentaire a été effectuée à 37 °C pendant 35 minutes.
La solution de substrat DAB a été appliquée goutte à goutte pour recouvrir le tissu, et le développement des couleurs a été surveillé au microscope pendant 1 à 3 minutes jusqu’à ce que la tache brune apparaisse, puis elle s’arrête immédiatement en rinçant à l’eau distillée une fois l’intensité optimale de la coloration atteinte. Une recoloration par hématoxyline, une différenciation alcoolisée à l’acide chlorhydrique et une solution d’ammoniac pour la réversion bleue ont été réalisées. Cela a été suivi d’une déshydratation alcoolique graduée de routine, de la transparence au xylène et d’un montage avec un baume neutre pour observation au microscope. Le PBS a été utilisé comme témoin à blanc à la place de l’anticorps primaire. De plus, des sections de tissu squameux de la tête et du cou et des sections de tissu placentaire HAND1 positives à HMGA1 ont été utilisées comme témoins positifs pour garantir la qualité et la consistance de la coloration.
Détermination des résultats
Le chromogène utilisé dans cette expérience est le système DAB-H2O2. Après la recoloration par hématoxyline, la coloration positive de HMGA1 et HAND1 est principalement observée dans le noyau cellulaire, avec une certaine coloration cytoplasmique. Pour évaluation, la région avec la plus forte densité de cellules colorées positivement a été identifiée sous faible grossissement (×40). Sous un grossissement ×100, cinq champs ayant la plus forte densité cellulaire positive ont été sélectionnés, et 100 cellules ont été comptées dans chaque champ. Le pourcentage moyen de cellules positives provenant des cinq champs est utilisé comme résultat pour chaque diapositive. Les critères de classification étaient les suivants : aucune cellule colorée (-), cellules positives < 25 % (+), cellules positives 25 % à 50 % (++), et cellules positives > 50 % (+++), basées sur une méthode de notation en pourcentage semi-quantitative couramment utilisée dans les analyses immunohistochimiques. L’évaluation a été réalisée indépendamment par deux pathologistes qualifiés de manière en doubleaveugle 15, 16, 17. Si leurs opinions diffèrent, ils devraient en discuter et parvenir à uneconclusion 18.
Méthode RT-PCR
Amorces
Les amorces ont été conçues à l’aide d’un logiciel de conception basé sur les séquences de gènes cibles, en tenant compte de la spécificité de l’amorce, de la compatibilité avec la température de fusion et de la taille attendue du produit. Les séquences détaillées d’amorces, les tailles des produits et les températures de recuit sont résumées dans le tableau 1. Les amorces ont été synthétisées à une concentration de 2 OD, divisées en deux tubes, puis diluées à 10 pmol/μL avec de l’eau traitée par DEPC pour un stockage à -20 °C. La température de recuit a été calculée à l’aide de la formule : Tm = 2(A + T) + 4(G + C)
Traitement par RNase des matériaux et équipements expérimentaux :
Objets en plastique (par exemple, pointes de pipette, tubes EP) : Les objets en plastique étaient placés dans une bouteille stérilisée à large bouche, de l’eau traitée préparée au DEPC était ajoutée jusqu’à ce que les objets soient complètement immergés, et les matériaux étaient incubés toute la nuit dans une hotte à température ambiante (20–25 °C). Ils ont ensuite été stérilisés sous pression pendant 120 minutes et séchés à 65 °C.
Objets en verre : La verrerie a été trempée toute la nuit dans de l’acide, bien rincée, séchée, enveloppée dans du papier aluminium, puis cuite dans un four à 200 °C pendant 6 heures avant de la conserver dans un endroit propre pour une utilisation ultérieure.
Objets métalliques (par exemple, ciseaux, pinces à épiler) : Les objets métalliques étaient lavés, cuits dans un four à 200 °C pendant 6 heures puis stockés dans un endroit propre pour une utilisation ultérieure.
Préparation des solutions
Solution DEPC à 0,1 % (v/v) : 1 mL de DEPC a été ajouté à 1000 mL d’eau distillée pour atteindre une concentration finale de 0,1 % (v/v), bien secoué, incubé à 4 °C toute la nuit, stérilisé par autoclavage, puis stocké à 4 °C.
Solution d’éthanol à 75 % (v/v) : 75 mL d’éthanol absolu ont été mélangés à 25 mL d’eau traitée par DEPC pour atteindre une concentration finale de 75 % (v/v), et stockés à 4 °C.
Extraction totale d’ARN à partir des tissus
Après l’extraction de l’ARN, l’intégrité de l’ARN a été évaluée avant la transcription inverse et l’analyse en aval. 80 mg de tissu étaient pesés à l’aide d’une balance électronique, découpés en petits morceaux et placés dans un homogénéisateur en verre prétraité. 1 mL de réactif d’extraction d’ARN pré-refroidi a été ajouté à 4 °C, et l’échantillon a été homogénéisé sur glace par broyage répété jusqu’à obtenir un lysat uniforme sans fragments de tissu visibles, évitant la formation de bulles. Le mélange homogénéisé a été transféré dans un tube EP sans RNase de 1,5 mL et incubé sur glace pendant 5 minutes. Un chloroforme de 400 μL a été ajouté à chaque tube, vortexé vigoureusement pendant 10 à 15 secondes pour assurer un mélange complet de phase, suivi d’une incubation sur glace pendant 5 minutes. Les tubes étaient centrifugés à 4 °C, 12 000 x g pendant 15 minutes. Après centrifugation, la phase aqueuse supérieure a été soigneusement aspirée à l’aide d’une pipette sans RNase sans perturber la couche d’interphase dans un nouveau tube. Un volume égal d’isopropanol a été ajouté, mélangé en inversant doucement le tube 8 à 10 fois jusqu’à ce que les couches disparaissent, puis incubé à -20 °C pendant au moins 10 minutes. Le mélange a été centrifugé à 4 °C, 12 000 x g pendant 10 minutes. La couche surnageante a été éliminée, 400 μL d’éthanol glacé à 75 % ont été ajoutés pour suspendre la pelote d’ARN. Le mélange a de nouveau été centrifugé à 4 °C, 12 000 x g pendant 5 minutes. La couche surnageante a été jetée, et la pellete d’ARN légèrement sèche. La pastille d’ARN a été dissoute dans de l’eau sans RNase et stockée à -80 °C pour une utilisation future.
Détection de l’intégrité de l’ARN
Pour la détection de l’intégrité de l’ARN, 5 μL d’échantillon d’ARN ont été mélangés à 5 μL de tampon de charge bleue de bromophénol, et l’électrophorèse a été réalisée sur un gel d’agarose à 2 %. L’intégrité de l’ARN était considérée comme acceptable lorsque des bandes claires de 28S, 18S et 5S étaient visibles sans flou évident.
Transcription inverse (RT) pour synthétiser l’ADNc
6 μL d’ARN ont été préchauffés à 70 °C pendant 10 minutes, puis 25 mM deMgCl 2 (4,0 μL), dNTP (2,0 μL), AMV (0,7 μL), 10× AMV tampon (2,0 μL), oligo(dT) (1,0 μL), RNasin (0,5 μL) et de l’eau déionisée ont été ajoutés séquentiellement sur la glace pour obtenir un volume de réaction final de 20 μL, suivi d’un mélange doux et d’une brève centrifugation. Les conditions de réaction étaient de 25 °C pendant 1 minute, 42 °C pendant 60 minutes, 98 °C pendant 5 minutes, puis conservées à 4 °C indéfiniment. Une fois la réaction atteinte à 4 °C, le produit était retiré de la machine PCR, utilisé comme gabarit d’ADNc pour la réaction PCR suivante, puis stocké à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
Amplification PCR
Pour chaque réaction PCR, le mélange contenait un modèle d’ADNcD (1 μL), une amorce directe spécifique pour HMGA1, HAND1 ou GAPDH (1 μL), une amorce inversée spécifique au gène cible ou GAPDH (1 μL), un mélange maître PCR (10 μL) et de l’eau traitée à DEPC (7 μL), pour un volume total de 20 μL. Des réactions séparées ont été préparées pour chaque gène cible (HMGA1, HAND1) et le gène de contrôle interne (GAPDH), chaque réaction contenant sa paire d’amorces avant et arrière spécifiques à chaque gène.
Le volume total de la réaction était de 20 μL. Après un mélange délicat des composants de la réaction et une centrifugation rapide pendant 5 à 10 secondes à basse vitesse, le tube a été placé dans une machine PCR préchauffée et amplifié selon les conditions de réaction du tableau 2.
Confirmation et analyse de produits amplifiés par PCR
Préparation du gel
2 g d’agarose étaient pesés et placés dans une fiole triangulaire. 2 mL de tampon d’électrophorèse TAE à 50× et 100 mL d’eau distillée (préparez un gel d’agarose à 2 %) ont été ajoutés, puis chauffés dans un four micro-ondes avec des tourbillons intermittents (intervalles de 15 à 20 s) jusqu’à la dissolution complète de l’agarose. Après refroidissement à environ 55 °C, 10 μL de solution EB ont été ajoutés et bien mélangés. Le gel était ensuite versé dans un bac à gel propre à température ambiante (20–25 °C), lavé à l’eau distillée, puis inséré un peigne pour créer des puits d’échantillonnage. L’épaisseur du gel était de 0,4 cm. Le plateau a été placé sur une surface plane à température ambiante (20–25 °C) pendant 30 minutes jusqu’à ce que le gel se solidifie complètement. Le peigne fut soigneusement retiré.
Chargement des échantillons
4 μL de chaque échantillon d’ADN étaient ajoutés dans les puits du gel, et le marqueur d’ADN était ajouté dans le puits le plus à gauche.
Électrophorèse
Le bac de gel chargé était placé dans un réservoir d’électrophorèse rempli de tampon d’électrophorèse TAE, garantissant que le niveau de tampon restait environ 1 mm au-dessus de la surface du gel. Une extrémité des puits se trouvait à la cathode (pour permettre à l’ADN de migrer vers l’anode). Le système d’électrophorèse était connecté à une alimentation électrique et fonctionnait à 120 V et 60 mA pendant environ 45 minutes, jusqu’à ce que le tampon de charge dépasse la ligne médiane du gel, après quoi l’alimentation était coupée.
Observation des résultats et imagerie
Après électrophorèse, le gel a été soigneusement retiré, les résultats ont été observés sous un transilluminateur UV puis comparés au marqueur ADN pour déterminer si le poids moléculaire des fragments amplifiés apparaissait aux positions attendues. Le système d’imagerie gel était utilisé pour capturer des images et enregistrer les résultats sur ordinateur.
Configuration des commandes
De l’eau distillée a été utilisée à la place de l’ADNc comme témoin négatif.
Analyse semi-quantitative
Les résultats de l’électrophorèse sur gel d’agarose ont été analysés et capturés à l’aide du système d’imagerie sur gel. Un logiciel d’analyse d’image était utilisé pour analyser la luminosité des bandes. Les valeurs d’OD intégrées absolues de la bande d’amplification du gène cible et de la bande d’amplification du gène de contrôle interne correspondante ont été mesurées. Les résultats étaient exprimés comme le rapport entre la valeur de diamètre extérieur intégrée absolue de la bande cible et la valeur de diamètre extérieur intégrée absolue de la bande de contrôle interne correspondante.
C’est-à-dire expression relative = valeur OD du gène cible / valeur OD du gène de contrôle interne.
Analyse statistique
Toutes les données étaient organisées à l’aide d’Excel et analysées à l’aide de logiciels statistiques. Les variables continues ont été exprimées en moyenne ± écart-type (DE) et comparées entre deux groupes à l’aide du test t à échantillons indépendants. Les variables catégorielles nominales, y compris les taux d’expression immunohistochimiques positifs, ont été analysées à l’aide du test χ2 . Les variables ordinales catégorielles, incluant le grade pathologique et le stade clinique, ont été analysées à l’aide du test de somme des rangs (test Mann-Whitney U pour comparaisons en deux groupes, lorsque applicable). La corrélation entre l’expression de HMGA1 et HAND1 a été évaluée à l’aide d’une analyse de corrélation linéaire. Tous les tests étaient à deux queues ; P < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif, et P. < 0,01 était considéré comme très significatif.
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Résultats de détection immunohistochimique
Des images représentatives de coloration hématoxyline–éosine (HE) illustrant la morphologie histologique de la muqueuse laryngée normale adjacente et des LSCC avec divers degrés de différenciation (bon, modéré et faible) sont présentées. Plus précisément, la figure 1A montre la muqueuse laryngée normale adjacente, la figure 1B montre des LSCC...
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Le cancer du laryng, l’une des tumeurs les plus courantes de la tête et du cou, a montré une incidence croissante ces dernières années, probablement liée à des facteurs environnementaux et liés au mode de vie. Comme pour d’autres tumeurs malignes, sa récidive et sa métastase restent les principales causes de décès. Avec les avancées en biologie moléculaire, de nombreux facteurs associés au développement du cancer du larynge ont été identifiés, mais les mécanismes d’apparition et de métas...
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Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien de leur institution et de toutes les personnes ayant contribué à cette étude.
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| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Machine automatique d’incrustation de tissus | Sakura Finetek, Tokyo, Japon | Tissue-Tek TEC 5 | Incorporation de paraffine |
| Microtome | Leica Microsystems, Wetzlar, Allemagne | RM2135 | Sectionnement (4 & mu ; m) |
| Sèche-glissières | Xiaogan Hongye Medical Instrument Co., Ltd., Chine | CS-VI | Séchage par culasse |
| Incubateur chauffant | Shanghai Yangguang Experimental Instrument Co., Ltd., Chine | 303-4A | Incubation à température contrôlée |
| Microscope optique | Olympus Corporation, Tokyo, Japon | BX41 | Observation histologique |
| Système de capture d’image | QImaging, Canada | QCapture Pro 7 | Imagerie microscopique |
| Développé propre | Usine d’équipements semi-conducteurs Xicheng de Pékin, Chine | SW-CJ-1FD | Espace de travail stérile |
| Centrifugeuse réfrigérée | Usine de réparation d’instruments médicaux de Pékin, Chine | LXJ-64-01 | Séparation de l’ARN |
| Centrifugeuse de table | Shanghai Peiqing Technology Co., Ltd., Chine | PQ-1600A | Traitement ARN/ADN |
| Agitateur magnétique | Usine d’instruments médicaux Jintan du Jiangsu, Chine | HJ-3 | Préparation de la solution |
| Mini Mixer | Shanghai Peng' s Industrial Co., Ltd., Chine | H-1 | Mélange d’échantillons |
| Balancière électronique | METTLER Tolède, Suisse | PB3002-S | Pesée d’échantillons |
| Amplificateur PCR | Eppendorf AG, Allemagne | Mastercycler 5333 | Amplification PCR |
| Alimentation électrique par électrophorèse | Usine d’instruments Liuyi de Pékin, Chine | DYY-6C | Contrôle de la tension |
| Réservoir d’électrophorèse | Usine d’instruments Liuyi de Pékin, Chine | DYCZ-24DN | Électrophorèse sur gel |
| Four à micro-ondes | Institut de recherche sur les applications médicales Zhongda de Shanghai, Chine | WD800SL23 | Préparation de l’agarose |
| Transilluminateur UV | Usine d’instruments Liuyi de Pékin, Chine | WD-9403B | Visualisation de l’ADN |
| Système d’imagerie sur gel | Anlai Co., Ltd., Chine | AlphaImager HP | Documentation sur gel |
| Réfrigérateur (4 & degrés ; C) | Haier Biomedical, Chine | BC-165D | Stockage des échantillons |
| Congélateur à ultra-basse température | Haier Biomedical, Chine | DW-86L388 | Stockage (-80 degrés ; C) |
| Ice Box | Shanghai Fuzhi Technology Co., Ltd., Chine | FZ-IB-20L | Transport d’échantillons |
| Sacs de stockage cryogéniques | Shanghai Yili Technology Co., Ltd., Chine | YL-ULT-50 | Conservation des échantillons |
| Pipettes de recherche | Eppendorf AG, Allemagne | Research Plus | Manutention des liquides |
| Réactif d’extraction d’ARN (TRIzol) | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific), États-Unis | 15596026 | Extraction d’ARN |
| Kit de transcription inversée | Takara Bio Inc., Japon | RR037A | Synthèse de l’ADNc |
| PCR Master Mix | Takara Bio Inc., Japon | RR820A | Amplification PCR |
| dNTP Mix | Takara Bio Inc., Japon | 4030 (typique) | Composant PCR |
| Inhibiteur de RNase (RNasin) | Promega, USA | N2111 | Protection de l’ARN |
| Amorce Oligo(dT) | Takara Bio Inc., Japon | 3806 (typique) | Amorce de synthèse de cDNA |
| Agarose | Sigma-Aldrich, États-Unis | A9539 | Préparation du gel |
| TAMPON TAE (50 fois et plus de fois) | Sigma-Aldrich, États-Unis | TAE50X-1L (typique) | Tampon d’électrophorèse |
| Marqueur ADN (Échelle) | Takara Bio Inc., Japon | DL2000 (3421A) | Référence de taille |
| Bromure d’ethidium (EtBr) | Bio-Rad, USA | 1610433 | Visualisation de l’ADN |
| Tampon PBS | Gibco (Thermo Fisher Scientific), États-Unis | 10010023 | Tampon de lavage |
| Eau traitée par DEPC | Invitrogen, États-Unis | AM9916 | Protection de l’ARN |
| Chloroforme | Sigma-Aldrich, États-Unis | C2432 | Extraction d’ARN |
| Isopropanol | Merck, Allemagne | 109634 | Précipitations de l’ARN |
| Éthanol (absolu) | Merck, Allemagne | 100983 | Déshydratation |
| Méthanol | Merck, Allemagne | 106009 | Blocage par peroxydase |
| Peroxyde d’hydrogène (H2O2) | Sigma-Aldrich, États-Unis | H1009 | Blocage endogène de la peroxydase |
| Xylène | Sigma-Aldrich, États-Unis | 534056 | Déparaffinisation |
| Tampon de récupération d’antigènes de citrate | Abcam, Royaume-Uni | ab93678 | Récupération d’antigènes |
| Diluant d’anticorps | Dako, Danemark | S3022 | Dilution des anticorps |
| Anticorps primaire HMGA1 | Abcam, Royaume-Uni | ab129153 | Dilution 1:150 |
| Anticorps primaire HAND1 | Abcam, Royaume-Uni | ab200040 | Dilution 1:100 |
| Anticorps secondaire (conjugué à HRP) | Dako, Danemark | K5007 | Système de détection |
| Kit de substrat DAB | Dako, Danemark | K3468 | Détection chromogénique |
| Tache d’hématoxyline | Sigma-Aldrich, États-Unis | H9627 | Coloration nucléaire |
| Tache à l’éosine | Sigma-Aldrich, États-Unis | E4009 | Coloration cytoplasmique |
| Milieu de montage pour balsamie neutre | Sinopharm Chemical Reagent Co., Chine | 10004160 | Montage de culasse |
| Amorces HMGA1 | Synthétisé sur mesure (par exemple, IDT/Sangon) | N/A | Amplification génique |
| Amorces HAND1 | Synthétisé sur mesure (par exemple, IDT/Sangon) | N/A | Amplification génique |
| Amorces GAPDH (contrôle interne) | Synthétisé personnalisé | N/A | Gène de la maison |
| APES (Aminopropyltriethoxysilane) | Sigma-Aldrich & nbsp ; | N/A | Revêtement à coulisse |
| Tubes microcentrifuges sans RNase | Eppendorf ; | N/A | Manipulation de l’ARN |
| Embouts de pipette sans RNase | Eppendorf ; | N/A | Manutention des liquides |
| Plateau de moulage et peigne en gel d’agarose | Générique | N/A | Préparation du gel |
| Logiciel de conception d’amorces | Integrated DNA Technologies, États-Unis | Outil PrimerQuest | Conception de l’amorce |
| Logiciels d’analyse d’images | Media Cybernetics, États-Unis | Image-Pro Plus 6.0 | Quantification des bandes |
| Logiciels d’analyse statistique | IBM Corp., États-Unis | SPSS Version 13.0 | Analyse statistique |