Article de méthode

Cartographie de l’immunité infantile avec un apport minimal : profilage intégratif unicellulaire et multiomique

DOI :

10.3791/70279

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3 avril 2026

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1Department of Pediatrics, Yale University School of Medicine, 2Department of Biomedical Informatics and Data Science, Yale University School of Medicine, 3Department of Biostatistics, Yale University School of Public Health, 4Center for Systems and Engineering Immunology, Yale University, 5Department of Immunobiology, Yale University School of Medicine, 6Department of Obstetrics, Gynecology, & Reproductive Sciences, Yale University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole décrit la collecte et la conservation d’échantillons sanguins de patients néonatals et pédiatriques, ainsi que l’application de scRNA-seq, de protéomique et de cytométrie de flux spectral pour caractériser les populations cellulaires immunitaires issues de ces échantillons.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

À la naissance, le système immunitaire néonatal est soudainement confronté à un environnement radicalement différent, riche en stimuli microbiens et environnementaux. De plus en plus de preuves suggèrent que l’immunité précoce n’est pas seulement immature, mais plutôt adaptée de manière unique pour répondre aux exigences distinctes de cette fenêtre de développement. Durant cette période, le système immunitaire est très dynamique, subissant des changements rapides pour s’adapter au paysage externe changeant. Comprendre ce paysage immunitaire complexe et en évolution nécessite une étude directe chez les nouveau-nés. Cependant, une limitation majeure de ces recherches est le faible volume sanguin total chez les nouveau-nés (~100 mL/kg), qui limite la quantité pouvant être collectée en toute sécurité pour la recherche, en particulier chez les poids à la naissance extrêmement bas (ELBW) ou les nourrissons extrêmement prématurés. Dans nos travaux récents, nous abordons cette limitation en démontrant comment un profilage immunitaire à haute dimension peut être réalisé à partir de volumes infimes de sang néonatal. Nous introduisons un ensemble de protocoles optimisés pour l’échantillonnage longitudinal au cours de la vie précoce et appliquons des techniques avancées, incluant la cytométrie en flux, la protéomique et le séquençage d’ARN unicellulaire, afin de maximiser les informations obtenues à partir d’un apport minimal. Ensemble, ces méthodes permettent une vue complète des signatures transcriptomiques et protéomiques des cellules immunitaires circulantes chez les nouveau-nés, offrant de nouvelles perspectives sur la trajectoire unique de l’immunité précoce.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole est optimisé pour des échantillons de sang de 100 à 250 μL traités dans les 12 heures suivant la collecte, soit cryopréservés, soit utilisés immédiatement. À la naissance, le système immunitaire néonatal est propulsé dans un environnement radicalement différent, enrichi de stimuli microbiens et environnementaux qui étaient auparavant absents dans le cadre intra-utérinprotégé 1,2. Ce changement exige que le système immunitaire s’adapte et réponde à une vaste gamme de nouveaux antigènes, un processus essentiel à la survie mais qui pose aussi des défis importants 1,2. De plus en plus de preuves suggèrent que l’immunité précoce n’est pas simplement immature ou une version miniature du système immunitaire adulte. Au contraire, il est spécifiquement adapté pour répondre aux besoins spécifiques de cette période de développementcritique 3,4. Au cours de cette fenêtre néonatale, les composants cellulaires du système immunitaire, y compris divers types de cellules T, B et myéloïdes, mûrissent et développent des caractéristiques et fonctions uniques propres à lajeunesse 5,6,7,8. Malgré son importance, l’immunité néonatale reste difficile à étudier directement en raison de contraintes éthiques et pratiques. Une limitation majeure est le faible volume sanguin chez les nouveau-nés, avec une moyenne de ~100 mL/kg 9,10. Ce défi devient encore plus marqué lors du prélèvement sanguin de nourrissons extrêmement prématurés (nés avant 30 semaines de gestation) et de nourrissons ELBW, qui peuvent peser aussi peu que 400 g avec seulement 40 mL de sang circulant. Cela limite la quantité de sang pouvant être collectée en toute sécurité, soulignant la nécessité d’approches maximisant la production de données à partir d’échantillons minimes. Pour relever ce défi, nos travaux démontrent des protocoles optimisés pour le profilage immunitaire en haute dimension utilisant des volumes sanguins minuscules (100-250 μL), tels que ceux obtenus chez les nourrissons ELBW.

Les avancées récentes dans la collecte et le traitement du sang ont permis l’étude des réponses immunitaires dans des populations où l’acquisition d’échantillons est traditionnellement difficile. Des dispositifs à microaiguilles tels que les systèmes de phlébotomie Tasso et Touch Activated ont été initialement développés pour une collecte de sang pratique à domicile chez les adultes. Depuis, ils ont été adaptés pour une utilisation chez les nourrissons, permettant aux aidants principaux et aux équipes cliniques de prélever des échantillons avec un minimum d’inconfort. De plus, ils peuvent être utilisés à domicile sans le stress des visites cliniques répétées, facilitant ainsi l’adhésion et l’accessibilité. Un microtube à l’acide éthylénédiaminetétraacétique (EDTA) doit être utilisé avec l’appareil et expédié pendant la nuit au laboratoire en respectant les protocoles de biohazard appropriés. Le lendemain matin, lorsque les échantillons arrivent, ils doivent être traités à l’aide de méthodes de lyse des globules rouges (RBC) pour capturer les cellules immunitairescirculantes 6. À noter, les tubes EDTA permettent l’isolation des cellules vivantes, mais les considérations temporelles sont importantes. Pour les tests fonctionnels avec stimulation, les échantillons doivent être traités en moins de 4 heures et idéalement en moins de 2 heures après la collecte. Pour les tests phénotypiques non fonctionnels présentés ci-dessous, les échantillons doivent être traités dans les 12 heures afin de permettre un envoi nocturne tout en assurant la récupération, car la viabilité cellulaire diminue avecle temps 12. Comparée à la séparation traditionnelle par gradient de densité avec Ficoll, la lyse est plus rapide, moins laborieuse et permet une récupération plusélevée 13. Cependant, l’isolement cellulaire mononucléaire du sang périphérique par lyse peut laisser derrière lui des granulocytes contaminants, réduisant la pureté, mais peut être avantageuse pour les études intéressées par ces typescellulaires 14. Ces compromis mettent en lumière comment les adaptations méthodologiques équilibrent faisabilité et précision lors de l’étude d’échantillons cliniques rares ou sensibles, comme ceux des nouveau-nés. La gestion en aval des cellules isolées a également bénéficié d’améliorations méthodologiques. La cryoconservation avec du sérum bovin fœtal (FBS) et du diméthylsulfoxyde (DMSO) reste une approche robuste pour les cellules immunitaires, en particulier dans le sang fœtal et néonatal, où la viabilité et la récupération cellulaires sont cruciales. Parallèlement à l’optimisation du processus de prélèvement sanguin, nous avons également adopté des techniques en aval permettant d’extraire un maximum d’informations à partir de petits volumes d’échantillons. Nous introduisons un ensemble de protocoles optimisés qui facilitent l’échantillonnage au cours de la vie précoce, permettant un examen détaillé de la dynamique immunitaire au fil du temps. Notre approche exploite des techniques avancées telles que la cytométrie à flux spectral, la protéomique et le séquençage de l’ARN unicellulaire, qui offrent collectivement une vue inégalée des signatures protéomiques et transcriptionnelles des cellules immunitaires circulantes dans la jeunesse. De plus, la cytométrie à flux spectral offre des opportunités d’obtenir une compréhension fonctionnelle avec un apport cellulaire minimal.

Au fil des années, plusieurs techniques, telles que les numérotations sanguines complètes (NFS), ont été utilisées pour analyser les cellules immunitaires issues du sang15, tandis que d’autres ont analysé les ratios des cellules immunitaires dans des échantillons néonatals de sang total en utilisant la méthylation del’ADN 16,17. Bien que ces techniques aient été utiles pour apprendre les proportions des cellules immunitaires connues, il existe encore des limites dans notre capacité à obtenir des connaissances approfondies sur les cellules sans système multi-omique. Les NFS ne fournissent que des mesures larges des principaux groupes cellulaires sanguins, ce qui les rend utiles pour établir l’état immunitaire global en milieu clinique, mais limitées dans leur capacité à résoudre des sous-types ou états fonctionnels. Plus récemment, des études ont commencé à répondre à cette limitation en utilisant des modifications transcriptomiques et métabolomiques dérivées du plasma chez les nourrissons dès la première semaine devie 18. La protéomique basée sur la spectrométrie de masse a été adaptée pour étudier les profils immunitaires dans des échantillonsnéonataux 19. Cette approche est puissante pour mesurer une large gamme de protéines de manière impartiale et pour identifier des biomarqueurs potentiels. Cependant, les principales limites incluent la nécessité d’apporter des protéines relativement importantes et l’absence d’informations directes sur l’identité cellulaire, malgré la capture des protéines solubles et insolubles. Le test protéomique multiplex ciblé (TMPA) propose des alternatives aux échantillons à faible entrée. Ces méthodes utilisent une détection ciblée basée sur des anticorps, offrant un profilage à haute sensibilité pour les échantillons contenant un matériau limité. L’un d’eux, en particulier, a été utilisé pour suivre longitudinalement les trajectoires de développement immunitaire précoce20.

La cytométrie en flux permet une analyse quantitative des protéines des cellules immunitaires au niveau unicellulaire en faisant passer des cellules marquées fluorescentement à travers un faisceau laser focalisé et en mesurant la diffusion lumineuse et les signaux de fluorescence obtenus. Dans cette technique, des anticorps marqués par fluorescence se lient à des protéines spécifiques de surface ou intracellulaires. Cela permet la détection et la quantification simultanées de plusieurs sous-types de cellules immunitaires et de leurs caractéristiques définissantes en fonction de leurs profils de fluorescence. La cytométrie en flux spectral étend cette approche en capturant l’ensemble du spectre d’émission de chaque fluorochrome, permettant un démélange spectral précis et la détection simultanée de plus de 35 marqueurs dans un seul test21, 22, 23. Cela permet d’analyser beaucoup plus de marqueurs que les panneaux de cytométrie en flux conventionnels, qui sont limités à ~8-12 marqueurs. En complément de ces techniques cytométriques, le séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) a transformé les études immunologiques en permettant un profilage transcriptomique à haute résolution et impartial à partir d’un matériau d’entréeminimal 24. Malgré des coûts plus élevés et une dépendance à la viabilité cellulaire, scRNA-seq offre des perspectives inégalées sur l’hétérogénéité immunitaire en début de vie par rapport au séquençage en masse. Collectivement, ces avancées démontrent comment les innovations en collecte, préservation et analyse sont adaptées pour surmonter les défis uniques liés à l’étude de l’immunité fœtale et néonatale.

Ce protocole a été optimisé pour l’analyse des cellules immunitaires périphériques cryopréservées isolées par lyse en série des globules rouges. Les chercheurs devraient envisager ce protocole si leurs études nécessitent un profilage immunitaire à haute résolution à partir de petits volumes de sang (100-500 μL), surtout lorsque l’analyse longitudinale est cruciale. La méthode est largement applicable aux nouveau-nés à terme et prématurés et est compatible avec un large éventail d’analyses en amont, ce qui la rend adaptée à diverses questions de recherche en immunologie néonatale et pédiatrique.

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Protocole

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Un consentement parental éclairé et une pleine conformité aux réglementations éthiques nationales pertinentes ont été garantis conformément au Conseil d’éthique institutionnel (IRB) de l’Université Yale. Comme spécifié dans le protocole IRB approuvé, les parents ont été contactés par l’équipe de recherche durant la première semaine suivant la naissance de l’enfant pour obtenir le consentement avant l’inscription. Aucune procédure d’étude impliquant des matériaux d’origine humaine n’a été lancée avant l’approbation éthique documentée.

1. Collecte, traitement et stockage des échantillons (Figure 1)

  1. Prélèvement sanguin en hospitalisation
    1. Prélever et traiter les échantillons du nourrisson après leur réception, conserver à 4 °C, et traiter dans les 12 heures suivant la collecte.
    2. Prélever ~250 μL de sang total et les stocker dans un tube anticoagulant EDTA. Inversez le tube de collecte sanguine 8 fois pour mélanger l’anticoagulant.
    3. Procédez au traitement du sang entier par lyse du sang rouge comme décrit à la Section 1.3 (traitement des échantillons de sang entier).
    4. Pour collecter les taches de sang sec, utilisez la lancete stérile pour faire une perforation sur l’orteil/talon nettoyé.
      1. Sinon, pipettez ~25-30 μL de sang du tube EDTA sur le papier filtrant. Touchez légèrement le papier filtre à la goutte de sang.
    5. Remplissez au moins un cercle de sang qui coule librement, une goutte par cercle. Laissez sécher la tache de sang. Laissez le papier filtre ouvert jusqu’à ce que les taches de sang soient bien sèches.
    6. Étiquetez de manière appropriée l’heure de la collecte, la date de traitement, le moment précis et l’identification du spécimen.
    7. Placez-le dans un sac de rangement en plastique transparent à fermeture éclair. Conservez les cartes de taches sanguines à −20 °C ou −80 °C pour une stabilité prolongée jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’analyse protéomique.
  2. Prélèvement de sang ambulatoire
    REMARQUE : Avec l’approbation du Conseil d’examen institutionnel de l’Université Yale, les parents de participants ambulatoires ont eu la possibilité de prélever des échantillons sanguins à domicile à l’aide d’un dispositif d’auto-prélèvement par microaiguilles. Cet appareil obtient le sang capillaire par une lancette appliquée sur la peau. Les parents ayant choisi cette méthode ont reçu une formation en clinique à l’aide de kits de démonstration et ont ensuite reçu des instructions écrites détaillées ainsi que des kits de collecte à domicile.
    1. Lavez-vous les mains et portez des gants avant de les utiliser. Rassemblez tous les objets nécessaires, y compris un miroir si un seul parent effectue la prélèvement sanguin.
    2. Retirez l’appareil de la boîte à outils et détachez le bouchon d’un tube compatible.
    3. Appuyez sur le tube dans l’appareil jusqu’à ce qu’il soit bien serré avec les lignes de remplissage orientées vers l’extérieur.
    4. Retirez la couche du nourrisson et maintenez-le droit.
    5. Suivez les instructions de la bouillotte pour l’activer.
      REMARQUE : Si un sac n’est pas disponible, utilisez une autre méthode de réchauffement, comme une main.
    6. Maintenez la bouillotte sur le site (fesses) pendant 2 à 4 minutes pour la réchauffer et augmenter la circulation sanguine.
    7. Nettoyez la zone avec un tampon alcoolisé et laissez sécher.
    8. Retirez le couvercle transparent du bouton rouge. Détachez la languette de l’appareil et collez fermement la partie la plus complète des fesses du nourrisson tout en les tenant droits.
      REMARQUE : Ajustez leur posture au besoin pour garder le tube complètement vertical afin d’assurer une bonne prise de sang.
    9. Appuyez une fois sur le bouton jusqu’au fond puis relâchez. Réglez le minuteur à 5 minutes. Regardez le tube se remplir avec le miroir si besoin.
    10. Le sang peut ne pas apparaître pendant les 1 à 2 premières minutes. Retirez l’appareil après un maximum de 5 minutes au total ou plus tôt si le sang atteint la ligne indicatrice supérieure avant 5 minutes.
    11. Retirez le tube de l’appareil avec une légère torsion et tirez vers le bas. Fixez rapidement le bouchon complètement sur le tube. Inversez le tube au moins 10 fois, en veillant à ce que le sang touche le bouchon à chaque inversion pour éviter la coagulation.
    12. Expédiez les échantillons pendant la nuit après la collecte.
  3. Traitement des échantillons sanguins entiers
    1. Prélever des échantillons de sang dans un cabinet de sécurité biologique.
    2. Transférez soigneusement les 250 μL de sang dans un tube conique de 50 mL contenant 10 mL de tampon de lyse de globules rouges. Rincez le tube de collecte sanguine avec 10 mL de tampon de lyse des globules rouges jusqu’à ce qu’il soit vide. Laissez les cellules lyser à température ambiante (RT) pendant 15 minutes.
    3. Une fois la lyse terminée, ajoutez ~30 mL de PBS à la réception pour laver et centrifuger à 430 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Aspirez le surnageant sous vide, sans déranger la pellete.
    4. Continuez à transférer et rincer l’échantillon comme indiqué à l’étape 1.3.2 jusqu’à ce que la granule cellulaire apparaisse débarrassée de globules rouges visibles. Centrifugez à 430 × g pendant 5 minutes, puis retirez soigneusement le surnageant sans déranger la pellete.
    5. Pour chaque 250 μL de sang prélevé, il faut resuspendre le pellet cellulaire obtenu dans 2 mL de milieu de congélation (10 % de DMSO en FBS) et divisé en deux cryovials pour la conservation.
    6. Vérifiez la viabilité cellulaire en comptant les cellules resuspendues dans un milieu féébré avec un hémocytomètre en utilisant l’exclusion du bleu de trypan.
    7. Transférez 1 mL de l’étape 1.3.5 à chaque cryovial. Étiquetez de manière appropriée avec l’heure de collecte, la date de traitement, le moment précis et l’identification du spécimen.
    8. Conservez le cryovial à un niveau intermédiaire à -80 °C dans un récipient congelant contenant de l’isopropanol. Après 24 heures, transférez le(s) cryovial(s) en azote liquide jusqu’à ce qu’il soit prêt pour analyse.

2. TMPA à partir de taches de sang séché (DBS) (Figure 2)

  1. Le jour du traitement, apportez le papier filtre à la radio radiophonique. À l’aide d’une perforatrice métallique de 3 mm, percez 2 à 3 cercles dans le papier filtrant où le sang est passé, aussi centralement que possible sur la zone de sang.
  2. Prenez chaque punch de 3 mm avec une pince et ajoutez-le à un puits d’une plaque à 96 puits ou d’un tube PCR à faible liaison contenant 20 μL de tampon d’élution (1x PBS, 1x inhibiteur de protéase, 0,05 % Tween 20). Assurez-vous que le punch est couvert par un tampon d’élution.
  3. Fermez les tubes ou couvrez la plaque avec une jupe en plastique, et placez-les sur un vortex numérique tournant à 600 tr/min pendant 60 minutes en temps de réflexe.
  4. À la fin de l’incubation, transférez soigneusement l’éluat vers un nouveau tube à faible liaison ou une plaque à 96 puits. Jetez les tubes ou la plaque avec les perforateurs filtrants.
  5. Quantifiez la teneur en protéines à l’aide d’un test BCA.
    1. Prenez 2 μL de chaque échantillon ou de la norme BSA pour obtenir des dilutions sérieuses de 1:10 et 1:100 dans l’eau. Préparez les échantillons et étalons en double en ajoutant 15 μL d’échantillons dilués ou étalonnés à 200 μL de solution de travail 1x. Incubez les échantillons pendant 30 minutes à 37 °C.
    2. Lisez le signal à 562 nm sur un lecteur de plaques. Calculer la concentration finale de protéines en fonction de la pente standard de la BSA et du fond tampon d’élution.
  6. Fabriquez des aliquotes de 30 μL pour des échantillons à 0,5-1 mg/mL dans des microtubes à faible liaison de 1,5 mL à bouchon vissé. Congelez les échantillons à -80 °C pour une soumission ultérieure afin d’être traités par service TMPA.

3. Cytométrie de flux spectral du sang lysé par les globules rouges (Figure 3)

  1. Le jour de l’expérience, décongelez rapidement un flacon de cellules lysées par globules rouges dans un bain-marie à 37 °C jusqu’à ce qu’il ne reste qu’une petite goutte de glace.
  2. Ajoutez la suspension cellulaire à un tube conique de 15 mL contenant 10 mL de RPMI complet préchauffé (37 °C) (préparé avec 500 mL de RPMI 1640, 50 mL de FBS, 5,6 mL de pénicilline-streptomycine et 5,6 mL de supplément de glutamine). Centrifugez à 400 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
  3. Resuspendez doucement le pellet dans 3 mL de RPMI complet et déterminez le nombre de cellules selon une méthode appropriée.
  4. Faites tourner les cellules en suspension à 400 × g pendant 5 minutes à température ambiante. Aspirez et jetez le surnageant.
  5. Ajustez la concentration cellulaire à 1 × 106 cellules/mL en RPMI complet. Distribuez 100 μL par puits (0,1 × 10⁶ cellules) dans une plaque à fond en V à 96 puits. Centrifugez à 764 × g pendant 2 minutes à 4 °C et retirez le surnageant.
  6. Ajoutez 100 μL de stock de colorant Live/Dead dans PBS à une dilution 1:2 000 avec le bloc Fc et le bloc monocyte (dilution 1:100) à tous les échantillons, sauf le témoin non coloré. Incubez pendant 15 minutes à 4 °C.
  7. Laver avec 100 μL de PBS et centrifuger à 764 × g pendant 2 minutes à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant.
    REMARQUE : Il est impératif d’utiliser le bloc Fc et le bloc monocytaire pour empêcher toute liaison non spécifique des anticorps.
  8. Ajoutez 100 μL du cocktail de surface dilué (dilution 1:200) dans un tampon FACS (500 mL de PBS, 2,5 g d’albumine sérique bovine (BSA), 2 mM d’EDTA, pH 8,5) à tous les échantillons, sauf le témoin non coloré. Incubez pendant 30 minutes à 4 °C.
  9. Laver avec 100 μL de tampon FACS et centrifuger à 764 × g pendant 2 minutes à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant.
  10. Fixez les cellules en ajoutant 100 μL de paraformodéhyde à 4 % à chaque échantillon. Incuber pendant 15 minutes en temps de réanimation dans le noir.
  11. Laver avec 100 μL de tampon FACS, centrifuger à 764 × g pendant 2 minutes à 4°C, puis resuspendre dans 200 μL de tampon FACS.
  12. Préparez des billes ultra-comp comme des commandes monocolore. Colorez les billes de contrôle monocolore en utilisant le même protocole que les échantillons, y compris la fixation si les échantillons étaient fixes.
  13. Préparez les contrôles fluorescents moins un (FMO) en utilisant la même procédure que pour les échantillons.
    REMARQUE : Il est important de traiter les contrôles monochrome et les FMO de la même manière que les échantillons. Par exemple, si les échantillons sont fixés après la coloration, les FMO et les contrôles monocouleur devraient également être fixés.
  14. Exécutez les échantillons, les contrôles monocolore, les contrôles non colorés et les contrôles FMO sur un cytomètre à flux conventionnel/spectral. Analysez les données à l’aide d’un logiciel.
  15. Définir les portes en fonction des contrôles d’isotype et de FMO appropriés. Premièrement, les cellules de porte sélectionnent la population leucocytaire en utilisant le graphique diffusion avant (FSC) versus dispersion latérale (SSC), ce qui aide à exclure les débris et à sélectionner les cellules selon leur taille et leur granularité.
  16. Après la sélection des leucocytes, les cellules de grille pour exclure les doublets en utilisant un graphique de la zone de diffusion avant (FSC-A) par rapport à la hauteur de diffusion avant (FSC-H).
    REMARQUE : Cela garantit la sélection des cellules individuelles (singlets), celles situées le long de la diagonale étant considérées comme des singlets, tandis que les doublets et amas sont exclus.
  17. Des cellules de grille pour la viabilité en utilisant un colorant de viabilité pour exclure les cellules mortes, garantissant que l’analyse ultérieure ne concerne que les cellules vivantes.
  18. Après ces premières étapes de gating, verrouillez davantage les cellules uniques vivantes pour des marqueurs spécifiques de lignée afin de sous-catégoriser différentes populations de cellules immunitaires. Divisez les cellules uniques vivantes en cellules myéloïdes CD33+ et lymphocytes CD33- en fonction de l’expression de CD33.
  19. Au sein de la population de CD33+ , différenciez les monocytes CD14+ et identifiez les cellules dendritiques CD11c+ (DC) comme des cellules exprimant CD11c mais pas CD14.
  20. Au sein de la population lymphocytaire CD33, les cellules T et sous-grilles CD3+ permettent d’identifier les sous-ensembles de cellules T CD4+ et CD8+ .
  21. De plus, identifier les cellules naturelles (NK) CD56+ par l’expression de CD56, et les cellules B CD19+ par l’expression de CD19.

4. scRNA-seq du sang lysé par les globules rouges (Figure 4)

  1. Dégelez un flacon de cellules lysées à globules rouges cryopréservés dans un bain-marie à 37 °C. Ajoutez l’échantillon à 10 mL de milieu à cellules T dans un tube conique de 15 mL. Centrifugez à 430 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
  2. Ajoutez encore 10 mL de 1x PBS à l’échantillon. Centrifugez à 430 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Jetez le surnageant.
  3. Comptez les cellules et évaluez la viabilité avec le bleu de trypan. Si la viabilité est inférieure à 70 %, procédez à l’élimination des cellules mortes avec le kit d’élimination des cellules mortes.
    1. Retrait des cellules mortes
      1. Diluez le tampon de liaison 20x à l’aide d’eau stérile double distillée pour obtenir une solution de travail 1x.
      2. Suspendez la pellete cellulaire dans 100 μL de microperles pour retirer les cellules mortes par 1 × 107 cellules au total. Mélangez soigneusement et faites éclore pendant 15 minutes à température ambiante (RT).
      3. Insérez la colonne de séparation magnétique dans le support magnétique approprié. Rincez la colonne avec 500 μL de tampon de liaison 1x pour équilibrer avant utilisation.
      4. Amenez le volume de la cellule à 500 μL avec un tampon de liaison 1x. Appliquez la suspension à cellules sur la colonne et collectez le flux dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL.
      5. Laver 2 fois avec 500 μL de tampon de liaison. Collectez le flux dans le même tube de microcentrifuge.
      6. Centrifugez l’éluat à 300 × g pendant 10 minutes. Jetez le surnageant.
    2. Comptez les cellules et évaluez leur viabilité avec le bleu de trypan.
    3. Resuspendez 20 000 cellules viables dans 40 μL de PBS avec 0,04 % de BSA dans un nouveau tube microcentrifuge de 1,7 mL.
    4. Envoyez immédiatement les cellules sur glace dans une installation centrale génomique pour la génération et le séquençage de la bibliothèque. Collectez les résultats de séquençage au format des sorties Cell Ranger.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons collecté des cartes DBS de 10 nourrissons extrêmement prématurés à trois moments : 1 semaine (n = 12), 1 mois (n = 7) et 2 mois (n = 3) pour l’analyse protéomique de laTMPA 6 (Figure 2A). Ces échantillons ont été analysés en même temps que le sang de cordon infantile à terme (TCB ; n = 4) et le sang adulte sain (AB ; n = 5). L’expression protéique normalisée (NPX) de 92 protéines liées au système immunitaire a été quantifié...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Obtenir des données immunologiques de haute qualité à partir de volumes minimes de sang néonatal et infantile nécessite des adaptations méthodologiques sur plusieurs étapes. Dans ce protocole, nous décrivons quatre stratégies complémentaires : (i) la collecte optimale du sang et la cryopréservation pour préserver les cellules viables en vue d’un usage en aval, (ii) l’application de la cytométrie à flux spectral pour l’immunophénotypage multiparamétrique, (iii) scRNA-seq pour résoudre l’h...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions les installations principales suivantes à Yale : cœur de cytométrie en flux de Yale ; Centre Yale d’Analyse du Génome. Nous remercions le Centre de Yale pour l’Investigation Clinique, le Bureau de Yale pour le Développement des Médecins-Scientifiques et des Scientifiques, ainsi que le Programme de Développement des Chercheurs en Soins Intensifs et Traumatismes Pédiatriques/NICHD. Des études de respirométrie ont été réalisées par le Chemical Metabolism Core de l’Université Yale. Ce travail a été financé par des subventions à : P01 AI179570 (L.K.), R01AI171980 (L.K.), R01DK129552 (L.K.), R01HL163043 (L.K.), Cystic Fibrosis Foundation (L.K.) ; K08 AI177743 (N.N.B.), PRIX Hartwell (N.N.B.) ; K08DK133687 (O.O.), École de médecine de Yale, Département de pédiatrie (O.O.) ; R01AI123204 (C.R.O). Le contenu relève uniquement de la responsabilité des auteurs et ne reflète pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. La Figure 1 a été créée dans BioRender. Gawon, K. (2025) https://BioRender.com/7embw10.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,5 M EDTA, pH 8,0Thermo Fisher Scientific & nbsp ;15575-038  ;
1x tampon de lyse des globules rouges   ;Invitrogen  ;3177165  ;
Kit de test protéique BCA & nbsp ;Abcam  ;ab287853  ;
BD Microtainer MAP MicrotubeFisher Scientific & nbsp ;22-253-270
Bel-Art Cryo-Safe -1° ; C Contrôleur de gel   ;Millipore Sigma & nbsp ;41122800  ;
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-Aldrich & nbsp ;A9647-100G  ;
Brilliant Ultra Violet 496 Anti-Humain CD3  ;Thermo Fisher Scientific & nbsp ;364-0038-42  ;
Brilliant Ultra Violet 661 anti-humain CD11c  ;BD BioSciences  ;612968  ;
Brilliant Vil750 Anti-Humain CD14  ;BioLegend  ;367135  ;
Brilliant Violet 570 Anti-Humain CD8a & nbsp ;BioLegend  ;301038  ;
Brilliant Violet 711 Anti-Human CD56  ;BioLegend  ;318336  ;
cOmplete, Mini, cocktail inhibiteur de protéase sans EDTAMillipore Sigma & nbsp ;11836170001  ;
Kit d’enlèvement des cellules mortes   ;Miltenyi Biotec  ;130-090-101  ;
Diméthyl Sulfoxyde (DMSO)  ;Thermo Fisher Scientific & nbsp ;BP231-100  ;
Dulbecco » s Solution physiologique tamponnée phosphate (DPBS), sans calcium, sans magnésium & nbsp ;Thermo Fisher Scientific & nbsp ;14190144  ;
Sérum fœtal-bovin (FBS) & nbsp ;Gibco & nbsp ;A5256801  ;
Mixer Digital Vortex Fisherbrand & nbsp ;Thermo Fisher Scientific & nbsp ;02215418  ;
Tampon de fixation   ;BioLegend  ;420801  ;
Supplément GlutaMAXGibco & nbsp ;35050061  ;
MACS MultiStand  ;Miltenyi Biotec  ;130-042-303  ;
Colonnes MS  ;Miltenyi Biotec  ;130-042-201  ;
NomEntrepriseNuméro de catalogue
OctoMACS Séparateur  ;Miltenyi Biotec  ;130-042-109  ;
Bleu Pacifique Anti-Humain CD4 & nbsp ;BioLegend  ;344619  ;
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)Thermo Fisher Scientific & nbsp ;15140-122  ;
RB780 Anti-Humain CD33  ;BD en biosciences & nbsp ;755606  ;
Rierdge 3mm Metal Puncher   ;Rierdge  ;SDD231031pc-01&NBSP ;
RPMI 1640 MoyenGibco & nbsp ;11875-093  ;
Spark UV 387 Anti-Human CD19  ;BioLegend  ;302289  ;
Tasso Collection KitsTasso & nbsp ;N/A
Micro-tubes à bouchon à vis Thermo ScientificThermo Fisher Scientific & nbsp ;14-755-287  ;
Whatman 309 ProteinsaverCytiva  ;41111700  ;
Kit de viabilité réparable Zombie NIR   ;BioLegend  ;423105  ;
< fort >logiciel et paquets
Adobe Illustrator2024
bbknn1.5.1
FlowJo10.8.1
GraphPad Prism9.4.0
NomVersion
Scanpy1.9.1
Srublet0.2.3
Essais commerciaux
Chromium Single Cell 5' ÉquipementGénomique 10XPN-1000263
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Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kollmann, T. R., Kampmann, B., Mazmanian, S. K., Marchant, A., Levy, O. Protecting the newborn and young infant from infectious diseases: lessons from immune ontogeny. Immunity. 46 (3), 350-363 (2017).
  2. Jain, N. The early-life education of the immune system: moms, microbes and (missed) opportunities. Gut Microbes. 12 (1), 1824564(2020).
  3. Konnikova, L., et al. Fetal and neonatal T cell immunity: unique features and challenges. Front Immunol. 11, 594939(2020).
  4. Pieren, D. K. J., Boer, M. C., De Wit, J. The adaptive immune system in early life: the shift makes it count. Front Immunol. 13, 1031924(2022).
  5. Brodsky, N. N., et al. Early-life human CD8+ T cells exhibit rapid, short-lived effector responses and a unique transcription factor landscape. Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (31), e2421106122(2025).
  6. Olaloye, O., et al. A single-cell atlas of circulating immune cells over the first 2 months of age in extremely premature infants. Sci Transl Med. 17, eadr0942(2025).
  7. Watson, N. B., et al. The gene regulatory basis of bystander activation in CD8+ T cells. Sci Immunol. 9 (92), eadf8776(2024).
  8. Maymí, V. I., et al. Neonatal CD8+ T cells resist exhaustion during chronic infection. J Immunol. 212 (5), 834-843 (2024).
  9. Kandasamy, R., Kollmann, T. R. Challenges in neonatal immunology. Front Immunol. 8, 1756(2017).
  10. Howie, S. R. Blood sample volumes in child health research: review of safe limits. Bull World Health Organ. 89 (1), 46-53 (2011).
  11. Gross, R., et al. Researching COVID to enhance recovery (RECOVER) pediatric study protocol: rationale, objectives and design. medRxiv. , (2023).
  12. Bourguignon, P., et al. Processing of blood samples influences PBMC viability and outcome of cell-mediated immune responses in antiretroviral therapy-naïve HIV-1-infected patients. J Immunol Methods. 414, 1-10 (2014).
  13. Urbansky, A., et al. Rapid and effective enrichment of mononuclear cells from blood using acoustophoresis. Sci Rep. 7 (1), 17161(2017).
  14. Najar, M., et al. Proliferative and phenotypical characteristics of human adipose tissue-derived stem cells: comparison of purification methods. Cytotherapy. 16 (9), 1220-1228 (2014).
  15. Abebe, D. Diagnostic significance of complete blood cell count and hemogram-derived markers for neonatal sepsis. World J Clin Pediatr. 13 (2), 1-13 (2024).
  16. Martino, D., et al. DNA methylation signatures underpinning blood neutrophil to lymphocyte ratio during first week of human life. Nat Commun. 15, 8157(2024).
  17. Jones, M. J., et al. DNA methylation differences between cord and adult white blood cells reflect postnatal immune cell maturation. Commun Biol. 8, 237(2025).
  18. Lee, A. H., et al. Dynamic molecular changes during the first week of human life follow a robust developmental trajectory. Nat Commun. 10, 1092(2019).
  19. Mithal, L. B., et al. Evolution of the umbilical cord blood proteome across gestational development. Sci Rep. 15 (1), 2233(2025).
  20. Olin, A., et al. Stereotypic immune system development in newborn children. Cell. 174 (5), 1277-1292.e14 (2018).
  21. Spasic, M., et al. Spectral flow cytometry methods and pipelines for comprehensive immunoprofiling. Cancer Res Commun. 4 (3), 895-910 (2024).
  22. Park, L. M., Lannigan, J., Jaimes, M. C. OMIP-069: forty-color full spectrum flow cytometry panel. Cytometry A. 97 (10), 1044-1051 (2020).
  23. Sahir, F., et al. Development of a 43-color panel for comprehensive immune cell characterization. Cytometry A. , (2020).
  24. Tang, F., et al. mRNA-seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nat Methods. 6, 377-382 (2009).
  25. Wolf, F. A., Angerer, P., Theis, F. J. SCANPY: large-scale single-cell gene expression data analysis. Genome Biol. 19, 15(2018).
  26. Wolock, S. L., Lopez, R., Klein, A. M. Scrublet: computational identification of cell doublets. Cell Syst. 8 (4), 281-291.e9 (2019).
  27. Polanski, K., et al. BBKNN: fast batch alignment of single-cell transcriptomes. Bioinformatics. 36 (3), 964-965 (2020).
  28. Li, Y., et al. DMSO-free cryopreservation improves recovery and function of human T and NK cells. Cell Transplant. 31, 1-12 (2022).
  29. Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
  30. Wohnhaas, C., et al. RNA integrity in cryopreserved immune cells enables robust single-cell transcriptomics. Front Immunol. 10, 204(2019).
  31. Daae, L. N. W., et al. Comparison of haematological parameters in capillary and venous blood samples from hospitalized children. Scand J Clin Lab Invest. 51 (7), 651-654 (1991).
  32. Meites, S. Skin-puncture and blood-collecting technique for infants. Clin Chem. 34 (9), 1890-1894 (1988).
  33. Grüner, N., Stambouli, O., Ross, R. S. Dried blood spots: preparing and processing. J Vis Exp. (97), e52619(2015).
  34. Waaijer, L. A., et al. Spectral flow cytometry panel for comprehensive immunophenotyping. Cytometry A. 107 (4), 226-232 (2025).
  35. Thieme-Ehlert, M. T., et al. OMIP-114: a 36-color spectral flow cytometry panel. Cytometry A. 107 (6), 364-371 (2025).
  36. Yamawaki, T. M., et al. Systematic comparison of high-throughput single-cell RNA-seq methods. BMC Genomics. 22, 66(2021).
  37. Stoeckius, M., et al. Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods. 14 (9), 865-868 (2017).
  38. Grandi, F. C., et al. Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq. Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).
  39. Kim, N., et al. Perspectives on single-nucleus RNA sequencing. J Pathol Transl Med. 57 (1), 52-59 (2023).

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