Fructus xanthii L’extrait soulage l’arthrose en préservant l’intégrité du cartilage

Résumé

Ce protocole d’étude a été conçu pour étudier systématiquement les effets chondroprotecteurs potentiels de l’extrait de Fructus Xanthii dans l’arthrose grâce à des analyses multi-omiques intégrées et des expériences in vivo .

Résumé

L’arthrose (ARO) est une maladie articulaire dégénérative progressive pour laquelle les interventions pharmacologiques et chirurgicales actuelles soulagent principalement les symptômes plutôt que d’inverser les changements pathologiques sous-jacents, soulignant le besoin urgent de nouveaux agents thérapeutiques. Ce protocole visait à étudier les effets chondroprotecteurs potentiels de l’extrait de Fructus Xanthii contre l’OA. Tout d’abord, un profilage métabolomique non ciblé a été réalisé à l’aide de chromatographie liquide ultra-haute performance couplée à la spectrométrie de masse tandem haute résolution (UHPLC-HRMS/MS) pour caractériser les constituants chimiques de l’extrait. Une stratégie intégrée combinant pharmacologie en réseau et extraction transcriptomique a ensuite été appliquée pour identifier les composants bioactifs et les cibles potentielles de l’extrait, suivie d’une analyse croisée avec des gènes dérégulés liés à l’OA pour obtenir les gènes cibles centraux. Des analyses d’enrichissement de l’Ontologie Génique (GO) et de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) ont été réalisées pour annoter les principaux processus biologiques et voies de signalisation modulés par l’extrait. Pour la validation in vivo , des modèles de lésion du cartilage par poisson-zèbre et des modèles d’OA chez la souris ont été utilisés pour évaluer les effets chondroprotecteurs de l’extrait. Le séquençage ARN (RNA-seq) a été adopté pour analyser les altérations transcriptomiques des chondrocytes après traitement, en se concentrant sur les voies associées à l’OA et les profils d’expression génique ; Un test immunosorbant lié à l’enzyme (ELISA) a ensuite été réalisé pour vérifier les niveaux d’expression des protéines/récepteurs clés criblés par l’ARN-seq, afin de confirmer davantage les effets régulateurs de l’extrait de Fructus Xanthii sur les cibles principales de l’OA. Ce protocole multi-omique intégré et expérimental offre une approche systématique pour explorer le potentiel de l’extrait de Fructus Xanthii comme candidat botanique prometteur pour une intervention sur l’arthrose.

Introduction

L’arthrose (ARO) est une maladie dégénérative de l’articulation caractérisée par la dégradation progressive du cartilage articulaire, la sclérose osseuse sous-chondrale, l’inflammation synoviale et la formation^{d’ostéophytes.} Selon l’étude Global Burden of Disease (GBD), la prévalence de l’arthrose a augmenté régulièrement dans 204 pays et territoires de 1990 à 2020², cette tendance s’accélérant parallèlement au vieillissement démographique^{mondial 3}. Les estimations actuelles indiquent que plus de 250 millions de personnes dans le monde sont touchées, ce qui met une pression importante sur le bien-être individuel, les systèmes de santé et les structures^{socio-économiques 4}. Les traitements actuels visent principalement le soulagement symptomatique, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et la viscosupplémentation intraarticulaire à l’acide hyaluronique (HA) étant les interventions les plus courantes. Cependant, ces approches offrent un bénéfice clinique limité et sont associées à des effets indésirables^{considérables 5,6}. Cela souligne le besoin crucial de médicaments efficaces modifiant la maladie contre l’arthrose (DMOAD).

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est depuis longtemps utilisée dans la prise en charge de l’arthrose, fondée sur le concept de « bi osseux », un sous-type du « syndrome bi ^»7. Dans ce cadre, la pathogenèse de l’arthrose est principalement attribuée à une carence en essence hépatique et rénale, à une insuffisance de qi et de sang, et à une invasion subséquente par le vent, le froid et^{l’humidité 8}. En conséquence, les stratégies thérapeutiques se concentrent sur la dissipation de l’humidité par le vent, la dispersion du froid et le déblocage des éléments^{collatéraux.} Les traitements de la MTC sont reconnus pour leurs effets multi-cibles, leurs profils d’effets secondaires favorables et leur efficacité cliniquement^{significative 10}. Des formulations notables telles que Buqi Tongluo Capsule (BQTL) et Fuzi Decoction (FZD) ont montré des effets anti-OA clairs en pratique clinique, tandis que Du Huo Ji Sheng Tang (DHJST) soulage les symptômes de l’OA en supprimant la voie inflammasome du NLRP3, soutenue par des siècles d’utilisation empirique. De même, le mélange de Shenjinhuoxue (SHM) atténue la douleur et la dégénérescence du cartilage par la régulation à la baisse de médiateurs pro-inflammatoires tels que l’IL-1β et le TNF-α 11,12,13. Au niveau des monomères, des composés tels que l’icariine (Cyanoside A, CyA) et l’érianine, dérivés de plantes médicinales, ont été rapportés favorisant la prolifération des chondrocytes, inhibant la libération de cytokines inflammatoires et maintenant l’homéostasie^{articulaire 14,15}. Collectivement, la MTC propose une approche thérapeutique globale aux propriétés anti-inflammatoires, chondroprotectrices et atténuantes des symptômes. Cependant, la complexité de ses mécanismes et les questions liées à la normalisation nécessitent des recherches continues et rigoureuses.

Les fruits mûrs séchés de Fructus Xanthii (Compositae), communément appelés « Cang-Er-Zi », ont été documentés comme présentant une large gamme d’activités pharmacologiques, notamment des effets antimicrobiens, anti-inflammatoires, antioxydants, analgésiques, antinéoplasiques et^{immunomodulateurs 16}. Les acides phénoliques isolés de Fructus Xanthii réduisent efficacement l’hyperplasie synoviale dans la polyarthrite rhumatoïde ^(AR)17. Parmi ceux-ci, l’acide chlorogénique (CGA), un dérivé représentatif de l’acide caffeoylquinique, a été démontré pour stimuler la prolifération et la différenciation des ostéoblastes tout en inhibant l’ostéoclastogenèse médiée par RANKL, maintenant ainsi l’homéostasie^{squelettique 18}. D’autres acides phénoliques identifiés dans le même extrait, tels que l’acide néochlorogénique (5-CQA), l’acide cryptochlorogénique (CCA) et l’acide protocatechui, présentent également des propriétés antimicrobiennes, anti-inflammatoires, antitumorales^{et antioxydantes} 19,20,21. En plus des acides phénoliques, une variété de métabolites secondaires présents dans Cang-Er-Zi contribuent à ces bioactivités 16,20,22,23,24,25. Cependant, le rôle précis et les mécanismes sous-jacents de l’extrait de Fructus Xanthii dans l’AO restent largement inexplorés.

Chromatographie liquide non ciblée-Spectrométrie de masse tandem (LC-MS/MS) La métabolomique se caractérise par des capacités sans hypothèse, à haut débit et à couverture globale. Il permet la détection simultanée de milliers de caractéristiques métabolitiques, offrant une vue panoramique des réseaux métaboliques, et permet la découverte systématique de nouveaux biomarqueurs et de voies métaboliques aberrantes sans préspécification préalable^{de la cible 26,27}. Combinée à la technologie de spectrométrie de masse à haute résolution, cette approche convient à l’analyse complète de divers types d’échantillons biologiques (par exemple, sérum, liquide synovial, urine, tissu cartilagineux, etc.) et a démontré des avantages significatifs dans la recherche sur l’arthrose (OA). D’une part, il peut dépister de manière exhaustive les métabolites différentiels étroitement associés à la progression pathologique de l’arthrose (tels que diverses classes de métabolites identifiées dans le liquide synovial et le tissu synovial) et les cartographier vers des voies clés, notamment le métabolisme énergétique, la réparation du cartilage, l’ostéogenèse et le métabolisme lipidique, approfondissant ainsi la compréhension de la pathogenèse de l’OA. En revanche, l’intégration de données multi-omiques telles que la transcriptomique et la protéomique permet de révéler le rôle de la reprogrammation métabolique dans la dégénérescence du cartilage, les réponses inflammatoires et les lésions de la structure articulaire, fournissant des preuves cruciales pour identifier précocement les biomarqueurs diagnostiques, évaluer la progression de la maladie et développer des stratégies métaboliques ciblées (par exemple, réguler les acides biliaires, le tryptophane ou le métabolisme des acides gras), mettant en lumière son potentiel translationnel dans recherche sur la dactylographie de précision et le traitement personnalisé.

Le poisson-zèbre constitue un excellent organisme modèle grâce à de multiples avantages : son génome est fortement conservé par rapport à celui de l’humain, partageant l’homologie avec environ 70 % des gènes codant les protéines^{humaines 28,29}. Il présente des caractéristiques clés telles que le développement rapide, la fécondation in vitro, la transparence des embryons permettant une imagerie in vivo pratique, une fécondité élevée et des coûts d’entretien faibles^{30, 31, 32, 33.} En recherche squelettique, le poisson-zèbre permet une visualisation claire de la formation osseuse, des processus de minéralisation et de la capacité de régénération, et peut être utilisé pour simuler des pathologies telles que l’ostéoporose et les lésions du cartilage. Cependant, dans l’étude de l’arthrose (OA), une maladie complexe de l’articulation globale caractérisée par une dégénérescence du cartilage articulaire, une inflammation synoviale et des altérations osseuses sous-condrales, l’application du modèle du poisson-zèbre reste relativement limitée.

Cet article présente un protocole qui intègre la métabolomique non ciblée basée sur l’UHPLC-HRMS/MS, la pharmacologie en réseau, l’exploitation transcriptomique et la validation expérimentale in vivo afin d’explorer le potentiel de l’extrait de Xanthium sibiricum comme candidat végétal viable pour une intervention sur l’OA. L’objectif n’est pas seulement d’identifier les composants bioactifs, les cibles potentielles et les voies régulatrices principales de l’extrait de Xanthium sibiricum liés à l’OA par intégration multi-omique et analyse computationnelle, mais aussi de vérifier son effet chondroprotecteur sur l’OA via des modèles in vivo et de clarifier davantage son mécanisme régulateur sur le transcriptome des chondrocytes.

Protocole

Toutes les expériences impliquant des échantillons cliniques et des souris ont été menées conformément au protocole approuvé par le Comité d’éthique du Centre provincial de recherche en biotechnologie médicale du Shandong. Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Isolement et culture des chondrocytes articulaires humains

Des échantillons de cartilage articulaire humain ont été prélevés auprès de patients subissant une chirurgie arthroscopique ou une arthroplastie articulaire totale au Premier Hôpital affilié de la Première Université Médicale du Shandong. Les tranches de cartilage étaient transportées au laboratoire sur glace dans les 30 minutes suivant l’excision chirurgicale. Le tissu a été soigneusement lavé avec la solution de sérum de Dulbecco tamponné phosphate (DPBS ; 3 à 5 lavages), puis finement haché en fragments d’environ 1 mm³ à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles. Une digestion enzymatique séquentielle a été réalisée, en commençant par une pré-digestion utilisant une trypsine-EDTA à 0,25 % pendant 30 minutes à 37 °C. Le processus de digestion était surveillé jusqu’à ce que les fragments de cartilage s’amincissent, réduisent de taille et deviennent translucides, après quoi les fragments de cartilage étaient collectés par centrifugation (200 × g, 5 min) à température ambiante. Cela a été suivi d’une digestion nocturne (8 h, 37 °C) avec 0,2 % de collagénase de type II sous agitation douce continue. Le processus de digestion était surveillé jusqu’à ce que tous les fragments de cartilage visibles en vue macroscopiquement soient complètement dissous. Les cellules libérées ont été collectées par centrifugation (200 × g, 5 min) à température ambiante, remises en suspension dans du DMEM complet complétés avec 10 % de sérum bovin fœtal, 100 U/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine, puis ensemencées en² flasques de culture de 75 cm. Les cellules étaient maintenues à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂. Les chondrocytes adhérents ont été détachés à l’aide de 0,25 % de trypsine-EDTA, et les cellules ont été subcultivées à un ratio de 1:3 lorsque les cellules adhérentes atteignaient 80 % de confluence de la surface de la fiole de culture.

2. Préparation de l’extrait de Fructus Xanthii

Des fruits mûrs séchés de Xanthium strumarium L. (Fructus Xanthii) ont été prélevés auprès de populations naturellement présentes dans le nord de la Chine et authentifiés par un pharmacien senior. Le spicier a été déposé dans l’herbier de la Première Université de Médecine du Shandong. 20 g de Fructus Xanthii finement en poudre ont été placés dans un dé à coudre d’extraction, et une extraction exhaustive de Soxhlet a été réalisée avec 95 % d’éthanol (environ 250 mL) jusqu’à la réalisation de sept à huit cycles de siphon. L’extrait éthanolique était filtré, puis le filtrat concentré jusqu’à la sécheresse sous pression réduite à 45 °C à l’aide d’un évaporateur rotatif. Le résidu résultant a été resuspendu dans 60 mL d’eau double distillée et partagé successivement avec 60 mL d’acétate d’éthyle dans un entonnoir séparateur. Le mélange a été vigoureusement secoué et laissé subir une séparation de phase à 4 °C pendant 24 heures. La couche aqueuse était ensuite collectée, lyophilisée et stockée à −80 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.

3. Flux de travail standardisé pour la métabolomique LC-MS/MS non ciblée

1. Analyse métabolomique non ciblée basée sur l’UHPLC-HRMS/MS
   Le profilage métabolomique non ciblé a été réalisé sur une plateforme de chromatographie liquide ultra-haute performance et spectrométrie de masse tandem haute résolution (UHPLC-HRMS/MS). Les métabolites étaient rapidement trempés et extraits à l’aide d’un système méthanol refroidi et eau. La séparation chromatographique a été réalisée sur un système UHPLC équipé d’une colonne chromatographique C18/T3 (100 × 2,1 mm, 1,8 μm) maintenue à 40 °C. Un gradient binaire (0–28 min) composé de 0,1 % d’acide formique dans l’eau (A) et de 0,1 % d’acide formique dans l’acétonitrule (B) a été appliqué à un débit de 0,3 mL/min. La détection par spectrométrie de masse a été réalisée sur un instrument hybride quadrupole-Orbitrap fonctionnant en mode MS2 complet MS/dépendant des données (MS/dd-MS2) à commutation de polarité, avec une plage de balayage complète de m/z 70–1 050 et une résolution de 120 000 (FWHM à m/z 200). La fragmentation par dissociation collisionnelle (HCD) à haute énergie a été réalisée à 20, 40 et 60 eV, avec une exclusion dynamique fixée à 10 s.
2. Les données brutes étaient converties au format mzXML à l’aide de ProteoWizard. Le pic picking, l’alignement en temps de rétention et le dé-isotoping ont été effectués sur XCMS Online en utilisant des paramètres optimisés pour HRMS (ppm = 5, bw = 5, snthresh = 6). Les caractéristiques contenant plus de 50 % de valeurs manquantes entre les échantillons ont été exclues, et les zones de pic restantes ont été normalisées au courant ionique total (TIC). Les métabolites ont été annotés en comparant avec précision la masse, les spectres MS2 et le temps de rétention avec une bibliothèque de référence interne en utilisant une tolérance d’erreur de masse de ≤ 5 ppm et un seuil de score en produit scalaire de ≥80.
   REMARQUE : Des procédures opérationnelles standard strictes ont été suivies tout au long du flux de travail. Les échantillons étaient congelés instantanément dans de l’azote liquide (−80 °C) immédiatement après la collecte, transportés à l’aide d’une chaîne de glace sèche, puis traités selon des procédures d’extraction, d’injection et de traitement par lots aléatoires. Des échantillons de contrôle qualité (QC) regroupés étaient insérés après chaque 10 échantillons d’étude pour surveiller la dérive instrumentale.

4. Analyse de la pharmacologie des réseaux

1. Dépistage en réseau basé sur la pharmacologie des composés actifs et prédiction des cibles
   Les ingrédients actifs de Fructus Xanthii ont été extraits de la base de données TCMID (https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php) et de la base de données HERB (http://herb.ac.cn/). Les composés prélevés ont été filtrés selon les seuils recommandés d’ADME pour la biodisponibilité orale ≥ 30 % et la ressemblance avec le médicament ≥0,18. Les cibles humaines prédites des composés qualifiés ont été obtenues à partir des deux bases de données. Les résultats du dépistage ont été collectés et compilés, permettant l’identification de 15 composés actifs et de 151 cibles protéiques uniques associées à Fructus Xanthii.
2. Intégration des données transcriptomiques et identification des cibles principales associées à l’OA
   Les gènes différenciellement exprimés (DEG) dans les tissus cartilagineux entre des échantillons normaux et d’arthrose (OA) ont été extraits des ensembles de données GEO GSE51588 (n = 5 normal, 6 OA) et GSE169077 (n = 10 normal, 40 OA) à l’aide de l’outil web GEO2R (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r). Les gènes à la hausse de l’OA ont été définis selon les critères de la variation de log2 multipliée >0,5 et une valeur p ajustée <0,05. L’intersection entre les gènes à régulation excessive de l’OA et les 151 cibles protéiques liées à Fructus Xanthii a été visualisée à l’aide du paquet R ggvenn. Les réseaux d’interaction protéine-protéine (IPP) des cibles d’intersection ont été construits à l’aide de la base de données STRING (https://string-db.org/). Les données du réseau PPI ont été importées dans Cytoscape, et les 10 principaux gènes hub ont été dépistés pour une analyse d’enrichissement fonctionnel ultérieure à l’aide du plug-in CytoHubba avec l’algorithme MCC.

5. Détermination de la concentration maximale tolérée (MTC) chez le poisson-zèbre

Les larves transgéniques de poisson-zèbre (Tg col2a1a : EGFP) à 2 jours après la fécondation (2 dpf) ont été distribuées aléatoirement en plaques à 6 puits avec une densité de 30 larves par puits. Chaque puits était complété par 3 mL de milieu d’exposition contenant de l’extrait de Fructus Xanthii dilué en série. Des larves moribles ou décédées étaient retirées quotidiennement. Les larves ont été exposées en continu à 28 °C pendant 72 heures, après quoi la concentration maximale tolérée (CMT) a été déterminée comme la plus élevée à laquelle la mortalité larvaire ne dépassait pas 10 %.

6. Établissement du modèle de lésions osseuses du poisson zèbre

Tg col2a1a : Les larves de poisson-zèbre d’EGFP à 2 jours après la fécondation (2 dpf) ont été réparties en quatre groupes : témoin, modèle, sulfate de chondoïtine (CS) contrôle positif, et traitement à l’extrait de Fructus Xanthii . Tous les groupes sauf le groupe témoin ont été exposés à Staphylococcus aureus (OD600 = 0,8, 1 × 10⁸ CFU/mL) pendant 24 heures pour induire une lésion osseuse. L’établissement réussi du modèle a été confirmé en vérifiant une réduction d’au moins 50 % de l’intensité de fluorescence verte spécifique au cartilage dans la région craniofaciale par rapport au groupe témoin sous un microscope à épifluorescence.

7. Évaluation quantitative de la fluorescence spécifique au cartilage chez les larves de poisson-zèbre

Les larves ont été exposées en continu à des concentrations graduées d’extrait de Fructus Xanthii ou à 1 000 μg/mL de sulfate de chondoïtine sodique A (contrôle positif) à 28 °C pendant 72 heures. Par la suite, 10 larves ont été sélectionnées au hasard parmi chaque réplication à 6 puits (n = 30 par groupe). Les larves sélectionnées ont été anesthésiées avec 0,016 % de tricaïne et positionnées latéralement sur des coussinets d’agarose à faible fondu à 1 %. Les images de fluorescence ont été obtenues à un grossissement de 2× (excitation 488 nm, émission 525/50 nm) à l’aide d’un stéréomicroscope équipé d’une caméra à fluorescence. L’intensité spécifique du cartilage à l’EGFP dans la région craniofaciale, y compris le cartilage cératohyyal et le cartilage de Meckel, a été quantifiée à l’aide d’un logiciel d’analyse d’image. Une correction de fond a été effectuée sur les valeurs de densité intégrées, et les valeurs corrigées ont été normalisées au groupe témoin pour une analyse statistique de l’efficacité chondroprotectrice.

8. Induction de l’OA chez les souris C57BL/6J

Les souris mâles C57BL/6J (6–8 semaines, 20–22 g) ont été hébergées sous des conditions spécifiques sans agents pathogènes (SPF) à 22 °C ± 2 °C avec un cycle clair/sombre de 12 heures. Les souris ont été autorisées à s’acclimater pendant une semaine puis ont été réparties au hasard en trois groupes (n = 8 par groupe) à l’aide d’un tableau des nombres aléatoires : (1) témoin opéré par simulation, (2) OA induite par ACLT (ACLT), et (3) intervention ACLT plus extrait de Fructus Xanthii (ACLT + extrait de Fructus Xanthii ). Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisées dans des conditions stériles conformément à un protocole préalablement validé.

Les souris ont été anesthésiées avec un pentobarbital sodique intraperitonéal (50 mg/kg) (suivant des protocoles approuvés par l’institution), et une incision parapattelienne médiale a été réalisée pour exposer la capsule articulaire du genou droit. Le ligament croisé antérieur a été sectionné au microscope opératoire pour induire une instabilité articulaire, après quoi la capsule articulaire et la peau ont été fermées en couches à l’aide de sutures absorbables 6-0. Les souris opérées par simulacre ont subi des procédures d’arthrotomie identiques sans transection ligamentaire. La stabilité articulaire a été évaluée, et l’établissement réussi du modèle a été confirmé par la réalisation du test du tiroir ou par l’évaluation du degré de lésion articulaire dans les sections histologiques chez les souris du groupe modèle.

Une analgésie postopératoire avec buprénorphine (0,1 mg/kg, injection sous-cutanée) a été administrée pendant trois jours consécutifs. Les agents de traitement étaient administrés une fois par jour par gavage. Le groupe ACLT + extrait de Fructus Xanthii a reçu 100 μL d’extrait de Fructus Xanthii dilué à 1 000 μg/mL dans une solution saline normale, tandis que les deux autres groupes ont reçu 100 μL de solution saline normale comme témoin du véhicule. À 8 semaines post-opératoire, les souris ont été euthanasiées par asphyxie au CO₂ suivie d’une luxation cervicale, et les articulations du genou ont été prélevées pour des analyses histologiques.

9. Coloration histopathologique

1. Préparation histologique et coloration du tissu de l’articulation du genou
   Les articulations opérées du genou ont été excisées en bloc à la semaine 8 postopératoires et fixées à 4 % de paraformoldéhyde (PFA) à 4 °C pendant 48 heures. Les articulations fixes ont été décalcifiées à 10 % d’acide éthylédidiaminetétraacétique (EDTA ; pH 7,4) pendant 14 jours, déshydratées par une série éthanol graduée, puis intégrées dans la paraffine. Des sections sagittales en série (5 μm) ont été préparées à partir des articulations incrustées, et les procédures de coloration histologique suivantes ont été effectuées.
   1. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E)
      Une coloration par hématoxyline et éosine (H&E) a été réalisée pour évaluer l’architecture générale des tissus, l’intégrité du cartilage et l’hyperplasie synoviale.
   2. Coloration Safranin-O/Fast Green
      La coloration Safranin-O/Fast Green a été réalisée pour détecter les protéoglycanes dans le tissu cartilagineux. Les sections colorées ont été examinées à l’aide d’un microscope optique équipé d’un appareil photo numérique, et les images ont été prises à des grossissements de 10× et 20×.
2. Évaluation semi-quantitative basée sur OARSI pour la dégénérescence du cartilage
   Pour une évaluation semi-quantitative de la dégénérescence du cartilage, les coupes colorées ont été réévaluées rétroactivement et notées selon le système d’évaluation histopathologique du cartilage de l’Osteoarthritis Research Society International, qui évalue la gravité des lésions cartilagineuses en fonction du grade (0–6 ; étendue de la perte de cartilage) et du stade (0–4 ; répartition spatiale des dommages) de la dégénérescence du cartilage articulaire.
   Une stratégie d’aveuglement post-hoc a été adoptée pour toutes les évaluations. Toutes les sections ont été désidentifiées en retirant les labels de groupe d’origine et ont été recodées avec des numéros de série anonymes. Deux pathologistes expérimentés ont noté les sections de manière indépendante, sans connaître l’attribution des groupes. La validation croisée a été réalisée entre les deux ensembles de résultats de notation. Lorsque la différence de score était de ≥1, les sections discrepantes ont été réévaluées conjointement par les deux pathologistes afin d’établir un score consensuel. Les scores de consensus finaux ont été utilisés pour des analyses statistiques ultérieures afin d’assurer l’objectivité, la robustesse et la reproductibilité des résultats histopathologiques.

10. Séquençage de l’ARN (RNA-seq)

Les chondrocytes articulaires humains primaires (passages 2–3) ont été semés en plaques à 6 puits à une densité de 5 × 10 cellules⁵ par puits. Les cellules ont été privées de sérum pendant 24 heures puis réparties en deux groupes (n = 3 par groupe) : (1) Groupe témoin : les cellules ont été traitées uniquement avec véhicule (0,1 % de DMSO) ; (2) Groupe extrait de Fructus Xanthii : les cellules ont été traitées avec 1 000 μg/mL d’extrait de Fructus Xanthii dissous dans du DMSO.
Les cellules ont été traitées pendant 24 heures, après quoi l’ARN total a été extrait à l’aide du réactif TRIzol selon le protocole du fabricant. L’intégrité de l’ARN (RIN ≥7,0) et la concentration ont été évaluées à l’aide d’un analyseur d’ARN. Des bibliothèques d’ADNc spécifiques aux brins ont été préparées à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque de séquençage ARN et séquencées sur une plateforme de séquençage de nouvelle génération (NGS) à haut débit en mode bined-end 150 bp (PE150). Le contrôle qualité des fichiers bruts FASTQ était effectué avec FastQC, suivi d’un adaptateur et d’un découpage qualité avec Trimmomatic avant l’analyse en aval.

11. Traitement des données RNA-seq

Gènes exprimés différemment par un extrait de Fructus Xanthii (par rapport au groupe témoin ; p < 0,05 et logFC < −0,5) ont été extraits du jeu de données RNA-seq et croisés avec les 10 cibles principales du centre. Les cibles principales résultantes associées à l’extrait de Fructus Xanthii et à l’arthrose ont été visualisées à l’aide du package ggvenn.

12. ELISA

Les chondrocytes articulaires humains primaires aux passages 2 à 3 ont été ensemencés dans des plaques à 6 puits à une densité de 5 × 10 cellules⁵ par puits. Les cellules ont été incubées dans un milieu sans sérum pendant 24 heures afin d’induire la quiescence. Les cellules ont ensuite été divisées en trois groupes suivants (n = 3 par groupe) :
(1) Contrôle blanc : les cellules ont été traitées uniquement avec véhicule (0,1 % DMSO) ; (2) Contrôle positif : l’inflammation cellulaire a été induite avec IL-1β, suivie d’un traitement par véhicule (DMSO à 0,1 %) ; (3) Groupe extrait de Fructus Xanthii : l’inflammation cellulaire a été induite avec IL-1β, suivie d’un traitement avec 1000 μg/mL d’extrait de Fructus Xanthii dissous dans 0,1 % de DMSO. Les surnadants de culture cellulaire étaient collectés après 24 heures d’incubation et conservés à −80 °C jusqu’à utilisation. Les niveaux de MMP1 et de PGR dans les surnadants de culture ont été déterminés à l’aide de kits d’immunoabsorption liés aux enzymes (ELISA) disponibles dans le commerce, spécifiques respectivement à MMP1 et PGR humains. Les tests ont été réalisés selon les instructions du fabricant.

13. Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide d’un logiciel d’analyse statistique et de graphique, et les données ont été présentées en moyenne ± écart-type (DS). La normalité des données a été évaluée à l’aide du test de Shapiro–Wilk, et l’homoscédasticité a été évaluée à l’aide du test de Levane. Des comparaisons inter-groupes ont été réalisées à l’aide d’une analyse unidirectionnelle ou bidirectionnelle de la variance (ANOVA), suivies de tests post-hoc de Tukey ou de Šidák, selon le cas. Des comparaisons par paires ont été réalisées à l’aide d’un test t de Student à deux queues. Les données non paramétriques ont été analysées à l’aide du test Mann–Whitney U. Une valeur P bilatérale < 0,05 était considérée comme statistiquement significative.

Résultats

Évaluation de la qualité et paysage métabolique des données LC-MS/MS non ciblées

Les échantillons de contrôle qualité ont montré une excellente reproductibilité, comme l’indiquent les chromatogrammes TIC très chevauchants dans les modes ions positifs et négatifs, avec une dérive temporelle de rétention restant inférieure à 0,05 min sur l’ensemble du lot analytique. Les données brutes subissaient un prétraitement basé sur XCMS, incluant la détection des pics, l’intégration et l...

Discussion

L’arthrose est un trouble articulaire dégénératif répandu et une cause majeure d’incapacité dans le^{monde 36}. Sa pathogenèse est complexe et multifactorielle, impliquant des changements biochimiques, cellulaires et moléculaires à travers les tissus articulaires. Autrefois considéré comme un simple phénomène d'« usure » du cartilage articulaire, l’arthrope est aujourd’hui largement reconnue comme une maladie chronique de l’articulation entière, caractérisée par la d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
4% PFA	Biosharp, Chine	BL539A	pH 7.4, stérile
Souris C57BL/6	Vital River Laboratory Animal Technology Co.,Ltd, Chine	N/A	Mâle, 8-10 semaines, 20-25g
Sulfate de chondroïtine	MCE, Amérique	HY-B2162	Pureté ≥98%
ClusterProfiler (R Package)	Bioconductor	Accès gratuit	Intégré dans R v4.2.2
Collagénase, Type II, en poudre	Gibco, Amérique	17101015	≥125 U/mg
Cytoscape	Consortium Cytoscape	Accès gratuit (https://cytoscape.org/)	v3.9.1 (avec CytoHubba)
Cytoscape	Consortium Cytoscape	Accès gratuit	Version 3.9.1
DESeq2 (R Package)	Bioconductor	Accès gratuit	Intégré dans R v4.2.2
DMEM, haute glucose	Gibco, Amérique	11965092	Milieu stérile
Éthanol	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, Chine	10009218	Grade analytique, 95%
Acétate d'éthyle	Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd, Chine	10009418	Grade analytique
Sérum bovin foetal (FBS)	Cellmax, Chine	SA102.02	Inactivé par la chaleur
Microscope à fluorescence	Nikon, Japon	Eclipse Ti2-U	Équipé d'un filtre GFP (excitation 488nm) & caméra numérique
Base de données GEO	NCBI	https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r	Outil d'analyse GEO2R
GraphPad Prism	GraphPad Software, LLC, Amérique	Commercial	Version 9.5.1
Kit de coloration Hématoxyline-Éosine(HE)	Solarbio, Chine	G1120	Kit prêt à l'emploi
Base de données HERB	Académie chinoise des sciences	http://herb.ac.cn/	V2.0
Kit ELISA pour MMP-1 humain	Yamei Biotechnology, Chine	HJ088	Pour humain, plaque à 96 puits
Kit ELISA pour le récepteur de progestérone humaine (PR)	Shanghai Enzyme-Linked Biotechnology Co., Ltd., Chine	ml05997	Pour humain, plaque à 96 puits
ImageJ	Instituts nationaux de la santé (NIH)	Accès gratuit	Version 1.53t
Microscope optique	Olympus, Japon	BX53	Objectifs 10×/20× & caméra numérique
Lyophilisateur	Christ, Allemagne	Alpha 1-4 LDplus	Système de lyophilisation
Kit de coloration Saffron-O et Fast Green modifié	Solarbio, Chine	G1371	Pour la coloration des os/du cartilage
Balsam neutre	Solarbio, Chine	G8590	Médium de montage
Pénicilline-Stréptomycine	Gibco, Amérique	15070063	100×, stérile
Tampon phosphate (PBS)	Sparkjade, Chine	CR0013-500ML	pH 7.2-7.4, stérile
Logiciel R	R Foundation for Statistical Computing	Accès gratuit (https://www.r-project.org/)	v4.4.1 (avec ggvenn)
Milieu de congélation cellulaire sans sérum	Biosharp, Chine	BL203B	Stérile
Staphylococcus aureus	American Type Culture Collection (ATCC)	ATCC 25923	Souche standard
Base de données STRING	Consortium STRING	https://string-db.org/	Analyse des interactions protéiques
Base de données TCMID	Centre de collaboration pour l'innovation Shaanxi Qinling Qiyao	https://www.tcmsp-e.com/tcmspsearch.php	V3.0
Zèbre Tg(col2a1a:EGFP)	Zebrafish International Resource Center (ZIRC)	N/A	Larves (2 dpf), souche AB
Réactif TRIzol	Thermo Fisher, Amérique	15596018CN	Pour l'extraction d'ARN total
Trypsine-EDTA (0,25%), rouge phénol	Gibco, Amérique	25200056	Solution stérile
Chromatographie liquide à ultra-haute performance (UHPLC)	Thermo Fisher, Amérique	Q Exactive Focus	Couplé avec HRMS/MS
XCMS-online	Institut de recherche Scripps	Accès gratuit	Plateforme web