Modèles animaux rats pour l’évaluation des effets de la stimulation nerveuse sacrée et périphérique sur la fonction de la vessie

Résumé

Ce protocole décrit des techniques chirurgicales détaillées pour stimuler les nerfs sacré, tibial et péronier chez les rats anesthésiés. Ces modèles permettent d’étudier les effets de la neuromodulation sur la fonction de la vessie, d’aider à déterminer les paramètres optimaux de stimulation et d’étudier les mécanismes d’action des thérapies de stimulation des nerfs sacrés et périphériques.

Résumé

La neuromodulation, une approche thérapeutique du dysfonctionnement de divers organes, s’est avérée efficace dans le traitement des dysfonctionnements des voies urinaires inférieures. Malgré son succès clinique, les mécanismes sous-jacents à la neuromodulation restent incomplètement compris, soulignant la nécessité de modèles animaux standardisés et reproductibles. Des modèles précliniques de neuromodulation de la vessie urinaire utilisant la stimulation sacrée et des nerfs périphériques sont établis depuis plus de vingt ans ; cependant, la littérature existante fournit peu de détails méthodologiques concernant les interventions chirurgicales. Cet article propose une description détaillée et une représentation visuelle de techniques bien établies pour la stimulation du nerf sacré. Il décrit également une approche modifiée de la stimulation du nerf tibial et introduit une nouvelle méthode de neuromodulation de la vessie utilisant la stimulation du nerf péronique dans un modèle de rat. L’approche de stimulation du nerf tibial modifié consiste à exposer et stimuler le nerf tibial à son origine, sous forme de branche du nerf sciatique, plutôt qu’au niveau de la cheville médiale, comme décrit dans des études antérieures. Compte tenu de l’introduction récente de la stimulation du nerf péronier pour la neuromodulation de la vessie en pratique clinique, cet article propose un modèle unique chez le rat pour étudier ses mécanismes dans le contrôle de la fonction des voies urinaires inférieures. Des indications étape par étape pour les trois méthodes de neuromodulation sont définies pour l’exposition nerveuse, le placement des électrodes et la vérification du placement réussi des électrodes en fonction des réponses motrices caractéristiques. Un exemple représentatif de l’effet de la stimulation du nerf péronien sur la fonction de la vessie dans un modèle de rat de suractivité vésique induite par l’acide acétique est inclus pour démontrer son applicabilité. Cet article présente un protocole standardisé et techniquement accessible pour étudier les mécanismes de neuromodulation, incluant les altérations de la signalisation sensorielle de la vessie, les voies régulatrices spinales et supraspinales, l’optimisation des paramètres de stimulation et la comparaison de l’efficacité de différentes cibles de stimulation.

Introduction

La neuromodulation utilise une stimulation électrique à faible amplitude pour modifier la fonction de l’organe^{terminal 1}. Dans le contexte d’un dysfonctionnement des voies urinaires inférieures, telles que le syndrome de la vessie hyperactive (CCA), la rétention urinaire non obstructive, la vessie neurogène et le syndrome de douleur vésicale, la neuromodulation est utilisée comme traitement de troisième ligne pour les patients ayant échoué à la thérapie comportementale et à la^{pharmacothérapie 2}. Pour la neuromodulation chez les patients atteints de CCA, la stimulation du nerf tibial postérieur et la stimulation du nerf sacré (SNS) ont été largement utilisées en pratique clinique. Des approches expérimentales de neuromodulation ciblant d’autres nerfs périphériques, y compris les nerfs pudendal et péronéal, sont^étudiées 3,4,5,6.

Bien que la neuromodulation soit utilisée dans le traitement des maladies de la vessie et de l’intestin depuis plusieurs décennies, son mécanisme d’action n’est pas entièrement compris. Comme indiqué dans la revue du groupe d’experts multidisciplinaire, les paramètres de stimulation actuellement utilisés ont été principalement choisis par les fabricants sur la base d’une approche par essais^{et erreurs 7}. Il est donc important de continuer à utiliser des modèles animaux pour élucider les voies sous-jacentes et optimiser les paramètres de stimulation afin d’améliorer l’effet thérapeutique. Plusieurs expériences précliniques ont été menées, utilisant des animaux éveillés et anesthésiés, notamment des souris, des rats, des moutons, des chiens et des^{chats 4}. Avec des lignes directrices éthiques et des politiques de recherche à travers le monde encourageant l’utilisation d’espèces moins complexes et plus petites, les modèles de rongeurs ont été utilisés le plus fréquemment ces dernières années.

Le SNS dans les modèles de dysfonction vessiale chez le rat a principalement employé deux approches méthodologiques. La première, décrite par Zvara et al., consiste à implanter une électrode stimulante dans le foramen sacré à l’aide d’un angiocathéter ou d’une aiguille^spinale. La seconde approche nécessite l’exposition de la racine nerveuse L6 et le positionnement des électrodes stimulantes sous les nerfs L6, avec de la colle silicone utilisée pour sécuriser le contact entre l’électrode et le nerf⁹. La technique impliquant le placement d’électrodes dans le foramen sacré reflète l’approche clinique. La méthode utilisant l’exposition de la racine L6, bien que techniquement difficile, offre une localisation précise et un accès plus régulier au nerf.

Des modèles animaux rats imitant la stimulation du nerf tibial postérieur ont été décrits dans la littérature. La méthode la plus fréquemment utilisée consiste à exposer chirurgicalement le nerf tibial sur la face médiale du membre postérieur, au-dessus de la^cheville 10,11,12,13,14,15,16. Une autre méthode consiste à insèrer percutanée des électrodes à aiguille près du nerf^{tibial 17}. Cet article vise à fournir une description détaillée de la stimulation du nerf tibial à son origine, entre les muscles fessier grand et biceps fémoral, où le nerf sciatique se divise en trois branches : le nerf tibial, le nerf péronier commun et le nerf sural. De plus, cette étude introduit la stimulation du nerf péronique comme un nouveau modèle animal pour étudier une nouvelle méthode de neuromodulation. La pertinence translationnelle de ce modèle de rats est confirmée par l’introduction clinique récente de la stimulation du nerf péronien pour la neuromodulation de la^{vessie 18,19}.

Protocole

Les animaux étaient hébergés à l’établissement de soins animaliers de l’Université du Danemark du Sud, conformément aux directives institutionnelles. Toutes les expériences animales ont été réalisées conformément au guide des National Institutes of Health pour les soins et l’utilisation des animaux de laboratoire. Le Comité d’éthique de l’Inspection danoise des expériences animales a approuvé les procédures d’étude (Protocole n° 2022-15-0201-01158). Les réactifs et l’équipement utilisés sont listés dans le tableau des matériaux.

1. Préparation des électrodes

REMARQUE : Pour la stimulation tibiale, péronière et nerveuse L6, des électrodes bipolaires en forme de crochet ont été^{utilisées 20}. Les étapes suivantes fournissent une brève description de la conception et de la construction des électrodes.

1. Coupez deux fils d’argent de 125 μm recouverts de polytétrafluoroéthylène (PTFE) de longueur égale et torsadez-les ensemble.
2. Retirez 4 à 5 mm de PTFE d’une extrémité des fils, coupez uniformément les extrémités exposées, puis pliez les pointes vers le haut sur une aiguille de 23 G pour former deux crochets parallèles espacés de 2 mm.
3. Fixez l’électrode sur une plaque et positionnez les crochets vers le haut, s’étendant au-dessus du bord de la plaque.
4. Mélangez la colle silicone à deux composants pendant 5 secondes. Appliquez une goutte de 1 à 2 mm des crochets et laissez sécher environ 5 minutes.
5. Retirez une section de 1 à 2 cm de revêtement en PTFE à l’extrémité opposée de l’électrode pour permettre la connexion au stimulateur.

2. Préparation animale

REMARQUE : Dans des conditions stériles, des cathéters PE-50, dont l’extrémité était élargie par la chaleur, étaient implantés dans le dôme de la vessie des rats Sprague-Dawley femelles (250–300 g) et fixés par une suture de cordon à bourse. L’extrémité distale du tube était externalisée au dos de l’animal et enroulée dans une poche sous-cutanée²¹. Cinq jours ont été accordés à la vessie pour récupérer après l’opération.

1. Anesthésiez l’animal avec de l’uréthane (1,5 g/kg, intrapéritonéale) (selon les protocoles approuvés par l’institution). Administrez de l’uréthane en trois doses divisées à des intervalles de 15 minutes, environ 2 heures avant le début de l’expérience.
2. Transférez l’animal sur une bouillotte et placez-le en position couchée.
3. Pour la stimulation des nerfs tibial et péronier, raser le membre postérieur du rat autour de la région de la cuisse ainsi que la moitié inférieure du dos. Placez la queue et une seringue de 5 mL sous le membre postérieur gauche du rat et fixez la queue et la patte comme illustré à la Figure 1A.
4. Pour le SNS, raser le dos du rat de la queue jusqu’à la colonne thoracique et placer un tube centrifuge de 50 mL sous l’abdomen pour relever la région lombaire et sacrée.
   REMARQUE : Toutes les expériences de neurostimulation représentent des procédures non liées à la survie. Utilisez des techniques chirurgicales propres.

3. Dissection des nerfs péronien et tibial et implantation des électrodes

1. Utilisez un scalpel pour réaliser une incision de 3 à 3,5 cm au centre entre l’articulation du genou et la tubérosité ischiale (Figure 1B).
2. Séparez la peau du muscle en glissant les ciseaux sous la peau et en coupant le tissu conjonctif.
3. Écartez la peau à l’aide de rétracteurs et exposez le fascia reliant le grand fessier aux muscles du biceps fémoral (Figure 1C).
4. Utilisez des ciseaux droits pour couper le fascia et disséquer l’espace entre le grand fessier et le biceps fémoral jusqu’à ce que le nerf sciatique soit visualisé (Figure 1D,E).
5. Repositionnez les écarteurs sur le biceps fémoral pour obtenir une bonne exposition du nerf sciatique et de ses branches – les nerfs tibial, péronier et sural (Figure 2A). Dans ce contexte, « nerf péronien » fait référence au nerf péronien commun avant sa division en nerfs péroniers profonds et superficiels. Le nerf tibial est la plus grande branche ; Le nerf sural est le plus petit et le péronier a un diamètre intermédiaire.
6. Séparez le nerf péronien du tissu conjonctif environnant à l’aide de pinces courbées et de microciseaux. Ensuite, utilisez une microforceps pour étaler délicatement le tissu des deux côtés et en dessous afin d’isoler une section de 5 mm de long du nerf. Répétez la même procédure avec le nerf tibial pour la stimulation du nerf tibial (Figure 2B).
   REMARQUE : Évitez d’écraser le nerf en le soulevant avec la pince et réduisez au minimum les tiraillements sur le nerf.
7. Réalisez une incision de 5 mm de long sur la moitié inférieure du dos à l’aide d’un scalpel et faites glisser un hémostat sous la peau à travers l’incision pour créer un canal sous-cutané. Avancez prudemment l’hémostat jusqu’à ce que la pointe émerge à l’incision du membre postérieur (Figure 2C).
8. À l’aide de l’hémostat, saisissez l’extrémité décrochée de l’électrode et retirez lentement l’instrument à travers l’incision située dans la moitié inférieure du dos. À l’aide de deux pinces, pliez l’autre extrémité de l’électrode (extrémité crochue) à un angle de 90° par rapport au plan sous-cutané et assurez-vous que les crochets de l’électrode sont positionnés adjacents et perpendiculaires au nerf (péronier ou tibial) (Figure 2D).
   REMARQUE : Un bon positionnement de l’électrode est important pour éviter d’étirer le nerf.
9. Utilisez des micropinces courbes pour soulever le nerf et faites glisser les crochets de l’électrode sous le nerf. Mélangez la colle en silicium à deux composants pendant 5 s, utilisez un coton-tige pour sécher le nerf, puis appliquez suffisamment de colle pour recouvrir les crochets et la zone adjacente au nerf (Figure 2E–G).
   REMARQUE : Avant d’appliquer de la colle, connectez les électrodes au stimulateur et stimulez le nerf au niveau du seuil moteur pour confirmer le bon positionnement de l’électrode. Le seuil moteur a été déterminé comme la tension minimale requise pour provoquer un mouvement phasique du pied constant. La stimulation du nerf péronien génère une flexion dorsale phasique du pied, tandis que la stimulation du nerf tibial engendre une flexion plantaire. En l’absence de réponse motrice à la stimulation, vérifiez la connexion entre le stimulateur et l’électrode.
10. Placez une suture de maintien en nylon 5-0 dans le tissu conjonctif à l’incision arrière, en laissant les deux extrémités suffisamment longues. Ces extrémités servent à fixer l’électrode en place, assurant un positionnement stable.
11. Fermez la peau au niveau de l’incision du membre postérieur à l’aide d’une suture Vicryl 4-0.

4. Exposition du nerf L6 et implantation de l’électrode

1. Utilisez un scalpel pour réaliser une incision médiane de 4 à 5 cm au-dessus de la région lombaire et du sacrum. Placez des écarteurs pour ouvrir l’incision, exposez les muscles du dos sous-jacents et les extrémités des processus épineux vertébraux (Figure 3A).
2. Palper la crête iliaque et l’utiliser comme point de repère pour localiser les processus épineux de L6. On peut l’identifier comme le premier processus épineux situé juste sous la crête iliaque (Figure 3B).
3. Utilisez des ciseaux pour enlever le fascia au-dessus des vertèbres de L5 à S2. Ensuite, isolez et détachez soigneusement les muscles paravertébraux de façon bilatérale afin d’exposer les processus épineux, les lamines et les processus articulaires. Retirez le tissu conjonctif et le muscle restants avec des microciseaux jusqu’à ce que les structures osseuses soient clairement visibles (Figure 4A,B).
   REMARQUE : Cela crée une fenêtre anatomique qui expose des points de repère et donne accès au tronc nerveux L6. Identifier l’articulation facettaire postérieure de L6 ; le tronc nerveux L6 passe caudal jusqu’à cette articulation. Identifiez également le sacrum et les articulations sacro-iliaque. Le tronc nerveux L6 est situé en caudal et en milieu médial à cette articulation (Figure 4B).
4. Utilisez un rongeur pour retirer soigneusement le processus épineux de S1 et casser et retirer progressivement de petits fragments de l’os sacré dans la région entre les vertèbres S1 et S2 afin d’exposer le tronc nerveux L6 (Figure 4C).
5. Séparez le nerf L6 du tissu environnant à l’aide de pinces courbées et de microciseaux. Branchez le nerf à une électrode en fil d’argent recouverte de PTFE bipolaire et isolez-le du tissu environnant à l’aide d’une colle silicone biocompatible, comme décrit à l’étape 3.9 (Figure 4D).
   REMARQUE : La stimulation du nerf L6 génère la contraction des muscles du plancher pelvien et un tressaillement de la queue.
6. Répétez la même procédure de l’autre côté pour la stimulation nerveuse bilatérale.
7. Fermez la peau avec une suture 4-0 Vicryl.

5. Insertion d’une électrode stimulante dans le foramen sacré

1. Utilisez un scalpel pour faire une incision médiane au-dessus du sacrum et utilisez des écarteurs pour ouvrir l’incision et exposer les muscles du dos sous-jacents.
   REMARQUE : Palper la crête iliaque comme mentionné à l’étape 4.2 pour localiser les points de repère L6/S1.
2. Séparez les muscles paravertébraux des processus épineux à l’aide d’une dissection contondante. Repositionnez les rétracteurs sur les muscles pour exposer les processus épineux et faciliter l’accès au foramen sacré S1 (Figure 5A).
3. Identifiez l’emplacement du foramen S1, qui se trouve caudal et latéral au processus épineux S1. Sonder le foramen sacré S1 avec une aiguille de calibre 18 préchargée de l’électrode monopolaire (Figure 5B).
   REMARQUE : Un fil d’acier inoxydable recouvert de PTFE de 180 μm est utilisé, avec 5 mm d’isolant retiré des deux extrémités.
4. Positionnez la pointe de l’aiguille au niveau du foramen S1, en la gardant parallèle à la colonne vertébrale et inclinée d’environ 30° par rapport au dos de l’animal. Avancez doucement le fil le long de la trajectoire nerveuse tout en retirant lentement l’aiguille. Répétez la procédure sur le foramen S1 controlatéral pour la stimulation bilatérale.
   REMARQUE : Pour confirmer le bon positionnement de l’électrode, connectez l’extrémité distale du fil au stimulateur. La stimulation électrique génère un spasme de la queue.
5. Fixez les fils au processus épineux adjacent (L6) à l’aide d’une suture Vicryl 5-0 (Figure 5C).
6. Réalisez une incision de 1 cm à l’arrière du cou avec un scalpel et créez un tunnel sous-cutané à l’aide d’un hémostat depuis l’incision à l’arrière du cou jusqu’à l’incision au niveau sacré.
7. Faites passer l’extrémité distale du fil à travers le tunnel et extériorisez-la à l’arrière du cou (Figure 5D).
8. Fermez le fascia et la peau au niveau sacré, ainsi que la peau à l’arrière du cou, en utilisant la suture 4-0 Vicryl.

6. Enregistrement de la cystométrie

1. Après 5 jours, avant d’effectuer les expériences de stimulation, externalisez le tube de PE-50 et connectez-le au transducteur de pression et à la pompe d’infusion.
2. Infusez la vessie en continu à un rythme de 3 mL/h pendant 2 heures afin de permettre la stabilisation des paramètres de la vessie.
3. Évaluer les paramètres de cystométrie, y compris la pression de base, la pression seuil, la compliance de la vessie, la pression de mictionnement et la capacité de la vessie avant, pendant et après la stimulation nerveuse à l’aide d’une seule perfusion intravésicale²¹ à cycle de miction.
4. À la fin de chaque expérience, conformément aux normes éthiques, on euthanasie les animaux par surdose anesthésique.

Résultats

Pour démontrer le plan expérimental visant à évaluer l’effet de la neuromodulation sur la fonction des voies urinaires inférieures, une étude a été présentée dans laquelle la stimulation du nerf péronien a été appliquée dans un modèle de rat de suractivité vésicale induite par une infusion intravésicale d’acide acétique à 0,5 %. La fonction de la vessie a été enregistrée à l’aide d’une cystométrie du cycle de mictionnement unique avant, pendant et après la stimulation (Figure 6 A,B

Discussion

Cet article fournit une description détaillée des méthodes chirurgicales pour l’implantation d’électrodes pour la stimulation des nerfs sacré, tibial et péronique chez un rat anesthésié.

L’implantation d’une électrode de plomb dans le foramen sacré pour une stimulation continue à faible amplitude du nerf sacré S3 est un traitement largement accepté du dysfonctionnement des voies urinaires inférieures (LUT) et de l’incontinence fécale. Chez les patients, l’élec...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
18 G disposable injection needle	KRUUSE	121282
Dumont forceps style 5TM	DUMONT	1708-5TM-PO	Courbé
Dumont forceps style 7XL	DUMONT	0508-7XL-PO	Courbé
Grass SD9 square pulse stimulator	Somatco	1077/183
Hemostat	Fine Science Tools/Teleflex	13018-14/PO181059	≥ 14 cm, fine tip
Iris scissors	World Precision Instruments	14218	Ciseaux droits
Kwik-Sil silicone Elastomer	World Precision Instruments	KWIK-SIL	Colle à deux composants
Micro Adson forceps	World Precision Instruments	501245
Microscissors	S&T	SAC-15 R-8	pointe courbée ≤ 10mm de long
NaCl 0,9% 100 mL	B.Braun	N/A
PE-50 tubing	Instech	BTPE-50
Prolene 5-0 suture	Ethicon	EH7257
Rongeur	George Tiemann & Co	160-424-08	pointe fine et courbée
Surgical Scalpel	Swann-Morton	0505
Urethane	Sigma-Aldrich	U2500
Vicryl 4-0 suture	Ethicon	V451
Vicryl 5-0 suture	Ethicon	V303
Wire Silver Teflon-coated 0.125 mm	World Precision Instruments	AGT0525
Wire Stainless Steel Teflon-coated 0.18 mm	World Precision Instruments	SST30407-50