Implantation de tumeurs intratramères comme modèle robuste pour les études d’immunothérapie intratumorale du cancer de murine

Résumé

Avec l’intérêt croissant pour l’immunothérapie intratumorale, il est essentiel de sélectionner des modèles tumoraux accessibles et pratiques. Les tumeurs sous-cutanées sont faciles à établir mais difficiles à visualiser et à manipuler. Dans ce protocole, nous décrivons des méthodes pour générer des tumeurs intrardermiques qui offrent une meilleure visibilité et accessibilité.

Résumé

Établir des modèles de tumeurs murines reproductibles est essentiel pour évaluer la biologie du cancer et les stratégies d’immunothérapie. L’immunothérapie intratumorale traite les tumeurs établies avec des réactifs immunostimulants afin d’inverser la suppression immunitaire locale et de stimuler l’immunité antitumorale systémique. La plupart des études sur le cancer chez la souris établissent les tumeurs dans l’espace sous-cutané, ce qui présente des défis inhérents à l’immunothérapie intratumorale expérimentale en raison de l’incapacité à visualiser les injections intratumorales. L’injection intradérienne de cellules tumorales offre une approche fiable pour générer des tumeurs visualisées qui soutiennent une injection intratumorale précise et reproductible ainsi qu’un suivi de la cinétique de croissance et des réponses thérapeutiques. Ici, nous présentons une méthodologie reproductible pour établir et traiter les tumeurs intradériques en utilisant le modèle de mélanome murin B16F10 chez des souris C57BL/6 comme exemple. Les suspensions de cellules tumorales sont injectées par voie intradermique, et 7 à 10 jours après l’implantation tumorale, une fois que les tumeurs atteignent ~60 mm³, une injection intratumorale d’agents immunostimulants ou un traitement physique comme l’électroporation ou le chauffage peut être appliquée directement. Cela permet une administration précise des traitements et une mesure de la croissance tumorale avec un pied à coulisse, évitant ainsi le défi de la variabilité inhérente à plusieurs traitements de tumeurs sous-cutanées qui ne peuvent pas être visualisées. En fournissant des analyses détaillées de cette technique, cet article vise à soutenir la reproductibilité et à faire progresser la recherche préclinique en immunothérapie intratumorale.

Introduction

Les modèles de tumeurs murines constituent un outil indispensable dans la recherche sur le cancer. Dans un modèle murin optimal, il serait possible d’induire des tumeurs qui imitent étroitement les tumeurs humaines aux niveaux génétique et^{morphologique 1}. Cela permet l’évaluation et l’efficacité de nouvelles approches thérapeutiques dans différents domaines, y compris l’immunothérapie intratumorale (ITIT). L’ITIT est un domaine émergent dans le traitement du cancer qui consiste à administrer directement des agents immunostimulants dans le microenvironnement tumoral (TME). Cette délivrance localisée peut renforcer l’activation immunitaire locale, inverser le microenvironnement tumoral immunosuppresseur et déclencher des réponses immunitaires antitumorales systémiques, connues sous le nom d’effet^{abscopal 2}. Cependant, l’efficacité, la précision et la constance de l’administration intratumorale dépendent de la capacité à visualiser et contrôler les paramètres d’injection dans différents modèles tumoraux.

La plupart des études précliniques sur le cancer utilisent l’implantation de tumeurs sous-cutanées. Cependant, cette approche présente des limites pour les thérapies intratumorales car la tumeur ne peut pas être visualisée directement lors de l’injection à moins qu’une chirurgie ne soit réalisée. De nombreuses stratégies d’immunothérapie intratumorale nécessitent une administration précise de réactifs dans de petites tumeurs de souris et impliquent souvent d’accomplir cette tâche plusieurs fois. Sans confirmation visuelle, la précision de l’injection et la rétention des réactifs dans les tumeurs sous-cutanées deviennent des variables mal contrôlées. Cela pourrait entraîner une mauvaise interprétation ou une variation des données^{expérimentales 3}.

L’implantation tumorale intradermique offre une alternative directe, accessible, visualisable et reproductible pour l’observation, la mesure et l’injection intratumorale, améliorant ainsi la cohérence. De plus, des études ont montré que les tumeurs implantées par voie intradermique, par opposition aux injections sous-cutanées, augmentent l’immunogénicité et suppriment la tumorigénicité des cellules^{tumorales 4}. Les tumeurs injectées par voie intradermique ont induit un trafic cellulaire dendritique rapide et fort vers les ganglions lymphatiques, entraînant une activation plus précoce et plus robuste des lymphocytes T cytotoxiques^{spécifiques à la tumeur.} La présente étude décrit un protocole détaillé et reproductible pour établir les tumeurs de mélanome intradermique B16F10 chez des souris C57BL/6 et réaliser les traitements intratumoraux ultérieurs.

Protocole

Toutes les procédures ont été menées avec l’approbation et en conformité avec les directives du Comité de soins et d’utilisation des animaux^{institutionnels (IACUC) 5}. Toutes les procédures animales ont été réalisées dans l’établissement vétérinaire de Dartmouth. Les femelles C57BL/6 souris, âgées de 6 à 8 semaines, étaient hébergées dans des conditions normales sur des supports ventilés avec nourriture et eau. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Rasage des souris

REMARQUE : Tout le personnel doit suivre une formation institutionnelle en manipulation d’animaux vivants et en anesthésie avant d’effectuer ces procédures.

1. Avant l’injection intradértive, raser le flanc de chaque souris comme décrit ci-dessous ; Le flanc droit était utilisé pour les injections et les procédures décrites. Rasez les souris la veille de l’injection des cellules tumorales.
2. Placez la souris sur une surface stable. Saisir la souris par la peau de la nuque avec le pouce et l’index gauches, puis rentrer doucement le côté gauche du corps dans la paume pour exposer le côté droit. Utilisez l’annulaire et/ou l’auriculaire pour tenir la jambe et la queue gauches, afin de vous assurer que le flanc droit est complètement exposé.
3. Rase le poil de la patte arrière jusqu’aux côtes inférieures pour créer une zone dégagée pour l’injection.
4. Les deux flancs peuvent être rasés si un espace d’entraînement supplémentaire est nécessaire.
   REMARQUE : Les débutants peuvent anesthésier les souris lorsqu’ils apprennent à se raser et à bien se raser.

2. Pratiquer les injections avec un colorant

REMARQUE : La pratique peut être réalisée aussi bien sur des souris vivantes (anesthésiées) que sur des souris euthanasiées, et sur n’importe quel sexe. Les souris mâles ont généralement une peau plus épaisse et moins souple que les femelles, ce qui rend la procédure plus techniquement complexe. Pour cette raison, s’entraîner sur des hommes est utile pour développer la maîtrise.

1. Mélangez du colorant alimentaire avec du sérum physiologique tamponné phosphate (PBS) dans un tube Eppendorf de 1,5 mL jusqu’à ce que la solution paraîte foncée (un colorant alimentaire bleu a été utilisé dans cette étude).
2. Obtenez des souris d’entraînement et anesthésiez-les selon les directives institutionnelles de soins aux animaux.
3. Placez la souris anesthésiée sous un cône de nez et inclinez le corps pour exposer le flanc droit. Confirmez une anesthésie adéquate en pinçant doucement le coussin des pieds et en observant qu’il n’y a aucune réponse.
4. Chargez 30 μL de solution de colorant dans une seringue d’insuline de 0,3 mL avec une aiguille de 29 G, 1/2". Enlève toutes les bulles d’air.
5. Avec la main non dominante, pincez doucement et étirez la jambe/la peau pour créer une surface lisse et tendue (évitez de soulever la peau vers le haut). Insérez l’aiguille en biseau vers le haut dans le derme à un angle parallèle peu profond par rapport à la peau. Gardez l’aiguille visible sous la surface pour confirmer la position dermique.
   REMARQUE : Pendant la pratique, testez différentes positions de prise pour maintenir une tension cutanée stable tout en gardant les doigts hors du chemin de l’aiguille. Insérez l’aiguille ~2 mm dans la peau. Pour réduire le reflux, insérez l’aiguille à ~3 mm, puis retirez légèrement pour créer une « poche » avant l’injection. Cela aide à retenir le colorant au site d’injection.
6. Injectez lentement les 30 μL de la solution de colorant jusqu’à ce qu’une petite « bulle » distincte se forme sous la surface de la peau
   REMARQUE : L’absence de bulles visibles suggère que l’injection a été administrée par voie sous-cutanée plutôt qu’intradermique. Maintenir le biseau en position relevée permet d’assurer un placement dermique précis et évite une injection trop profonde.
7. Continuez à vous entraîner jusqu’à former régulièrement des bulles intradériques. Jusqu’à six à huit injections peuvent être effectuées de chaque côté.
8. Après avoir effectué les injections d’entraînement, euthanasiez les souris conformément aux protocoles approuvés du Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels (IACUC^{) 5}.

3. Préparation des cellules tumorales pour injection

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes liées aux cellules dans une cagoule stérile. Gardez à l’esprit que différentes lignées de tumeurs murines croissent différemment.

1. Dégel des cellules tumorales (B16F10 utilisée dans cette étude) quelques jours avant les injections intrardermiques.
2. Cultivez les cellules jusqu’à une confluence de 70 % à 80 % tout en maintenant un milieu frais adéquat
   REMARQUE : Évitez la confluence à 100 %, qui freine la prolifération et nuit à la croissance tumorale.
3. Prélever et préparer les cellules à 7 x 10⁶ cellules/mL dans soit 1x PBS, RPMI sans sérum, ou d’autres milieux utilisés pour la croissance des cellules.
   REMARQUE : Le modèle tumoral B16F10 utilisé en laboratoire utilise 2 x 10^{cellules 5} en 30 μL. Le volume d’injection de 30 μL est approprié, mais le nombre de cellules peut être ajusté selon les besoins pour établir le modèle tumoral souhaité. Les cellules se déposent et s’accumulent au fond du tube, donc pour garantir la constante concentration des cellules, mélangez périodiquement doucement les cellules pour les maintenir en suspension.
4. Gardez les cellules sur la glace après le traitement et procédez rapidement à l’injection. Un stockage prolongé sur la glace réduit la viabilité cellulaire, ce qui peut diminuer le nombre de cellules vivantes délivrées et avoir un impact négatif sur l’établissement de^{la tumeur 6}.
   REMARQUE : Les cellules sont prélevées et utilisées immédiatement en laboratoire. Les injections sont effectuées dans les 20 à 60 minutes suivant le traitement des cellules et leur mise au froid. Utilisez un partenaire lorsque vous travaillez avec de grandes cohortes pour minimiser le temps passé sur la glace.

4. Injections intratraderiques

1. Anesthésiez des souris expérimentales.
   REMARQUE : L’anesthésie avec du gaz isoflurane est utilisée par le laboratoire, mais des anesthésiques injectables peuvent être utilisés.
2. Après l’induction de l’anesthésie, placez la souris sous un cône de nez et positionnez le corps pour exposer complètement le flanc droit.
3. Inversez doucement la suspension de la cellule pour assurer un mélange uniforme.
4. Aspirez 30 μL de suspension à cellules dans une seringue de 0,3 mL avec une aiguille de 29 G, 1/2". Enlève les bulles d’air.
5. Avec la main non dominante, étire doucement la jambe/la peau sur le côté pour la rendre lisse et serrée (ne la soulevez pas vers le haut). Insérez l’aiguille en biseau vers le haut dans le derme à un angle parallèle faible. L’aiguille doit rester visible sous la peau, montrant qu’elle n’est pas trop profonde.
   REMARQUE : La profondeur de l’aiguille doit être de ~2 mm dans la peau. Pour éviter le reflux des cellules, insérez l’aiguille à ~3 mm dans la peau, tirez légèrement l’aiguille vers l’arrière pour créer une « poche » dans laquelle les cellules seront injectées. Cela réduit considérablement le reflux.
6. Injectez très lentement les 30 μL de suspension cellulaire jusqu’à ce qu’une petite « bulle » visible se forme sous la peau. Attendez 5 à 10 secondes avant de retirer l’aiguille.
   REMARQUE : Retirer l’aiguille trop rapidement peut provoquer la sortie de la solution de la peau à cause de la pression.
7. Répétez pour chaque souris. Remplacez les seringues après chaque cage (4 à 5 souris) pour éviter que l’aiguille ne s’émousse.
8. Surveillez toutes les souris jusqu’à ce qu’elles soient complètement rétablies de l’anesthésie.
9. Surveillez les souris pour l’établissement de tumeurs.

5. Injections intratumorales

REMARQUE : Les tumeurs sont généralement prêtes à être traitées 7 à 10 jours après l’implantation, une fois qu’elles atteignent la taille appropriée. La taille appropriée utilisée en laboratoire est de ~50^{mm 3} ou plus selon la formule : Volume = (Longueur/2) * (Largeur*Largeur)^7,8.

1. Préparez toutes les solutions thérapeutiques à l’avance (par exemple, 1x PBS a été utilisé dans cette étude). Conservez les solutions sur la glace ou à température ambiante selon le traitement spécifique.
2. Induire l’anesthésie selon les directives institutionnelles.
3. Placez la souris sous un cône de nez pour maintenir l’anesthésie, puis positionnez-la de façon à exposer la tumeur.
4. Aspirez le volume requis (par exemple, 30 μL utilisé ici) dans une seringue d’insuline de 0,3 mL avec une aiguille de 29 G, 1/2". Enlève les bulles d’air.
   REMARQUE : Le volume variera selon le traitement choisi et les conditions optimisées.
5. Insérez l’aiguille horizontalement dans la tumeur et avancez vers le centre de la masse tumorale.
   REMARQUE : Évitez d’insérer par le dessus ou à un angle prononcé, car cela peut entraîner une injection trop profonde ou dans les tissus environnants. Le traitement décrit a été administré sous forme d’une injection unique. Les doses et la fréquence dépendent toutes du traitement choisi et des conditions optimisées. Pour les petites tumeurs, une seule dose suffit pour distribuer le traitement, mais pour les tumeurs plus grandes, plusieurs injections peuvent être nécessaires pour répartir le traitement également dans la masse tumorale.
6. Injectez le traitement lentement et sûrement. Faites une pause de 10 secondes avant de retirer lentement l’aiguille pour minimiser le reflux ou la fuite. Certaines tumeurs présentent une pression interne élevée, et il convient de veiller à ce que l’injection ne s’échappe pas par le trou de l’aiguille.
7. Répétez la procédure pour chaque souris. Remplacez les seringues après chaque cage de 4 à 5 souris et lors du changement de groupe de traitement afin d’éviter la contamination croisée.
8. Surveillez les souris après l’anesthésie jusqu’à ce qu’elles retrouvent mobilité et respiration normale. Continuez à surveiller quotidiennement la réponse au traitement et la santé globale.
   REMARQUE : Gardez à l’esprit que différentes lignées cellulaires peuvent provoquer des ulcères dans les tumeurs à différents moments. Chaque expérience et chaque protocole IACUC ont des critères d’évaluation et d’exclusion clairement définis. En laboratoire, les critères d’évaluation pour les expériences sur la souris sont de 1500^{mm 3} et les ulcères survenant sont acceptés et non exclus de l’étude.

Résultats

Lors de la pratique des injections avec un colorant, une délivrance intradérmique réussie peut être vérifiée sans euthanasie de la souris en observant la formation d’une « bulle » visible au site d’injection. Une injection intradérmère correctement réalisée produit une grande « bulle » bien définie et surélevée (Figure 1A–F). De petites bulles ou des bulles plates suggèrent que l’injection peut être partiellement sous-cutanée. Si aucune « bu...

Discussion

Le succès de ce protocole (Figure 4) dépend du maintien d’une profondeur d’injection intradermique constante et d’un placement précis des aiguilles pour assurer la délivrance dans le derme plutôt que dans la couche sous-cutanée. Si l’angle de l’aiguille est trop prononcé ou si la pression d’injection est trop élevée, le colorant ou les cellules tumorales peuvent être déposés à travers la peau dans l’espace sous-cutané. Après l’injection, faire une courte pau...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1.5 mL Natural Centrifuge Tube	USA Scientific	1615-5500
150 cm2 Cell Culture Flask	Corning	430825
Fluriso	Vet One	13985-528-60	isoflurane
Food Coloring	Durkee		pour la pratique
Insulin syringe 0.33 x 12.7 mm	Exel	26018
Mini Arco	Wahl	08787-450A	tondeuses pour raser les souris
PBS, 1X w/o calcium & magnesium	Corning	06325002	pH 7.4 +/- 0.1
RPMI 1640, 1x	Corning	12225004
SomnoFlo Low-Flow Electronic Vaporizer	Kent Scientific	SF-01	machine d'anesthésie