Bex-plex permet la visualisation simultanée des marqueurs protéiques et des transcrits d’acides ribonucléiques pour un profilage spatial profond de tissu intact

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour combiner la coloration itérative des protéines (IBEX) avec la technologie d’hybridation in situ par ARNscope pour le phénotypage spatial profond de tissus fixes et congelés intacts pour des applications de profilage spatial à haute résolution.

Abstract

Ici, nous présentons un protocole permettant un profilage spatial simultané des marqueurs de protéines et d’acides ribonucléiques (ARN) à une résolution unicellulaire dans des tissus intacts. L’un des problèmes fondamentaux entourant les cancers des tumeurs solides est l’incapacité à prédire la réactivité du patient à une intervention thérapeutique. Déchiffrer ces complexités nécessite une mesure quantitative des comportements cellulaires, des interactions et des phénotypes au sein de tissus intacts. Plus précisément, le protéome et le transcriptome fournissent des informations qui se chevauchent mais non redondantes et peuvent être essentielles à la conception d’immunothérapies rationnelles. Cependant, il n’existe actuellement pas de moyen simple et rentable de profiler en profondeur à la fois l’état transcriptionnel et fonctionnel de toutes les cellules du microenvironnement tumoral tout en conservant leurs informations critiques de localisation spatiale. À cette fin, nous avons réussi à combiner la plateforme IBEX (itération whiteing, extend multiplexity) avec HiPlex RNAscope afin de visualiser simultanément les marqueurs protéiques à haute teneur de plex et les transcrits d’acide ribonucléique (ARN) à haute teneur en plex avec une résolution monocellulaire. Cette approche intègre une étape modifiée de récupération de cible d’ARN afin de préserver la morphologie nucléaire et de permettre un alignement précis de l’image entre les cycles. « Bex-Plex » nous permet d’exécuter un protocole IBEX non modifié sur des tissus figés figés, suivi du protocole HiPlex RNAscope, dans lequel nous utilisons une récupération d’ARN modifiée pour assurer un alignement au niveau nucléaire avec les cycles IBEX. Ce protocole est optimisé pour les tissus figés et figé et permet une analyse spatiale intégrée des états cellulaires transcriptionnels et fonctionnels. La capacité de profiler à ce niveau unicellulaire fournit non seulement une source profonde d’informations sur le tissu lui-même, mais peut aussi permettre des prédictions sur les interactions cellulaires nuancées qui favorisent la réactivité thérapeutique, fournissant un cadre pour étudier la biologie spatiale dans les microenvironnements tumoraux et les systèmes apparentés.

Introduction

Depuis leur introduction en 2011, les immunothérapies contre le cancer qui réduisent la suppression des lymphocytes T cytotoxiques en bloquant les molécules de contrôle immunitaire inhibitrices telles que PDL-1 et CTLA-4 sont devenues la référence pour le traitement des tumeurs^{solides 1}. Cependant, malgré une utilisation à grande échelle chez les patients, l’efficacité clinique de ces médicaments varie considérablement car de nombreux cancers tumoraux solides présentent intrinsèquement ou finissent par générer une résistance à ces^{thérapies 2}. Dans de nombreux cas, cela est dû à la nature extrêmement hétérogène des tumeurs solides, même chez le même type^{de cancer de type 3}. Une compréhension plus approfondie des relations cellulaires qui se produisent dans les tumeurs solides est essentielle pour améliorer les modalités de traitement. Ainsi, identifier les mécanismes exacts et les interactions qui alimentent et soutiennent cette résistance est au cœur de la recherche sur le cancer. Ici, nous visons à développer une méthode permettant une analyse spatiale intégrée de l’expression des protéines et de l’ARN au sein des tissus intacts afin de mieux caractériser ces interactions cellulaires complexes.

Le microenvironnement tumoral (TME) est composé des composants cellulaires et structurels non cancéreux qui façonnent la croissance tumorale et la réponse immunitaire, y compris les fibroblastes associés au cancer, les cellules immunitaires infiltrantes, les composants vasculaires et la matrice^{extracellulaire 4}. Récemment, il est apparu que la composition et l’organisation de la TME influencent fortement la capacité des tumeurs à être permissives ou résistantes à l’infiltration immunitaire, l’un des principaux facteurs dictant la réactivité à^{l’immunothérapie 5}. Dans de nombreux cancers, un phénotype de « désert immunitaire », caractérisé par un faible nombre de lymphocytes T et la présence de populations myéloïdes fortement immunosuppressives, est corrélé à une faible réactivité aux thérapies de blocus^{par points de contrôle 6,7}. La signalisation chimiokine régit bon nombre de ces dynamiques de recrutement. Par exemple, CXCL1 et CCL2 attirent les cellules myéloïdes immunosuppressives, tandis que les axes CXCR3-CXCL9/CXCl10 recrutent à la fois des lymphocytes T cytotoxiques et régulateurs dans la^{tumeur 8}. Par conséquent, l’environnement de signalisation spécifique à une niche peut influencer fortement le phénotype et la fonction cellulaires. Par exemple, chez les patients atteints de cancer colorectal, l’axe CCL5-CCR5 contrôle la fonction suppressive des macrophages associés aux tumeurs (TAMs) et bloquer ce signal biaise la TAM vers un phénotype anti-tumorigène et est corrélé à une amélioration des réponses^{cliniques 9}. De plus, des interactions directes entre les cellules immunitaires, les fibroblastes associés au cancer et/ou les cellules tumorales via l’ICAM et le PDL-1 peuvent induire un épuisement immunitaire et une immunité antitumorale^{émoussée 10}. Ensemble, ces résultats soulignent l’importance des analyses spatiales résolues pour comprendre comment l’EMT influence l’efficacité thérapeutique.

L’imagerie immunofluorescente (FI) reste une approche fondamentale pour visualiser l’expression protéique et les interactions cellule-cellule dans les tissus. Le domaine est passé du FI conventionnel 3-4 couleurs à des flux d’imagerie à haut contenu reposant sur la coloration itérative et l’imagerie. Dans ces méthodes, de grands ensembles de données sont générés par des cycles répétés de marquage des anticorps, d’imagerie, d’inactivation ou de retrait des fluorophores afin que des marqueurs supplémentaires puissent être colorés et imagés¹¹. Literative Bleaching Extends Multiplexity (IBEX) a récemment été introduit comme une plateforme d’imagerie itérative conviviale et économique¹². Compatible avec l’utilisation d’anticorps commerciaux et de microscopes conventionnels, IBEX utilise le borohydrure de lithium (_{LiBH 4}) pour réduire la fluorescence des colorants les plus couramment utilisés sans endommager les épitopes tissulaires, permettant ainsi l’acquisition de jusqu’à 75 paramètres pour un seul^{tissu 13}. Les images obtenues à partir de cette coloration cyclique sont alignées à l’aide du logiciel open source SimpleITK pour produire des ensembles de données composites adaptés aux analyses spatiales de haute dimension.

Complémentaires au phénotypage au niveau protéique, les méthodes transcriptomiques spatiales peuvent fournir des informations précieuses sur l’état transcriptionnel des cellules dans leur environnement naturel. Notamment, l’hybridation in situ (ISH) est une technique populaire permettant d’identifier la localisation de séquences d’ADN ou d’ARN dans un tissu^{spécifique 11}. L’ARNAscope est une approche ISH bien établie qui utilise des sondes avec une chimie Z unique pour amplifier spécifiquement les transcrits d’ARN à une seule molécule et est compatible avec de nombreux types^{d’échantillons différents 14}. En tant que plateforme largement adoptée et disponible commercialement via Advanced Cell Diagnostics (ACD), RNAscope propose des sondes validées contre une grande variété de cibles, simplifiant la conception expérimentale pour diverses applications.

Une vision plus complète de l’identité et des fonctions cellulaires peut être obtenue en combinant la détection de protéines et d’ARN au sein du même tissu. Les protéines sécrétées à courte durée de vie, telles que les cytokines et les chimiokines, ne disposent traditionnellement pas de coloration fiable par anticorps par l’IHC, mais des informations sur leur expression peuvent être obtenues par la quantification de leurs transcriptes d’ARNm. Les tentatives précédentes de co-détection de l’ARN et des protéines, telles que l’IHC chromogénique conventionnel ou le TSA-OPAL, ont été limitées par une amplification non linéaire du signal et des protocoles de récupération d’antigènes^{chronophages 15}. Comparée à ces approches, la méthode Bex-Plex permet une détection simultanée de protéines et d’ARN à haute plex tout en préservant le contexte spatial et la morphologie nucléaire pour un enregistrement d’image précis.

Nous présentons ici « Bex-Plex », un protocole qui intègre les plateformes IBEX et RNAscope pour une caractérisation simultanée et quantifiable des états transcriptionnel et translationnel des cellules au sein de leurs tissus d’origine. Dans Bex-Plex, les tissus embêtés OCT fixes suivent le protocole IBEX standard suivi d’un flux de travail RNAscope HiPlex légèrement modifié, où la récupération de cibles est effectuée à 60°C avec un temps d’incubation d'1 heure, contre 5 minutes d’incubation initiale à 99°C. Cela préserve l’architecture des noyaux, permettant un alignement précis des marqueurs fiduciaux lors de l’enregistrement des images séparées des cycles IF et ISH en un seul. Ce protocole convient particulièrement aux études nécessitant une analyse spatiale simultanée de l’expression des protéines et de l’ARN dans des tissus intacts, en particulier lorsque la disponibilité tissulaire est limitée ou lorsque la préservation de l’architecture spatiale est cruciale, comme dans l’analyse du microenvironnement tumoral ou les études de profilage immunitaire.

Utilisant des réactifs largement disponibles et compatibles avec la plupart des plateformes d’imagerie, Bex-Plex peut être réalisé par tout personnel de recherche techniquement formé, familier avec l’imagerie fluorescente et disposant d’un microscope conventionnel. Le protocole présenté ici est optimisé pour les échantillons congelés fixes. À l’heure actuelle, le protocole a été validé sur des tissus figés congelés, et une optimisation supplémentaire pourrait être nécessaire pour l’application à d’autres types d’échantillons tels que le FFPE ou des échantillons cliniques humains.

Ce flux de travail sera inestimable dans tout contexte où le tissu est limité ou précieux, comme les biopsies tissulaires ou les expériences animales avec un échantillon limité, ainsi que pour le phénotypage de cellules qui peuvent être difficiles à extraire par des techniques dissociatives. Bex-Plex fournit des informations simultanées et quantifiables sur les profils transcriptionnel et translationnel des cellules individuelles tout en conservant leur contexte spatial, des données particulièrement bien placées pour répondre aux questions sur les relations et la communication entre cellules dans leur environnement d’origine.

Protocol

Les procédures décrites dans ce protocole ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux institutionnels de l’Université de Californie, San Diego (numéro de protocole S24049). Des souris mâles et femelles âgées de 7 à 12 semaines avec un background génétique C57BL/6 et hébergées dans des conditions spécifiques sans pathogènes ont été utilisées pour ces expériences.

1. Préparation des tissus

1. Euthanasiez les souris expérimentales par des mesures primaires et secondaires approuvées (par exemple, euthanasie du CO₂ et luxation cervicale) et prélèvent les tissus d’intérêt dans des milieux complétés.
2. Préparez un nouveau stock de fixateur tissulaire en diluant une solution à 4 % de paraformaldéhyde (PFA) à 0,5 % ou 1 % de PFA dans 1X PBS. Utilisez 0,5 % de PFA pour les tissus à faible volume comme les ganglions lymphatiques et 1 % pour les tissus à plus grand volume comme les tumeurs.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est inflammable et toxique s’il est ingéré ou avalé. Manipulez avec un équipement de protection approprié et évitez le contact avec la peau ou les yeux.
3. Transférez les tissus dans une plaque de 24 puits avec 2 mL de fixateur par puits et incubez toute la nuit à 4°C.
   Note : Des temps d’incubation supérieurs à 16 heures peuvent entraîner des problèmes de surfixation.
4. Remplissez les puits d’une nouvelle plaque à 24 puits avec 1X PBS et transférez les tissus depuis la plaque fixatrice.
   Point de pause : Si nécessaire, les tissus peuvent être stockés dans un PBS 1X à 4°C pendant jusqu’à 7 jours.
5. Éliminez l’excès de graisse/débris des tissus un par un à l’aide d’une lunette de dissection et d’outils. Ajoutez un petit volume de PBS 1X directement sur le tissu pour éviter la déshydratation des tissus lors de la coupe.
6. Préparez une solution de saccharose à 30 % en poudre en diluant le bouillon de saccharose en poudre dans 1X PBS.
7. Transférez les tissus dans une plaque de 24 puits avec 2 mL de saccharose à 30 % par puits et incubez toute la nuit à 4°C pour déshydrater. Les tissus sont suffisamment déshydratés lorsqu’ils s’enfoncent au fond des puits.
8. Remplissez les cryomoules étiquetés avec de l’OCT et placez les mouchoirs un par un dans les moules. L’orientation des tissus dépendra de l’origine, mais notre recommandation standard serait que la plus grande surface soit parallèle au fond du cryomold. Assurez-vous que les tissus sont complètement immergés dans l’OCT.
9. Placez sur de la glace sèche pendant 10 minutes pour congeler et conservez à -80°C.

2. Coupe tissulaire

Remarque : Tous les réactifs et matériaux de laboratoire utilisés pour ce protocole doivent être exempts de RNase. Veillez à prévenir la contamination lors de la manipulation des glissades.

1. Endendrez les lames de microscope sans RNase avec 15 μL d’adhésif à l’alun au chrome et faites éclore pendant 1 heure à 60°C au four. Les lames recouvertes d’alun chromé peuvent être conservées à température ambiante (RT) jusqu’à un mois avant utilisation.
2. Sortez les tissus incrustés en OCT du congélateur à -80°C et placez-les dans un cryostat/cryotome à -20°C pour qu’ils s’équilibrent pendant au moins 20 minutes.
3. Coupez les tissus sur des lames recouvertes d’alun chromé à une épaisseur de 10 à 15 μm.
4. Conservez les lames avec des coupes coupées à 4°C ou, si la coloration est le même jour, laissez-les s’équilibrer avec RT. Les lames sectionnées peuvent être stockées à 4°C jusqu’à 5 jours avant utilisation.

3. Coloration des protéines

1. Dans un aquarium de trempage, faites tremper la lame à colorer dans un PBS 1X sans RNase pendant 5 minutes pour éliminer l’excès d’OCT des tissus.
2. Utilisez un stylo barrière hydrophobe pour dessiner des boîtes autour des mouchoirs sur la glissière et laissez sécher pendant 2 minutes.
3. Préparez une solution bloquante de blocage anti-récepteur FC de souris de 10 μg·mL⁻¹ dans un PBS 1X sans RNase. Ajoutez le tampon de blocage aux échantillons sur la lame, en utilisant suffisamment pour créer une bulle qui recouvre complètement le tissu (100–150 μL·^section-1).
   Note : Parfois, l’ajout de FBS ou de BSA (généralement 1–2 %) au tampon de blocage est nécessaire pour les tissus et/ou marqueurs difficiles.
4. Incubez les lames à RT dans une boîte de coloration humide pendant 1 heure, puis lavez-les en les submergeant complètement dans un bassin rempli de PBS 1X sans RNase pendant 5 minutes.
5. Préparez la solution primaire de coloration par anticorps dans un PBS 1X sans RNase, en prévoyant 100-200 μL par section tissulaire. Les dilutions standard des anticorps varient de 1:50 à 1:200, mais il est conseillé de réaliser des titrations à une seule coloration afin d’identifier le meilleur facteur de dilution pour un anticorps et/ou un type de tissu particulier. Le vortex et la pulsation font tourner les anticorps avant de pipetter pour empêcher les agrégats fluorescents.
6. Retirez les lames du lavage et évacuez doucement l’excès de liquide dans les coins des boîtes d’échantillons à l’aide d’une lingette absorbante pour éviter de diluer la solution d’anticorps.
7. Appliquez la solution d’anticorps de la même manière que la solution bloqueante, en créant une bulle sur le tissu.
8. Placez les lames horizontalement dans un four à 37°C et faites couver pendant 1 heure. Sinon, Incubate suit à la température réactive pendant 3 à 4 heures dans une boîte humide. Des protocoles IF standards déjà optimisés pour le tissu d’intérêt souhaité peuvent être utilisés. Maintenez des lames dans un environnement humide pendant l’incubation pour éviter la déshydratation. (par exemple, utilisez un essuie-tout humide au fond du bac de teinture).
9. Lavez les lames en les plongeant dans un PBS 1X sans RNASE pendant 2 minutes. Répétez deux fois pour un total de trois lavages. Si nécessaire pour votre panneau de coloration, préparez une solution secondaire anticorps de coloration dans un PBS 1X sans RNase pendant cette période. Les dilutions standard des anticorps varient de 1:500 à 1:1000, mais il est conseillé de réaliser des titrations de coloration unique afin d’identifier le meilleur facteur de dilution pour un anticorps et/ou un type de tissu particulier.
10. Évacuez tout excès de PBS sur les lames avec un essuyage absorbant et ajoutez 100 à 200 μL de solution secondaire anticorps colorante à chaque section de tissu. Placez les lames horizontalement à 37°C dans un four et faites couver pendant 30 minutes. Sinon, les lames peuvent être colorées à la température réactive pendant 1 à 2 heures dans une boîte humide.
11. Lavez les lames en les immergeant dans 1X PBS sans RNase pendant 2 minutes. Répétez deux fois pour un total de trois lavages.
12. Diluez le colorant nucléaire DAPI à une concentration finale de 0,2 μg·mL⁻¹ dans un PBS 1X sans RNASE et ajoutez 100 à 200 μL à chaque section tissulaire.
13. Incubez les lames pendant 10 minutes en RT dans une boîte humide, puis lavez une fois en plongeant dans un PBS 1X sans RNASE et en plongeant brièvement de haut en bas.
14. Évacuez l’excès de liquide des lames avec un essuyeur absorbant et ajoutez 20 à 30 μL de milieu de montage antifade à base aqueuse sur chaque section. Placez soigneusement une housse de couverture sur la lamelle, en veillant à minimiser les bulles, et laissez le support de montage durcir pendant 15 à 30 minutes.
15. Imaginez les diapositives tachées. Pour une explication plus détaillée des considérations de conception des panneaux et de l’acquisition d’images pour IBEX, voir les protocoles IBEX^12,13 publiés à l’origine.
    Point de pause : Conservez les lames montées dans le noir à 4°C pendant jusqu’à 3 jours, bien que nous recommandions de procéder immédiatement pour garantir une dégradation minimale de l’ARN.

4. Blanchiment par fluorophore et coloration itérative des protéines

1. Immergez les lames dans un PBS 1X sans RNase jusqu’à ce que le couvercle glisse facilement sans aucune force. Selon la durée de montage de la couvre-manteau, cela peut prendre jusqu’à 16 heures.
2. Pendant que les lames trempent, préparez une solution de LiBH₄ à 1 mg·mL^⁻1 dans un DI H₂O sans RNase en mélangeant doucement jusqu’à ce qu’elles soient complètement dissoutes, puis attendez 10 minutes pour son activation. L’activation s’est produite lorsque des bulles sont présentes dans la solution et que l’activité dure jusqu’à 4 heures.
   Attention : LiBH₄ est réactif à l’eau, évitez une exposition excessive de la poudre à l’humidité et éliminez correctement les déchets en conséquence.
3. Lavez les lames une fois pendant 2 minutes dans un PBS 1X sans RNase pour éliminer tout résidu de support de montage, puis pipettez 100–150 μL de la solution LiBH₄ sur chaque tissu. Faites couver dans une boîte humide pendant 15 minutes.
   Note : Selon les fluorophores utilisés pour la coloration, ce temps d’incubation peut devoir être prolongé (discuté en détail dans les articles sur les méthodes IBEX^)12,13.
4. Lavez les lames une fois en les immergeant dans un PBS 1X sans RNASE et en plongeant brièvement de haut en bas.
5. Poursuivez la coloration des lames avec des marqueurs protéiques supplémentaires en suivant les étapes 3.5 à 3.15. Il n’est pas nécessaire de re-teindre le colorant nucléaire car il ne blanchit pas avec_{LiBH 4}. Répétez la coloration des protéines si nécessaire.
   Point de pause : Les lames montées peuvent être stockées à 4°C toute la nuit avant de blanchir le dernier cycle protéine/IBEX et de passer à l’ARN.
6. Procéder immédiatement à l’RNAscope HiPlex après avoir blanchi les fluorophores du dernier cycle. Bien que jusqu’à six cycles d’IBEX standard aient été réalisés sans perte de tissu ou d’épitope, nous ne recommandons pas de dépasser trois cycles de coloration protéique pour ce protocole en raison du risque de diminution de la qualité des transcrits d’ARN sur de longues périodes.

5. Préparation des lames pour RNAscope HiPlex

1. Immergez complètement les lames dans un PBS 1X sans RNase jusqu’à ce que la couche de couverture glisse facilement sans aucune force. Selon la durée de montage de la couvre-manteau, cela peut prendre jusqu’à 16 heures. Lavez-vous une fois pendant 2 minutes dans un PBS 1X sans RNase pour enlever tout résidu de support de montage.
2. Préparez 200 mL d’éthanol à 50 %, 200 mL d’éthanol à 70 % et 400 mL d’éthanol à 100 %.
3. Allumez un four d’hybridation et réglez-le à 60°C. Diluez le réactif 10X Target Retrieval en une bouillie de travail 1X dans DI_{H 2O}sans RNASE et préchauffez-le en le mettant au four jusqu’à l’étape 5.8.
   Note : Le manque de pré-réchauffer le réactif de récupération de la cible à 60°C affectera l’enregistrement en aval des images issues des cycles séparés. Le réactif de récupération de la cible doit rester à 60°C pendant toute la durée de l’étape de récupération.
4. Immergez les lames dans 50 % d’éthanol. Incuber pendant 5 minutes en temps de réanimation.
5. Retirez les lames du 50 % d’éthanol et plongeez-les dans 70 % d’éthanol. Incuber pendant 5 minutes en temps de réanimation.
6. Retirez les lames de l’éthanol à 70 % et plongez-les dans de l’éthanol à 100 %. Incubez pendant 5 minutes à la RT et répétez avec de l’éthanol frais à 100 %.
7. Retirez les lames de l’éthanol 100 % et laissez sécher à RT pendant 5 minutes.
8. Ajoutez 100 à 150 μL du réactif de récupération de cible 1X à 60°C à chaque section tissulaire et placez les lames dans le four d’hybridation. Incubez à 60°C pendant 1 heure.
9. Retirez les lames et rincez en plongeant dans de l’H2O DI sans RNASE pendant 15 secondes. À ce moment-là, changez la température réglée du four à 40°C.
10. Transférez les lames à 100 % d’éthanol et incubez pendant 5 minutes, puis séchez à la RT pendant au moins 5 minutes.
11. Appliquez la Protéase III sur les lames, 1 à 2 gouttes par section de tissu. Placez les lames dans le four d’hybridation et faites couver à 40°C pendant 30 minutes.
12. Immergez les lames dans une DI H_2Osans RNase et lavez en plongeant brièvement de haut en bas. Répétez avec de l’eau distillée fraîche pour un total de 2 lavages.

6. Préparation du réactif ARNscope et hybridation par sonde

1. Préparez les crosses de sonde RNAscope HiPlex et le diluant de sonde HiPlex en les réchauffant à 40°C pendant 10 minutes dans un four ou un bain-marie.
2. Faites un bref spin à la baisse de toutes les actions 50X Probe. Préparez un mélange de sonde fonctionnel en diluant chaque sonde cible unique à 1X avec le diluant de sonde ARNscope. Prévoyez d’utiliser 50 à 100 μL de mélange de sonde par tissu et de bien le mélanger en vortexant avant utilisation. Le protocole RNAscope HiPlex peut accueillir jusqu’à 3 cycles de 4 sondes (12 sondes au total notées T1-12). Pour des conseils sur la conception de la sonde, consultez le protocole^{RNAscope 14} publié à l’origine.
3. Placez les réactifs RNAscope HiPlex Amp 1–3 et HiPlex Fluoro T1-T4 à la position RT pour qu’ils s’équilibrent.
4. Prenez les lames traitées à la protéase III et pipettez 50 à 100 μL du mélange de sonde sur chaque section de tissu. Placez horizontalement dans le four d’hybridation et faites éclore pendant 2 h à 40°C.
5. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon de lavage 1X pendant 2 minutes. Répétez avec un tampon frais pour un total de 2 lavages.
   Point de pause : Les lames peuvent être stockées dans un tampon SSC 5X à RT pendant la nuit, comme décrit dans le protocole RNAscope de l’ACD. Si ce point de pause est utilisé, notez que deux lavages de 2 minutes en tampon 1X seront nécessaires le lendemain matin.

7. Amplification de la sonde

Note : Assurez-vous que tous les réactifs sont équilibrés en RT avant de les appliquer sur les lames.

1. Ajoutez 1 à 2 gouttes de réactif HiPlex Amp1 aux lames et incubez dans le four d’hybridation à 40°C pendant 30 minutes. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon 1X Wash pendant 2 minutes. Répétez pour un total de 2 lavages.
2. Ajoutez 1 à 2 gouttes de réactif HiPlex Amp2 aux lames et incubez dans le four d’hybridation à 40°C pendant 30 minutes. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon 1X Wash pendant 2 minutes. Répétez pour un total de 2 lavages.
3. Ajoutez 1 à 2 gouttes de réactif HiPlex Amp3 aux lames et incubez dans le four d’hybridation à 40°C pendant 30 minutes. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon 1X Wash pendant 2 minutes. Répétez pour un total de 2 lavages.
4. Ajoutez 1 à 2 gouttes du réactif HiPlex Fluoro T1-T4 aux lames et incubez dans le four d’hybridation à 40°C pendant 15 minutes. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon 1X Wash pendant 2 minutes. Répétez pour un total de 2 lavages.
5. Ajoutez 3 à 4 gouttes de réactif HiPlex DAPI à chaque section de tissu et faites couver pendant 1 minute à la réchauffe au tissu.
6. Retirez le DAPI en évacuant le liquide des lames avec une lingette absorbante. Ajoutez immédiatement 100 μL de milieu de montage antidécoloré à base aqueuse (qui peut être le même que lors des étapes de coloration IBEX) à chaque section. Placez soigneusement une housse de couverture sur la glissière, en veillant à minimiser les bulles, et laissez sécher le support de montage pendant 15 à 30 minutes.
7. Procédez à l’imagerie.
   Point de pause : Les lames montées peuvent être stockées dans l’obscurité à 4°C pendant jusqu’à 3 jours, bien que nous recommandions d’agir rapidement pour garantir une dégradation minimale de l’ARN.

8. Clivage des fluorophores et hybridation itérative de l’ARN

1. Pour retirer les coulisses des glisses, faites tremper dans un tampon 4X SSC pendant au moins 30 minutes à RT. Lavez une fois en immergeant complètement les coulisses dans un tampon SSC 4X neuf et en plongeant brièvement de haut en bas.
2. Ouvrez une ampoule neuve de solution de clivage et faites un stock de travail à 10 % en diluant avec un tampon SSC 4X.
3. Placez les lames dans une boîte humide et ajoutez 3 à 4 gouttes de solution de clivage à 10 %. Incubez à RT pendant 15 minutes, puis lavez les lames en les immergeant complètement dans du PBST à 0,5 % pendant 2 minutes. Répétez avec du PBST frais pour un total de 2 lavages.
4. Pour procéder au cycle d’imagerie 2 du panel ARNscope, équilibrez le réactif HiPlex Fluoro T5-T8 avec RT.
5. Allumez le four d’hybridation et réglez la température à 40°C.
6. Ajoutez le réactif HiPlex Fluoro T5-T8 aux lames et faites couver dans le four d’hybridation à 40°C pendant 15 minutes. Lavez les lames en les immergeant complètement dans un tampon 1X Wash pendant 2 minutes. Répétez pour un total de 2 lavages.
7. Évacuez soigneusement l’excès de liquide des lames. Ajoutez immédiatement 100 μL de milieu de montage à chaque section et placez soigneusement une bâtonnet de couverture sur la culasse. Laissez le substrat de montage sécher pendant 15 à 30 minutes puis procédez à l’imagerie.
8. Répétez les étapes 8,1 à 8,7 avec le réactif HiPlex Fluoro T9-T12 pour un total de 3 cycles d’ARNscope si nécessaire. Notez que, bien que 3 cycles soient possibles avec le protocole RNAscope HiPlex, le temps supplémentaire nécessaire à la coloration des protéines avec ce protocole peut affecter la qualité de l’ARN. Par conséquent, 3 cycles ne sont pas toujours réalisables selon les transcriptions ciblées.

9. Traitement d’image

1. Traiter individuellement les fichiers bruts de chaque tour et effectuer un traitement d’image en utilisant des paramètres cohérents, y compris les réglages de soustraction en arrière-plan, les filtres de lissage et le type de transformation d’enregistrement... Les canaux doivent être nommés avec un caractère séparateur cohérent (par exemple Cycle 1 : CD45 AF532, où « : » fait la distinction entre cycle et marqueur/fluor).
2. Lancez le logiciel SimpleITK (https://github.com/niaid/sitk-ibex) et cliquez sur les extensions Imaris > SimpleITK > enregistrement affine de la pile z via le canal commun.
3. Téléchargez un fichier image de chacun des cycles multiplex et entrez le caractère séparateur pour tous les canaux nommés (par exemple « :). »
4. Sélectionnez le canal à utiliser pour l’enregistrement des images et l’image fixe à laquelle toutes les autres images seront alignées. Il est recommandé d’utiliser DAPI comme marqueur fiduciaire, bien que n’importe quel canal nommé commun entre tous les cycles puisse être utilisé.
5. Cliquez sur « Enregistrer » puis sur « Rééchantillonner et enregistrer l’image combinée ».
6. Procédez à l’analyse en aval avec le logiciel de votre choix. Pour plus d’informations sur le traitement et l’enregistrement d’images, consultez le protocole IBEX^{original 12,13}.

Results

Figure 1 : Aperçu du flux de travail Bex-Plex.
Les tissus figés figés coupés sur des lames recouvertes d’alun chromé subissent jusqu’à 3 cycles d’IBEX standard, suivis de jusqu’à trois cycles de RNAScope HiPlex, où l’étape initiale de récupération de la cible est effectuée à 60°C pendant 1 heure. Les images provenant de cycles distincts sont ensuite enregistrées et alignées à l’aide d’un marqueur fiducial (par exemple, DAPI) pour créer un ensemble de données multiplex destiné à l’analyse en aval. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Nous avons utilisé le protocole décrit ci-dessus pour profiler le microenvironnement tumoral (TME) d’un modèle murien d’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) (Figure 1). Une lignée tumorale isolée de Kras^LSL-G12D/+ ; Trp53^L/+ ; Pdx1-Cre ; Les souris^{Rosa26 YFP/YFP} (KPCY), qui développent spontanément un cancer du pancréas et reproduisent de nombreuses caractéristiques clés du PDAC humain, ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc de souris C57BL/6⁷. Les souris porteuses de tumeurs ont ensuite été traitées par une immunothérapie combinée composée d’anti--1 (i.p. 200 μg•^souris-1, RMP1-14) et anti-CTLA-4 (c.i., 200 μg•^souris-1, 9H10) administrées au jour 10 post-implantation, et poursuivies tous les 3 jours jusqu’à la fin de l’expérience. L’anti-CD40 agonistique (c’est-à-dire 100 μg•^souris-1, FGK45) a été administré en dose unique au 13e jour après l’implantation. Ensemble, nous appelons cela « FPC », comme publié précédemment7,16. Trois tumeurs par groupe expérimental ont été prélevées 16 jours après l’implantation et des coupes fixes congelées ont été montées sur des lames recouvertes d’alun chromé pour Bex-Plex.

Figure 2 : Résultats représentatifs IBEX + RNAscope (Bex-Plex).
(A) La coloration combinée IBEX et ARNscope dans les sections tumorales de l’adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC ) démontre la co-détection de cibles protéiques et ARN ainsi que l’alignement des canaux de fluorescence. Barre, 10 μm. (B) Quantification des compartiments immunitaires des cellules T (CD3+ CD11b-), macrophages (CD11b+ CD68+) et myéloïdes (CD11b+ CD68- Ly6G +/-) basée sur l’intensité des canaux des marqueurs protéiques. Les graphiques montrent la densité cellulaire moyenne pour chaque type cellulaire par groupe de traitement, n=3 tumeurs. (C) Quantification des cellules exprimant des transcrits Pdl1 et Il10 dans les compartiments immunitaires précédemment identifiés par les protéines. Les graphiques montrent la densité cellulaire moyenne par groupe de traitement, n=3 tumeurs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Un cycle de coloration protéique a été réalisé sur trois tumeurs traitées par FPC et trois tumeurs traitées par isotype afin d’évaluer les effets sur les cellules myéloïdes de la lignée entre les groupes traités. Sept paramètres ont été acquis, bien que nous nous concentrions ici sur trois marqueurs d’intérêt : CD11b, Ly6G et CD68 (Figure 2A). Après l’acquisition de l’image, les fluorophores issus de la coloration protéique ont été blanchis et une série d’ARN-scope a été réalisée à l’aide de sondes contre Il10 et Pdl1 (Figure 2A). Les images séparées ont ensuite été alignées en utilisant DAPI comme fiduciaire (Figure 2A). L’intensité moyenne quantitative de fluorescence de CD11b, CD68, Ly6G et CD3 a révélé une tendance à moins de macrophages et de cellules myéloïdes chez les tumeurs traitées par FPC par rapport aux témoins (Figure 2B). Des comparaisons quantitatives ont été réalisées sur tous les échantillons, et les données sont présentées sous forme de valeurs moyennes. De plus, le nombre de cellules exprimant Pdl1, Il10, ou une combinaison des deux transcrits dans les compartiments macrophage et myéloïde a montré une tendance à la baisse avec le traitement FPC par rapport aux témoins (Figure 2C). Ces résultats indiquent une réduction potentielle des populations cellulaires immunosuppressives après le traitement, conforme aux réponses biologiques attendues.

Figure 3 : Optimisation des conditions de récupération de cibles pour la préservation nucléaire.
(A) Image représentative d’un tissu après la récupération de la cible RT montrant un gonflement nucléaire et une morphologie indistincte. Les exemples de tailles nucléaires sont indiqués par des contours jaunes. Barre d’échelle, 40 μm. (B) Image représentative d’un tissu après une récupération modifiée de cible montrant une morphologie nucléaire améliorée avec des conditions de température ajustées. Exemples de taille nucléaire indiqués par des contours jaunes. Barre d’échelle, 40 μm. (C) Volume nucléaire moyen déterminé par segmentation basée sur DAPI sur les tissus ayant subi une récupération de cible RT (non pré-chauffée), une récupération de cible préchauffée à 60°C, ou sous des conditions IF standard sans récupération de cible. Les barres graphiques indiquent la moyenne et les barres d’erreur indiquent l’écart-type. P < 0,0001 par ANOVA unidirectionnelle ordinaire (astérisques indiquent le seuil de signification statistique) ; n = 1639 cellules par condition. (D) Cartes thermiques représentant les scores de corrélation entre trois images avant et après l’alignement de l’image. Les scores de corrélation sont affichés pour un enregistrement réussi et un enregistrement qui n’a pas coïncidé en raison de différences au niveau nucléaire.

Il est important de noter que lorsque Bex-Plex a été réalisé sans la récupération modifiée de la cible décrite, les noyaux apparaissaient agrandis avec des bords indistincts par rapport aux noyaux d’un tissu où la récupération modifiée de la cible avait été correctement réalisée (Figure 3A et B). L’utilisation du régent de récupération de cibles à température ambiante a conduit à une augmentation de 33 % du volume nucléaire moyen basée sur la coloration DAPI par rapport à la récupération de cibles réalisée avec un réactif préchauffé à 60°C (Figure 3C). Des mesures de volume nucléaire ont été obtenues à partir de champs représentatifs à travers des échantillons en utilisant une segmentation basée sur DAPI. De plus, lorsque cette étape a été réalisée à 60°C à l’aide d’un réactif de récupération préchauffé, le volume nucléaire moyen ne différait pas significativement du volume nucléaire moyen après coloration IF standard (Figure 3C). Comme DAPI est le paramètre le plus efficace à utiliser comme référence pour l’alignement d’image, cette comparaison (Figure 3) souligne l’importance cruciale des paramètres de récupération modifiés pour préserver la morphologie nucléaire. Le registre correct de l’image est indiqué par un score de corrélation d’alignement proche de 1, indiquant la similarité entre images de différents cycles (Figure 3D, avant vs réussite).

La réussite de la mise en œuvre du protocole est attestée par la préservation de la morphologie nucléaire, un signal d’ARN fort et spécifique, ainsi que par un alignement précis des canaux protéiques et ARN. En revanche, les résultats sous-optimaux peuvent inclure une distorsion nucléaire, un signal d’ARN faible ou diffus, et un désalignement entre cycles d’imagerie (Figure 3D, avant vs échec). Comme montré à la Figure 3C, la morphologie nucléaire doit être conservée tout au long du protocole et sera à la fois qualitative et quantitativement apparente. Avant la mise en œuvre de Bex-Plex, les utilisateurs doivent vérifier la vérité fondamentale de leurs tissus d’intérêt via une coloration séparée des protéines et de l’ARN. Cela garantit non seulement une coloration optimisée des protéines et de l’ARN pour les tissus cibles, mais fournit aussi des schémas spatiaux pertinents qui doivent être conservés lorsqu’ils sont combinés pour le Bex-Plex. Par exemple, CD11b colocalise à la fois avec CD68 et Ly6G et montre une coloration localisée dans la membrane cellulaire (Figure 2A). C’est attendu, car CD11b est un marqueur des cellules pan-myéloïdes et CD68 et Ly6G sont des marqueurs des sous-ensembles des macrophages et des myéloïdes neutrophiles. La détection réussie de l’ARN se caractérise par des signaux ponctués distincts localisés à chaque cellule, tandis que des résultats sous-optimaux peuvent se manifester par une coloration faible ou diffuse. Le signal de la sonde ARN devrait montrer une localisation dans et autour du noyau, selon la fonction du transcripte. Des marqueurs protéiques structuraux tels que la vimentine pourraient être inclus pour améliorer la résolution cellulaire de la localisation des transcrits en révélant les membranes cellulaires dans les tissus complexes. Les échantillons négatifs ou témoins devraient présenter une coloration de fond minimale et aucun signal de sonde non spécifique, confirmant la spécificité de la détection des protéines et de l’ARN.

Discussion

Le flux de travail Bex-Plex intègre la plateforme itérative de coloration protéique, IBEX, avec l’hybridation in situ par ARNscope afin de permettre la détection simultanée de protéines et de transcrits d’ARN à résolution unicellulaire. L’objectif principal de ce protocole est de fournir une méthode reproductible pour l’analyse spatiale intégrée de l’expression des protéines et de l’ARN au sein de tissus intacts. La capacité à mesurer à la fois l’expression des protéines et de l’ARN dans le même tissu a déjà posé des défis techniques : coûts élevés, étapes complexes de récupération d’antigènes, capacité de multiplexage limitée, limitations de résolution (non cellule unique), amplification non linéaire du signal et vastes pipelines de bioinformatique pour le traitement en ^{aval 17, 18, 19}. Comparé aux approches existantes telles que l’immunofluorescence multiplex, la coloration OPAL/TSA et les plateformes de transcriptomie spatiale, Bex-Plex permet une détection simultanée reproductible, quantitative et à haute plex tout en préservant le contexte spatial et la morphologie nucléaire pour un alignement précis de l’image. De plus, Bex-Plex peut être réalisé dans un environnement de laboratoire standard et génère des données à une résolution de cellule unique qui est simple à traiter. Tirer parti de ce protocole pour acquérir une compréhension globale des interactions cellulaires dans divers contextes tissulaires, comme dans le microenvironnement tumoral, sera essentiel pour développer des immunothérapies plus efficaces et améliorer les résultats des patients à travers les états pathologiques.

Notre méthode est réalisée sur des tissus fixes intégrés dans l’OCT et suit le flux de travail standard IBEX sans modification, suivi d’un protocole RNAscope HiPlex légèrement modifié. Une différence clé réside dans l’étape de récupération de la cible au début du flux de travail d’hybridation ARN : au lieu des 99°C du fabricant pendant 5 minutes, la récupération est effectuée à 60°C pendant 1 heure. Cet ajustement préserve l’architecture nucléaire, impérative pour un alignement précis des images entre les cycles des protéines et de l’ARN. Les étapes critiques de ce protocole incluent le maintien d’une température de récupération de la cible constante, un blanchiment efficace par fluorophore utilisant LiBH₄, et la minimisation de la dégradation de l’ARN grâce à un traitement rapide et à l’utilisation de réactifs sans RNase. Il est primordial de garantir l’utilisation de réactifs de récupération de cibles préchauffés à 60°C ; Ne pas le faire peut provoquer un gonflement nucléaire même avec l’étape d’incubation modifiée.

Bien qu’il ait été démontré que 15 minutes d’incubation avec_{LiBH 4} suffisent à inactiver de nombreux fluorophores couramment utilisés, il est recommandé de vérifier individuellement ce processus pour chaque cycle protéique avant d’exécuter l’ensemble du protocole Bex-Plex. Dans les premières publications IBEX, il est bien expliqué que tous les fluorophores compatibles IBEX ne sont pas également^{blanchissables 12}. De plus, notre laboratoire a observé que certains marqueurs structurels à forte abondance comme la vimentine peuvent nécessiter un temps de blanchiment plus long. Confirmer que les combinaisons fluorophore et marqueur utilisées blanchissent adéquatement devrait éviter la fuite de signaux résiduels dans les cycles protéiques et ARN ultérieurs. La page de la communauté IBEX propose d’excellentes ressources pour la conception de panneaux compatibles IBEX et vise spécifiquement à réduire la charge sur les nouveaux utilisateurs en indiquant l’efficacité des anticorps et le blanchiment fluorophore^{multiplié par 20}. De plus, la coloration itérative et le blanchiment ne devraient pas affecter la qualité des transcrits d’ARN, cependant il est important de compléter les cycles protéiques aussi rapidement que possible et d’utiliser des réactifs sans ARNase pour minimiser toute dégradation de l’ARN qui pourrait survenir au fil du temps. Le non-respect de cette mesure affectera l’hybridation de la sonde et entraînera une diminution du signal pour tout cycle d’ARNscope réalisé, en particulier pour les transcrits à faible abondance. Les problèmes courants rencontrés lors du protocole incluent un signal d’ARN faible, un blanchiment fluorophore incomplet et un désalignement entre les cycles d’imagerie, qui peuvent être atténués par l’optimisation des conditions de coloration et des paramètres d’imagerie.

Il est impératif de limiter le temps entre la coloration des protéines et l’hybridation par sonde ARN à moins de 5 jours. Lors de la réalisation de Bex-Plex sur plusieurs lames, il est fortement conseillé de traiter une lame à la fois afin de réduire la variabilité de la dégradation de l’ARN. De même, limitez le temps entre l’hybridation de la sonde et l’imagerie. Bien que nous ayons réussi à imager jusqu’à 3 jours après l’amplification, une conservation plus longue n’est pas recommandée. S’il y a une diminution du signal après plusieurs cycles de coloration ou d’hybridation, il peut être nécessaire d’augmenter la vitesse tout au long du protocole. Idéalement, nous recommandons de travailler aussi rapidement que possible, car les retards réduisent l’intégrité de l’ARN et peuvent diminuer l’amplification. D’autres approches incluent la réduction du nombre de cycles protéiques effectués pour mieux s’intégrer dans les contraintes temporelles du protocole ou la modification de la conception du panel de sondes ARN pour inclure des cibles d’abondance plus élevées. Avant de combiner IBEX et RNAscope, validez séparément les panneaux d’anticorps et de sonde pour chaque cycle afin de déterminer la qualité du signal attendue pour chaque cycle. En cas de gonflement nucléaire après la récupération de la cible, il est possible que le réactif de récupération de la cible n’ait pas été correctement préchauffé. Assurez-vous que le réactif de récupération ne refroidit pas une fois dilué et préchauffé à 60^°C et que la température reste constante pendant l’incubation sur lame d’une heure. Enfin, si l’enregistrement et l’alignement de l’image échouent en l’absence de gonflement nucléaire, cela signifie qu’il y a eu un décalage dans les paramètres d’acquisition de l’image tels que la profondeur de bits, la taille des voxels ou la position Z entre les cycles. En cas d’erreur de telle qualité, il peut être nécessaire de répéter le protocole en ajustant ces paramètres afin qu’ils soient cohérents. Ces stratégies de dépannage sont essentielles pour garantir la reproductibilité et la cohérence entre les expériences.

Les données générées par Bex-Plex permettent une vue approfondie du paysage spatial des tissus à un niveau auparavant inaccessible. Cependant, une limitation majeure de ce protocole est le fait que le nombre total de cycles itératifs protéiques possibles est inférieur à celui avec IBEX seul, en raison de la dégradation progressive de l’ARN au fil du temps. Bien que jusqu’à 6 cycles d’IBEX standard aient été réalisés, nous ne recommandons pas de dépasser 3 cycles de coloration protéique pour Bex-Plex. Malgré tout, le protocole permet le nombre maximal de cycles RNAscope et ce niveau de profondeur multiplex est suffisant pour la plupart des applications.

D’autres limitations incluent la variabilité selon les types de tissus et le potentiel d’autofluorescence ou d’artefacts de coloration pouvant affecter l’interprétation du signal. Les tissus plus fragiles peuvent supporter moins de cycles et différents types de tissus peuvent présenter des caractéristiques uniques qui influencent la coloration. Ces limites peuvent être évaluées par des colorations en cycle unique de protéines ou d’ARN et abordées avant l’exécution de Bex-Plex. Le coupage sur des lames recouvertes d’alun chromé améliorera considérablement l’adhérence des tissus et l’intégrité structurelle, mais l’autofluorescence s’avère un point de considération pour toutes les techniques basées sur l’immunofluorescence. De plus, à l’heure actuelle, le protocole n’a pas été validé dans le FFPE ou dans les échantillons cliniques humains et nécessitera une optimisation supplémentaire pour de telles applications. Cependant, étant donné que l’IBEX et l’ARNscope sont principalement réalisés sur des tissus incorporés à la paraffine fixée au formol (FFPE), il est possible que Bex-Plex puisse s’étendre à ces types d’échantillons. Une mise en œuvre réussie nécessitera une optimisation supplémentaire de la récupération des antigènes et, potentiellement, des étapes de récupération ciblée pour préserver la qualité de l’ARN.

Dans l’ensemble, Bex-Plex propose une méthode simple, économique et largement accessible pour les analyses spatiales à haute intensité de plex. Cette méthode est particulièrement adaptée à des applications telles que l’analyse du microenvironnement tumoral, le profilage des cellules immunitaires et la cartographie spatiale des interactions de signalisation. Cette vision intégrée renforce la capacité d’interroger les mécanismes de régulation immunitaire, d’hétérogénéité tumorale et de réactivité thérapeutique à travers un large éventail de modèles expérimentaux. Bex-Plex sera inestimable dans les contextes où il est nécessaire d’étudier la diaphonie qui se produit entre les cellules dans un tissu intact, comme dans le microenvironnement tumoral ou dans d’autres tissus lors de l’inflammation et de l’homéostasie. En particulier, la capacité à résoudre la dynamique spatiale de la signalisation des cytokines en sondant les transcrits de molécules à courte durée de vie conjointement avec des marqueurs protéiques phénotypiques permettra une compréhension plus approfondie des interactions cellulaires entre les états pathologiques. Les améliorations futures pourraient inclure l’augmentation de la capacité multiplex, l’intégration avec des pipelines automatisés d’analyse d’images, et l’adaptation des échantillons de biopsie clinique en élargissant le flux de travail pour inclure les tissus FFPE.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentrifuge tubes	Biopioneer	MCNT-1.5F
200 proof EtOH	Fisher Scientific	BP28184
20X SSC buffer	Invitrogen	AM9765
24 well plates
Alexa Fluor 488 anti-mouse CD11b Antibody	Biolegend	101217
Alexa Fluor 523 anti-mouse CD3e Antibody	Invitrogen	58-0032-82
Alexa Fluor 647 anti-mouse Ly6G Antibody	Biolegend	127610
Alexa Fluor 700 anti-mouse CD68 Antibody	Biolegend	137025
BD Cytofix/Cytoperm fixation and permeablization solution	BD	554722
Chrome alum gelatin	Fisher	NC1692262
Confocal microscope (e.g Leica Stellaris)
Cryomolds	VWR	25608-922
Cryostat (e.g CryoStar NX50 Cryostat)	Thermofisher Scientific	957100
Cryostat blades (e.g Leica Low Profile Disposable Blades DB80LX)	Leica Biosystems	14035843496
DAPI	Thermofisher Scientific	62248
Dissection microscope (e.g Zeiss SteREO Discovery.V8)
Dissection tools
Dry Ice
Dunk tank for slide staining (e.g Simport Scientific EasyDip Slide Staining Jars)	Fisher Scientific	22-038-489
Fluoromount-G	Fisher	OB10001
Heated water bath
Histology brushes (e.g. Ted Pella Camel Hair Brushes)	Fisher Scientific	NC2023341
Hybridization oven (e.g. HybEZ II Hybridization System)	ACD	321710
Image analysis software of choice
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen	Vector Laboratories	H-4000
Kimwipes	VWR	21905-026
Lithium borohydride	STREM Chemicals	93-0397
Micropipettes (P-10, P-20, P-200, P-1000)
Mini Microcentrifuge (e.g. Corning LSE Mini Microcentrifuge)	Corning	6770
Mouse BD Fc Block	BD	553142
No 1.5 Coverglass	VWR	48393-241
Pipette tips (P-10, P-20, P-200, P-1000)
RNAscope HiPlex Probe, mm-CD274-T7	ACD	420501-T7
RNAscope HiPlex Probe, mm-IL-10-T6	ACD	317261-T6
RNAscope HiPlex12 Reagents Kit v2 (includes detection kit, cleaving stock solution, protease reagents, target retreival reagents, and wash buffer)	ACD	324409
RNAscope Protease III	ACD	322337
RNase ZAP	Millipore Sigma	R2020-250
Simple ITK software: https://github.com/niaid/sitk-ibex
Slide staining tray/humidity chamber
Sucrose Bioxtra	Sigma	S7903-1KG
Superfrost Plus Microscope slides	VWR	48311-703
Tissue-Tek OCT	VWR	25608-930
Tween-20, Molecular Biology grade	Promega	H5152
UltraPure DNase/RNase free water	Fisher Scientific	10977023