Article de méthode

Une technique pour stabiliser les protéines membranaires dans les nanodisques

DOI :

10.3791/70283

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30 avril 2026

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1College of Biology, Hunan University, 2State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources, College of Life Science and Technology, Guangxi Key Laboratory for Sugarcane Biology, Guangxi University, 3Jinshan Hospital, Zhongshan Hospital, Institute for Translational Brain Research, State Key Laboratory of Medical Neurobiology, MOE Frontiers Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude décrit la procédure de reconstitution du canal K+ sensible aux acides lié à la protéine membranaire TWIK (Task2) en nanodisques. L’assemblage réussi a été confirmé par la cryomicroscopie électron à particule unique, qui a permis de fournir des moyennes de classe bidimensionnelles bien définies.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De nombreuses protéines membranaires présentent une faible stabilité, une perte d’activité et une hétérogénéité des échantillons lorsqu’elles sont extraites dans des environnements à base de détergents, posant des défis importants pour l’analyse cryo-microscopique électronique à haute résolution. La technologie des nanodisques répond à ces limites en employant des protéines membranaires (MSP) et des phospholipides pour reconstituer les protéines cibles en une bicouche lipidique native. Dans cette étude, le canal potassique humain Task2 a été exprimé, solubilisé et purifié en présence de détergents appropriés avant l’assemblage du nanodisque. Le protocole résultant établit un flux de travail reproductible pour la reconstitution des nanodisques de Task2, comme le démontrent les étapes clés de validation : un changement clair des profils chromatographie d’exclusion de taille (SEC) confirmant l’agrandissement des particules, la co-migration de Task2 et MSP sur SDS-PAGE, ainsi que des moyennes bien définies de classe 2D avec des caractéristiques secondaires visibles de la structure. Une reconstruction 3D initiale confirme encore l’intégrité de la protéine incrustée dans le nanodisque. En améliorant la pureté, l’homogénéité et la qualité des particules de l’échantillon, cette approche offre une plateforme robuste pour des études structurales à haute résolution de Task2 et propose un cadre méthodologique applicable à d’autres protéines membranaires.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les protéines membranaires jouent un rôle crucial dans la transduction des signaux cellulaires, le transport des métabolites, le maintien de l’intégrité structurelle cellulaire et les réponses immunitaires. La dysrégulation des protéines membranaires est impliquée dans diverses maladies, ce qui en fait des cibles majeures pour le développement de médicaments1. L’avènement de la cryomicroscopie électronique (cryo-EM) a permis des études structurales de protéines membranaires grandeset dynamiques 2. Un défi majeur pour obtenir des structures à haute résolution réside dans l’extraction de ces protéines de leurs bicouches lipidiques natives tout en préservant leurs conformations et fonctions biochimiques natives. De plus, la conformation très dynamique des protéines membranaires et la complexité du criblage des anticorps posent des obstacles supplémentaires à la découverte cibléede médicaments 3,4. Les méthodes traditionnelles d’extraction des protéines membranaires utilisent souvent des détergents pour imiter les propriétés de la bicouche lipidique hydrophobe. Cependant, cette approche perturbe souvent la stabilité des protéines membranaires, conduisant à l’agrégation ou au dépliementpartiel 5. De plus, les détergents peuvent éliminer les molécules lipidiques essentielles qui sont essentielles pour stabiliser la conformation des protéines, ce qui peut modifier la conformation des protéines ou même altérer la fonction, limitant ainsi leur application dans le criblage des anticorps et d’autres applications enaval 6.

La technologie des nanodisques a été introduite pour la première fois par Sligar et sescollègues 7. Cette structure auto-assemblante est généralement formée par des dérivés d’apolipoprotéines A1 (ApoA1), à savoir des MSP, ainsi que des lipides synthétiques ou naturels, offrant un environnement stable pour les protéinesmembranaires 7,8,9. Le MSP forme une structure en forme de disque en entourant les bords hydrophobes de la bicouche lipidique. Cette structure possède une surface hydrophobe qui interagit avec les queues lipidiques de l’acyle, stabilisant la protéine membranaire, et une surface hydrophile orientée vers l’extérieur, permettant à la protéine membranaire de rester soluble dans des solutionsaqueuses 10. Les nanodisques servent de plateforme polyvalente pour l’étude des protéines membranaires. En préservant les protéines membranaires purifiées dans un environnement lipidique proche du niveau native, elles surmontent les limites des méthodes traditionnelles à base de détergent et maintiennent la conformation et la fonction biologique des protéines in vitro. Par conséquent, cette méthode est devenue un outil puissant pour les études structurales des protéines membranaires. Comparé aux environnements traditionnels de détergent, la bicouche lipidique des nanodisques fournit un support structurel aux protéines membranaires, stabilisant leur conformation native — une caractéristique cruciale pour les protéines sujettes à l’inactivation, telles que les récepteurs couplés aux protéines G et les canauxioniques 11. De plus, la nature très uniforme des particules de nanodisques après assemblage offre un soutien renforcé pour l’obtention de données cryo-EM de haute qualité et de données cinétiques fiables sur la résonance plasmonique de surface/interférométriede la biocouche 12.

Au cours de la dernière décennie, la technologie des nanodisques est devenue un outil puissant pour étudier les protéines membranaires dans les environnements lipidiques naturels. Par exemple, Vilela et sescollègues 13 ont établi un cadre systématique pour l’assemblage des nanodisques en optimisant les conditions de reconstitution et en vérifiant la qualité des composants finaux. Plus précisément, ils ont combiné la chromatographie d’exclusion de taille (SEC) avec des indicateurs quantitatifs (y compris l’efficacité d’assemblage et la symétrie de pic) pour évaluer objectivement l’homogénéité deséchantillons 13. Actuellement, les nanodisques sont devenus une plateforme polyvalente. En utilisant la cryo-EM à particule unique pour détecter les protéines assemblées par nanodisques, il est possible d’obtenir des structures à haute résolution des protéines membranaires, et leur applicabilité a été solidement établie. La caractéristique de double densité d’anneaux de la bande MSP constitue la preuve structurelle décisive de la réussite de la liaison10, 14, 15. De plus, les nanodisques constituent un outil précieux tant pour l’analyse fonctionnelle des protéines membranaires dans les environnements de bicouches lipidiques que pour leur application dans les études de résonance magnétique nucléaireen solution 16,17.

Ce protocole décrit une méthode d’assemblage de la protéine membranaire humaine Task2 en nanodisques. Human Task2 est un membre pH-dépendu de la famille de canaux K+ (K 2P) à deux pores18,19. Comme les autres canaux K2P, Task2 est un homodimère échangé de domaine, chaque chaîne protomère contenant quatre hélices transmembranaires (TM1–TM4), deux hélices réentrantes dans les pores (PH1 et PH2), deux filtres de sélectivité (SF1 et SF2) et deux hélices extracellulaires formant des capuchons (CH1 et CH2). La protéine cible était une forme tronquée de Task2 dépourvue des acides aminés C-terminaux 166 — une région prédite largement non structurée — qui s’est avérée améliorer l’expression des protéines et la stabilité biochimique. Le poids moléculaire de Task2 recombiné est d’environ 72 kDa avec une étiquette GFP. Il avait été solubilisé et purifié à l’aide d’un détergent auparavant. Elle a été combinée avec les lipides et le MSP selon un ratio stœchiométrique précisément calculé. Après le retrait du détergent à l’aide de Bio-Beads, l’échantillon a été purifié par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) afin d’obtenir une préparation adaptée à la cryo-EM. Des moyennes de classe bidimensionnelles (2D) ont ensuite été générées à partir de données cryo-EM à particule unique pour valider l’intégrité de l’échantillon.

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Protocole

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1. Préparation du fond lipidique

  1. Préparation des lipides
    1. Préparez des mélanges lipidiques à l’aide de trois phospholipides : 1,2-Dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine (DOPE), 2-oléoyle-1-palmitoylglycéro-3-phosphocholine (POPC) et 1-palmitoyl-2-oléoylphosphatidylsérine (POPS).
    2. Utilisez des solutions de type stock pré-préparées de ces lipides en chloroforme, chacune à une concentration de 25 mg/mL.
      REMARQUE : Un équipement de protection individuelle est nécessaire lors de la manipulation du chloroforme, et toutes les procédures doivent être effectuées dans une hotte à fumée. Conservez le chloroforme dans une armoire dédiée aux produits chimiques.
    3. En raison de la volatilité du chloroforme, lors de la mesure avec une microseringue, vérifiez que le volume de la solution de stock lipidique correspond au volume initialement enregistré avant chaque utilisation. Si l’évaporation survient, il faut reconstituer la solution avec du chloroforme pur jusqu’au volume d’origine et mélanger soigneusement.
      REMARQUE : Avant chaque mesure, rincez la microseringue deux fois avec du chloroforme.
    4. Préparez un mélange lipidique de 100 μL avec un rapport de masse de DOPE :POPC :POPS = 2:1:1. Sur la base de ce rapport, combinez 50 μL deV DOPE, 25 μL de VPOPC et 25 μL de VPOPS. Mesurez le volume correspondant selon le nombre calculé. Ajoutez-le au tube à essai en verre et mélangez soigneusement.
    5. Placez le tube à essai en verre dans un bain-marie pour réduire la volatilisation du chloroforme et maintenir la température ambiante stable.
  2. Préparation du film lipidique
    1. Évaporez le chloroforme sous un doux jet d’azote jusqu’à ce que tout le liquide soit retiré et qu’un film gélatineux homogène et transparent se forme au fond du tube à essai.
      REMARQUE : Assurez-vous qu’un film lipidique uniforme et sec est visible au fond du tube en verre, sans gouttelettes résiduelles de liquide. Évitez un écoulement excessif d’azote, car cela peut provoquer des bulles et empêcher le séchage complet du chloroforme.)
    2. Ajoutez environ 2 mL de n-pentane goutte dans un tube à essai en verre. Ensuite, évaporez le solvant en utilisant la méthode de séchage à l’azote décrite en 1.2.1 pour obtenir un film lipidique sec et transparent. Le n-pentane s’évapore dans un tube à essai en verre en raison de son inertité chimique et de sa compatibilité avec les solvants organiques. Le verre évite le risque de lixiviation ou de dégradation du plastique associé à de nombreux matériaux plastiques de laboratoire plastique, préservant ainsi la pureté lipidique lors de la formation du film.
      REMARQUE : le n-pentane doit être stocké dans un meuble dédié à réactifs et, lorsqu’il est utilisé, manipulé avec précaution dans une hotte à fumée tout en portant un équipement de protection individuelle approprié.
    3. Desserrez le bouchon du tube à essai et placez-le dans un dessicateur sous vide. Évacuez le dessiccateur et maintenez-le sous vide pour éliminer les solvants résiduels. Placez du gel de silice auto-indicatif au fond du dessiccateur pour absorber l’humidité.
      REMARQUE : Évaporez le chloroforme résiduel et le n-pentane jusqu’à la sécheresse dans une hotte à fumée.
  3. Hydratation lipidique et préparation de la solution de bouillon
    1. Retirez le film lipidique du dessicateur sous vide et hydratez-le en ajoutant 250 μL de tampon faible en sel (LSB) sans détergent (Tableau supplémentaire 1). Cela donne une concentration lipidique finale de 10 mg/mL.
      REMARQUE : Un tampon à base d’ions potassium a été choisi car Task2 est un canal ionique potassium
    2. Après avoir résuspendu les lipides, divisez les lipides uniformément en quatre tubes de verre et soniez les suspensions jusqu’à ce qu’elles deviennent claires et transparentes, indiquant la formation réussie des liposomes (environ 1,5 h). Effectuez la sonication à 60 % d’amplitude en utilisant un cycle de 4 s allumé et 6 secondes éteint.
    3. Regroupez la solution lipidique clarifiée et 1,5 mL d’aliquote dans des tubes microcentrifuges individuels. Rinçez immédiatement l’espace de tête de chaque tube avec du gaz azote et conservez à -80 °C jusqu’à utilisation.

2. Sur-expression et purification du MSP

  1. Expression procaryote du MSP
    1. Transformation plasmidique : Utilisez le plasmide MSP1D1 portant une étiquette 7×His pour transformer les cellules compétentes en E. coli BL21 (DE3). Placez le mélange de transformation sur des plaques d’agar Luria-Bertani (LB) contenant de la kanamycine (50 μg/mL) et incubez toute la nuit à 37 °C pour obtenir des colonies uniques.
    2. Amplification en culture : Choisissez un clone unique et inoculez-le dans 5 mL de milieu contenant de la kanamycine, puis incubez-le toute la nuit à 37 °C en secouant. Inocular la culture nocturne dans un milieu liquide LB à un ratio 1:100, puis faire croître à 37 °C en secouant jusqu’à ce que la densité optique à 600 nm (OD600) atteigne 2,0–3,0.
    3. Induction d’expression protéique : Induire l’expression du MSP en ajoutant de l’isopropyle β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 0,5 à 1 mM. Continuez à cultiver les cellules à 16 °C pendant 16 à 20 heures en secouant.
  2. Perturbation cellulaire
    1. Collecte des granulés : centrifugez la culture bactérienne à 4 °C pendant 10 minutes. Écartez le surnageant et conservez la pastille cellulaire.
    2. Lyse bactérienne : Resuspendre le pellet extrait de 1 L de culture dans 100–150 mL de tampon de lyse (Tableau supplémentaire 1). Homogénéisez soigneusement jusqu’à obtenir une suspension uniforme sans amas visibles. Ajoutez du PMSF à la suspension pour inhiber les protéases et réduire la mousse.
    3. Sonication : Utilisez un perturbateur de cellules ultrasonores réfrigérées pour briser les bactéries. Réglez la puissance à 35 % et appliquez des cycles de 3 s d’impulsions suivis de pauses de 6 s. Pour éviter la surchauffe, prévoyez un intervalle de repos de 2 minutes après chaque 15 minutes de temps cumulé de sonication. Continuez jusqu’à ce que le lysat devienne clair et brun clair.
    4. Précision : centrifugez le lysat à 30 000 g pendant 45 minutes à 4 °C et collectez le surnageant pour les étapes suivantes.
  3. Purification MSP
    1. Préparation de la résine Ni-NTA : Prenez 3 à 5 mL de résine Ni-NTA et intégrez-les dans une colonne gravitaire (taille : 26,4×134,8 mm). Lavez la résine avec 3 volumes de colonnes (CV) d’eau distillée et équilibrez-la avec 3 CV de tampon de lavage 1 (Tableau supplémentaire 1).
    2. Lien du MSP à la résine : Après centrifugation du lysat cellulaire, mélangez le surnageant avec la résine Ni-NTA équilibrée. Ajoutez l’imidazole à une concentration finale de 5 mM et incubez le mélange à 4 °C pendant 2 heures en faisant une rotation douce dans l’obscurité.
    3. Laver pour éliminer les impuretés : Laver séquentiellement avec des gradients de Tampon de lavage 1, Tampon de lavage 2 (Tableau supplémentaire 1) et Tampon de lavage 3 (Tableau Supplémentaire 1), en utilisant au moins 50 mL de chaque tampon. Surveillez l’absorption UV à 280 nm (A280) du flux et continuez à laver jusqu’à ce que la valeur de A280 descende en dessous de 0,01.
    4. Élution : Éluvez la protéine cible avec un tampon d’élution (Tableau supplémentaire 1) et collectez les fractions d’éluates. Poursuivre le processus d’élution, en collectant des fractions jusqu’à ce que le A₂₈₀ de l’éluate descende sous 0,01.
    5. Surveillance et analyse des procédés : Collectez des échantillons des étapes clés de purification — y compris le surnageant, le précipité, le flux traversant, les fractions de lavage et les fractions d’élution. Analysez-les par SDS-PAGE pour évaluer l’efficacité de purification (Figure supplémentaire 1).
    6. Dialyse pour l’échange de tampon : transférez l’éluate en pool dans un tube de dialyse et dialysez-le contre le tampon de dialyse (Tableau supplémentaire 1) à 4 °C en remuant doucement toute la nuit.
    7. Ultrafiltration et concentration : Concentrez la solution dialysée à l’aide d’un dispositif d’ultrafiltration jusqu’à une concentration finale de MSP de 2 à 5 mg/mL. Le MSP purifié et concentré est désormais prêt à être utilisé dans l’assemblage de nanodisques de protéines membranaires.

3. Activation des bio-perles

  1. Pesée
    1. Pèser environ 250 mg de bio-perles dans un tube centrifugeuse de 50 mL à l’aide d’une balance analytique.
  2. Lavages au méthanol
    1. Ajoutez 25 à 30 mL de méthanol au tube. Faites tourner ou faire tourner le mélange en vortex dans le noir, puis incubez pendant 20 minutes. Jetez soigneusement le surnageant après l’incubation.
    2. Répétez cette étape de lavage au méthanol trois fois au total.
      REMARQUE : En raison de la volatilité du méthanol, cette procédure doit être réalisée dans une hotte à fumée équipée d’un équipement de protection individuelle approprié. Collectez le méthanol usagé et traitez-le comme un liquide de déchets biologiques.
  3. Lavis aqueux
    1. Ajoutez 25–30 mL ddH2O aux billes. Secouez ou faites pivoter le tube pour mélanger et couver pendant 20 minutes.
    2. Jetez le surnageant. Répétez cette étape de lavage aqueux trois fois.
  4. Équilibrage avec LSB
    1. Ajoutez 25 à 30 mL de LSB sans détergent aux billes. Secouez ou faites pivoter le tube sur une table rotative pour mélanger et incuber pendant 20 minutes.
    2. Jetez le surnageant. Répétez cette étape d’équilibrage LSB trois fois pour conditionner complètement les billes.
  5. Aliquotation et stockage
    1. Divisez les bio-perles activées également en trois tubes microcentrifuges de 1,5 mL. Assurez-vous que les billes restent humides avec une petite quantité de LSB.
    2. Enveloppez les tubes dans du papier aluminium pour les protéger de la lumière et conservez-les sur de la glace pour une utilisation immédiate.

4. Assemblage du nanodisque

  1. Préparation des lipides et du MSP
    1. Clarification du stock lipidique : Récupérez une aliquote du fond lipidique pré-préparé et décongelez-le. Centrifugez immédiatement le tube à 7 000 x g pendant 5 s à 4 °C pour recueillir le contenu au fond.
    2. Ultrasoniser dans un bain-marie et surveillez la clarté et la température toutes les 5 à 10 minutes pour éviter la surchauffe. Effectuer la sonication à 60 % d’amplitude. Ultrasoniser le fond lipidique jusqu’à ce qu’il devienne clair et transparent.
    3. Dégel MSP : Dégeler 1 aliquote de la solution MSP préparée dans un bain d’eau glacée.
  2. Préparez le tampon selon le rapport stœchiométrique.
    1. Quantifier la protéine membranaire : isoler la protéine membranaire purifiée (Task2), solubilisée en 0,025 % DDM/0,005 % CHS, par chromatographie d’exclusion de taille (SEC). Injecter un volume d’échantillon de 500 μL à un débit de 0,5 mL/min sur une colonne d’augmentation Superose 6 (Cytiva). Collectez le pic d’élution à 14,8 mL et concentrez-le (Figure 1). Déterminez la concentration en protéines à l’aide d’un NanoDrop.
    2. Calculer la quantité molaire protéique : Calculer la quantité molaire (n) de la protéine membranaire cible en utilisant la formule : n = C × V, où C est la concentration molaire et V le volume.
    3. Déterminer les volumes MSP et lipidiques : Calculer les volumes requis de MSP et de solutions de stocks lipidiques en fonction d’un rapport stœchiométrique molaire de la protéine cible : MSP : lipide = 1 : 5 : 250.
    4. Préparer le mélange maître : Sur la base des résultats du calcul, combinez les volumes correspondants de lipides et de MSP pour préparer un mélange maître de 300 μL.
      REMARQUE : Assurez-vous que le détergent est inclus dans ce mélange afin de maintenir une concentration cohérente avec celle de la solution protéique, évitant ainsi une agrégation prématurée.
  3. Élimination du détergent et assemblage du nanodisque
    1. Incubation initiale avec le mélange de reconstitution : Incubez le tampon préparé (Tableau supplémentaire 1) sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, ajoutez lentement 50 μL du mélange à la solution protéique concentrée, en le mélangeant doucement par pipetage pour assurer l’homogénéité.
    2. Équilibrage du mélange protéine-lipide : Placez le mélange combiné sur la glace pendant 1 heure. Inversez doucement le tube toutes les 15 minutes pour bien mélanger.
    3. Première incubation avec bio-perles : Centrifugez brièvement le mélange à 7 000 x g pendant 5 s à 4 °C afin de collecter la solution protéique au fond du tube. On prend une aliquote des Bio-billes préactivées, on aspire le LSB résiduel, on ajoute la solution protéique aux billes, puis on incube en rotation dans l’obscurité pendant 1 h pour éviter la dégradation de la protéine cible induite par la lumière.
    4. Deuxième incubation avec bio-billes : centrifugez le mélange à 7 000 x g pendant 5 s à 4 °C et transférez soigneusement le surnageant dans une seconde aliquote de bio-billes (dont le LSB a également été aspiré) et mélangez bien par inversion douce dans l’obscurité pendant 4 à 8 heures ou toute la nuit.
    5. Incubation finale avec Bio-Perles : Récupérez la solution protéique après une incubation nocturne, centrifugez-la brièvement, puis transférez le surnageant dans la troisième et dernière portion des Bio-Perles pré-activées. Incubez en rotation à 4 °C dans l’obscurité pendant 1 heure.
    6. Après une brève centrifugation, transférez le surnageant dans un tube propre de microcentrifugation et centrifugez à 17 000 g à 4 °C pendant 10 minutes pour éliminer les granulats.
      REMARQUE : Éliminer les bio-perles usées comme déchets biologiques.
    7. Purification des nanodisques : Purifier les complexes nanodisque-Task2 par chromatographie d’exclusion de taille (SEC) : injecter un volume d’échantillon de 500 μL à un débit de 0,5 mL/min sur une colonne d’augmentation Superose 6 et collecter le pic d’élution à 15 mL (Figure 2).
    8. Concentration du produit final : Mettre en commun les fractions de pointe de l’élution SEC et les concentrer jusqu’à une concentration finale de nanodisque Task2 de 1,2 à 1,5 mg/mL, adaptée à la préparation d’échantillons cryo-EM.

5. Vérifier que l’assemblage du nanodisque est réussi

  1. Analyse SDS-PAGE : échantillons d’aliquotes provenant des fractions purifiées par SEC.
    1. Analysez les échantillons à l’aide de SDS-PAGE à 12 % pour confirmer la présence de composants clés (par exemple, MSP et protéine membranaire cible), ce qui indique un assemblage réussi du nanodisque (Figure 3).
  2. Préparation et analyse d’échantillons cryo-EM.
    1. Concentrez l’échantillon assemblé avec succès à une concentration finale de 1,2 à 1,5 mg/mL pour la préparation de l’échantillon cryo-EM.
    2. Commencez par centrifuger l’échantillon à 17 000 x g et 4 °C pendant 10 minutes. Déposez une gouttelette de 3 μL sur des grilles d’or Quantifoil R1.2/1,3 fraîchement déchargées par phosphorescence (300 mailles, carbone troué).
    3. Incubez à 4 °C à 100 % d’humidité pendant 5 s. Sécher la grille pendant 4 secondes dans un Vitrobot Mark IV et plonger-geler dans de l’éthane liquide maintenu à température d’azote liquide.
    4. Collectez des empilements de films à super-résolution à l’aide d’un logiciel EPU sur un Titan Krios G4 cryo-EM fonctionnant à 300 kV et équipé d’un détecteur d’électrons directs Falcon G4i.
    5. Réglez le temps d’exposition à 2,78 s, correspondant à une taille de pixel de 0,73 Å (165k ×) et une dose totale accumulée d’environ 50 e⁻/Å 2 par pile de films EER.

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Résultats

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La préparation réussie du stock lipidique était indiquée par la formation d’une solution claire et transparente après la sonication. Pour le MSP, la chromatographie à affinité nickel a donné un produit de haute pureté d’environ 3 mg/mL. L’assemblage des nanodisques a été confirmé par la SEC, qui a montré un profil d’élution caractéristique (Figure 2). Comparé au profil SEC Task2 obtenu avant l’assemblage du nanodisque (Figure 1), le pic protéique se déplace ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette méthode est présentée pour reconstituer les protéines membranaires solubilisées en détergent en nanodisques via l’élimination du détergent, offrant ainsi un environnement plus nativ de la bicouche lipidique. Le succès de ce processus d’assemblage dépend de plusieurs facteurs clés. La plus importante d’entre elles est le rapport stœchiométrique précis entre la protéine membranaire, le MSP et les lipides. Des rapports stœchiométriques inadéquats peuvent conduire à l’agrégation des pr...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs remercient le personnel du Centre de cryo-EM de l’Université de Henan, ainsi que le professeur Wei Wang, pour leur soutien expert. Le financement a été fourni par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (subventions 32371261 à B.L. et 32301011 à R.Z.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bio-billesBio-rad1523920
Cholestéryl hémisuccinatoAnatraceCH210
ChloroformeSinoréagentUtilisation dans une hotte à fumée
GÉNIALAvanti850725P
MéthanolSinoréagent
n-Dodécyl-bêta-D-maltosideAnatraceD310
N-pentaneAdamasUtilisation dans une hotte à fumée
POPCAvanti850457P
POPSAvanti840034P
SECBio-radSuivez le protocole du fabricant pour une utilisation correcte
Tubulure de dialyse SnakeSkinThermo68011
Superose  ; 6 Augmentation 10/300 GLCytiva29091596
Colonnes de spin d’ultrafiltration Amicon Ultra-15MilliporeUFC905008

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
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