Article de méthode

Un modèle de lésion hypoxie-réoxygénation chez les cardioïdes humains auto-assemblants

DOI :

10.3791/70310

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17 mars 2026

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1Division of Cardiology, Department of Medicine, Duke University School of Medicine, 2Department of Pathology, Duke University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les organoïdes cardiaques humains auto-assemblants (hCOs) sont un système émergent pour modéliser le développement et les maladies cardiaques humaines. Ici, une méthodologie pour générer et blesser les hCOs avec hypoxie-réoxygénation ainsi que des détails des résultats histologiques et fonctionnels attendus après une blessure sont fournis.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sans revascularisation rapide, la maladie cardiaque ischémique entraîne une perte irréversible de cardiomyocytes, la formation de cicatrices et une diminution de la fonction cardiaque. La capacité à modéliser les lésions par hypoxie-réoxygénation et à évaluer les interventions thérapeutiques potentielles dans les tissus humains est un besoin non satisfait. Les organoïdes cardiaques humains (hCOs) sont un système modèle émergent, mais commencer à travailler avec les hCOs peut être difficile en raison de leur petite taille, des exigences en culture en suspension et de leur variabilité dans l’efficacité de la différenciation. Ce protocole offre un guide convivial pour générer et maintenir des hCOs auto-assemblants dérivés de l’iPSC humain ; des méthodes pour traiter et analyser histologiquement les hCOs ; et une approche pour blesser les hCOs avec hypoxie-réoxygénation qui imite la fibrose et l’apoptose observées avec l’ischémie/reperfusion humaine. Ce protocole fournit des conseils pour utiliser les hCOs comme complément aux modèles animaux de lésions ischémie-reperfusion et pourrait être utilisé pour identifier et tester des facteurs susceptibles de favoriser la récupération myocardique humaine.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La maladie cardiaque ischémique est une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde, touchant au moins 20,5 millions de personnes rien qu’auxÉtats-Unis 1, 2, 3. Sans perfusion adéquate, une hypoxie prolongée entraîne la mort des cardiomyocytes (MC) et un dysfonctionnement du myocarde. L’ischémie myocardique se traite principalement par revascularisation par intervention percutanée, traitement thrombolytique ou pontage coronarienne. Cependant, la revascularisation est une arme à double tranchant et peut causer des dommages supplémentaires via la libération d’espèces réactivesd’oxygène 4,5. Bien que les stratégies de reperfusion aient été extrêmement efficaces, les approches pour limiter la perte de CM lors des insultes ischémiques ou après la reperfusion sont devenues plus difficiles à trouver. Bien que de nombreuses tentatives de sauvetage de tissu infarcté se révèlent efficaces dans des modèles animaux d’ischémie-réperfusion, ces mêmes thérapies n’ont en grande partie pas réussi à obtenir un bénéfice significatif dans les essais sur l’homme, ce qui soulève la nécessité de modèles humains pour évaluer les thérapeutiques épargnant ou reconstituantla MC 6,7,8,9,10,11,12.

Les plateformes humaines utilisées pour modéliser les lésions cardiaques incluent les tissus primaires et les systèmes dérivés des cellules souches pluripotentes induites par l’humain (hiPSC) 13,14. Parce que les tissus primaires sont contraints par la disponibilité des échantillons, les systèmes hiPSC sont devenus la plateforme humaine dominante pour la modélisation des maladies cardiaques, avec l’avantage distinct d’être génétiquement traitables et évolutives 15,16,17,18,19. Les cultures traditionnelles de cardiomyocytes dérivées de hiPSC 2D (hiPSC-CM) sont limitées par l’immaturité des CM résultants, l’absence d’architecture tissulaire complexe et l’incapacité à reproduire la diversité cellulaire complète présente dans le cœurhumain 15,20. Pour pallier ces lacunes, les tissus cardiaques 3D (EHT) modifiés sont de plus en plus adoptés 20,21,22,23,24,25,26. Les approches EHT consistent à mélanger des cellules cardiaques prédifférenciées dans des sphéroïdes24 ou à semer des cellules cardiaques différenciées dans des échafaudages ou des moules 21,22,27. Bien que les EHT puissent mieux modéliser les interactions cellulaires hétérotypiques et aient une maturité relativement plus élevée que les cultures 2D, les exigences pour des échafaudages ou bioréacteurs personnalisés afin de créer et maintenir des EHT limitent actuellement leur scalabilité21, 27, 28.

Les organoïdes cardiaques auto-assemblants (hCOs), ou cardioïdes, sont un nouveau et puissant système modèle humain in vitro 20,25,26,29. Les hCOs présentent plusieurs avantages. Premièrement, ils peuvent inclure plusieurs types cellulaires, notamment les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules épicardiques, sans nécessiter plusieurs protocoles de différenciationspécialisés 26,29,30. Deuxièmement, la plupart de leur différenciation se produit dans la culture en suspension 3D, ce qui rend inutiles les besoins de moules spécialisés ou de matricestissulaires 25,26,29,30. Enfin, les hCOs présentent une morphologie sphérique stéréotypée avec une cavité centrale, permettant des analyses morphologiques. Ainsi, les hCOs ont une scalabilité similaire à celle des systèmes de culture 2D tout en conservant une partie de la complexité tissulaire des EHT. Les hCOs ont été utilisés pour les tests de toxicité des médicaments, la modélisation spécifique des patients et pour modéliser des aspects du développement cardiaque 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39. Bien que prometteuses, les hCOs présentent plusieurs limites par rapport aux EHT, notamment l’incapacité à mesurer directement la force produite. De plus, il n’existe pas de population cellulaire immunitaire native dans les modèles décrits de hCO, bien qu’il soit possible de peupler les hCOs avec des macrophages. Néanmoins, les hCOs sont un système modèle humain émergent et en évolutionrapide 20,26,30,31,32,33,34,35,36,37,38,39.

À ce jour, la modélisation des lésions cardiaques avec les hCOs a été limitée. Un modèle de cryolésie a été décrit, mais les blessures sont très variables, et la nécessité de blesser individuellement les hCOs limite lascalabilité 29. Ce manuscrit décrit un protocole convivial pour générer et blesser les hCOs auto-assemblants avec une lésion par hypoxie-réoxygénation (H/R). Comparé à d’autres protocoles pour la génération de hCOs, ce protocole utilise un milieu de différenciation simplifié et intègre la stratégie de différenciation du mésoderme 2D-3D décrite par Hofbauer et al.29. Le protocole pour les blessures H/R peut être appliqué à tout moment après que les hCOs commencent à battre, ce qui se produit généralement autour du jour 8 (D8) à D11. La durée de la coagulation et de la douleur peut être ajustée entre 6 h et 24 h pour atteindre le niveau de blessure souhaité, allant de la perte minime à presque totale de la MC. De plus, les hCOs développent stéréotypiquement un noyau collagène avec des cellules Vimentin+ après une lésion H/R, qui augmente également en gravité avec la durée H/R. Ce modèle hCO à haut débit et évolutif des blessures H/R répond potentiellement à la nécessité pour les modèles humains de développer et tester de nouvelles voies thérapeutiques pour promouvoir la récupération ou la régénération de la MC après une blessure.

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Protocole

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Toutes les procédures de manipulation des lignées cellulaires humaines doivent suivre les protocoles locaux de biosécurité. Toutes les expériences ont été réalisées avec la lignée cellulaire iPSC DU11, dérivée de fibroblastes masculins nouveau-nés sains par l’installation centrale iPSC de l’Université Duke.

1. Génération de hCOs

REMARQUE : Cette section décrit un protocole standard pour générer des hCOs à partir des iPSC (Figure 1). Toutes les étapes détaillées dans ce protocole doivent être effectuées dans une hotte à écoulement laminaire pour garantir la stérilité. Voir le tableau 1 pour les recettes de médias différenciés.

JourStock ConcentrationConcentration de travailFacteur de dilutionMédias de base
D010 mM CHIR9902110 μM CHIR990211:1000RPMI-1640, 2 % de B27 moins insuline
100 mg/mL d’acide ascorbique50 μg/mL d’acide ascorbique1:2000
10 mg/mL d’Activine A60 ng/mL d’activine A1:167
D15 mM IWP2IWP2 5 μM1:1000RPMI-1640, 2 % de B27 moins insuline
100 mg/mL d’acide ascorbique50 μg/mL d’acide ascorbique1:2000
D25 mM IWP2IWP2 5 μM1:1000RPMI-1640, 2 % de B27 moins insuline
100 mg/mL d’acide ascorbique50 μg/mL d’acide ascorbique1:2000
10 mM Thiazovivine2 μM Thiazovivine1:5000
D35 mM IWP2IWP2 5 μM1:1000RPMI-1640, 2 % de B27 moins insuline
100 mg/mL d’acide ascorbique50 μg/mL d’acide ascorbique1:2000
D4IWP2 5mMIWP2 5 μM1:1000RPMI-1640, 2 % de B27 moins insuline
D6+N/AN/ARPMI-1640, 2 % de B27 plus insuline

Tableau 1 : Table des médias de différenciation. Concentrations de stock, concentrations de travail et facteur de dilution pour chaque facteur de différenciation jusqu’aux jours de différenciation 0 à 6. Préparez toutes les solutions fonctionnelles fraîches au moment de la mise en alimentation.

figure-protocol-1
Figure 1 : Schéma de la différenciation hCO. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

  1. Maintenance de l’iPSC
    1. Couvrez entièrement le fond de chaque puits d’une plaque à 12 puits avec une matrice membranaire de base au ratio 1:100, diluée dans un milieu froid DMEM/F12. Incubez les plaques traitées à 37 °C pendant 1 heure pour permettre la polymérisation. Si elles ne sont pas utilisées immédiatement, les plaques peuvent être scellées avec un film et conservées à 4 °C pendant jusqu’à 2 semaines puis incubées pendant au moins 60 minutes à 37 °C avant utilisation.
  2. Jour de différenciation -3 (D-3) : plaque des iPSC pour une différenciation ultérieure
    1. Préparez les plaques recouvertes de matrice membranaire de base comme décrit à l’étape 1.1.1.
    2. Aspirez un milieu d’entretien issu d’une culture iPSC et ajoutez suffisamment de solution de décollement cellulaire pour recouvrir entièrement les cellules (~500 μL par puits d’une plaque à 12 puits ou 1 mL par puits d’une plaque à 6 puits). Incubez à 37 °C pendant 5 minutes.
    3. Ajoutez un volume égal de support d’entretien pour iPSC dans chaque puits et tapotez doucement la plaque pour aider à détacher les cellules. Inclinez la plaque vers vous-même et pipetez doucement le fond du puits pour détacher davantage les cellules adhérentes, pas plus de 3 fois. Utilisez une pipette pour déplacer la suspension de la cellule vers un tube conique de 15 mL.
    4. Des cellules à pellets par centrifugation à 300 x g pendant 3 minutes à température ambiante dans une centrifugeuse à seau pivotant. Aspirez le surnageant et resuspendez doucement les cellules dans 1 mL de milieux d’entretien iPSC.
    5. Déplacez 10 μL de la suspension de la cellule vers un nouveau tube de microcentrifuge de 1,5 mL. Ajoutez 10 μL de bleu de Trypan et pipettez pour mélanger. Ajoutez 10 μL du mélange bleu iPSC/Trypan à l’hémocytomètre et comptez les cellules vivantes.
    6. Diluez la suspension cellulaire à une concentration finale de 100 000 à 200 000 cellules/mL dans un milieu d’entretien iPSC avec un inhibiteur ROCK (ROCKi). Ajouter 1 mL/puits de suspension cellulaire à chaque puits d’une plaque à 12 puits recouverte d’une matrice membranaire basale.
      REMARQUE : La densité de placage avant la différenciation dépend du taux de croissance d’une lignée cellulaire donnée. La densité de placage peut devoir être ajustée pour chaque ligne iPSC. La concentration en ROCKi peut devoir être ajustée selon la marque ou la formulation utilisée.
  3. Différenciation D-2 : Échange de supports pour supprimer ROCKi
    1. Échangez le support contre 1 mL de support d’entretien iPSC frais, sans ROCKi. Les cellules devraient commencer à former de petites colonies. Les colonies doivent paraître plates (Figure 2A). Si les cellules semblent ressembler à des pavés, élancées ou allongées, cela est un signe de différenciation spontanée, et l’efficacité de différenciation peut être affectée.
  4. Différenciation D-1 : Continuer à incuber les cellules sans traitement.
  5. Différentiation D0 : Début de la différenciation et induction du mésoderme
    1. À l’aide d’un microscope, vérifiez la densité cellulaire pour garantir une confluence de 70 % à 90 % (Figure 2B) au moment de la différenciation. En cas de sous-confluent, alimentez les cellules avec un support d’entretien iPSC et attendez 24 heures. Si les cellules sont trop confluentes, séparez-les comme à l’étape 1.2
    2. Préparez 12 mL par plaque à 12 puits de milieu d’induction du mésoderme D0 (10 μM CHIR99021, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 60 ng/mL d’activine A dans le RPMI-1640 avec 2 % de supplément B27 moins insuline (RB-)).
    3. Retirez le milieu existant et remplacez-le par 1 mL/puits de milieu d’induction D0 pour mésoderme. Notez l’époque de l’échange médiatique.
  6. Différenciation D1 : Spécification du mésoderme cardiaque
    1. Exactement 24 heures après l’ajout du milieu d’induction du mésoderme D0, échangez le milieu contre un milieu de spécification du mésoderme cardiaque D1 (5 μM IWP2, 50 μg/mL d’acide ascorbique en RB).
  7. Différenciation D2 : formation hCO
    1. Ajoutez suffisamment de réactif de dissociation cellulaire pour recouvrir les cellules et incubez à 37 °C pendant 5 minutes (Figure 2C). Ajoutez un volume égal de milieux mésodermiques cardiaques D2 à chaque puits et pipettez doucement de haut en bas pour libérer les cellules adhérentes. Transférez la suspension de la cellule dans un tube conique de 15 mL.
    2. Des cellules à pellets par centrifugation à 300 x g pendant 3 minutes à température ambiante. Résuspendez dans 1 mL de milieu de spécification du mésoderme cardiaque D2 (5 μM IWP2, 50 μg/mL d’acide ascorbique en RB-).
    3. Prenez 10 μL de suspension à cellules et ajoutez 10 μL de bleu de Trypan. Comptez les cellules avec n’importe quelle méthode préférée. Diluer les cellules à une concentration de 100 000 cellules/mL dans un milieu de spécification du mésoderme cardiaque D2, avec 2 μM de thiazovivine. Utilisez 10 mL de suspension à cellules par plaque d’attache ultra-basse à 96 puits.
    4. Transférez la suspension de cellules dans un réservoir de réactif de taille appropriée et utilisez une pipette multicanal pour transférer 100 μL à chaque puits d’une plaque d’attachement ultra-faible à 96 puits, pour une concentration finale de 10 000 cellules/puits.
    5. Pour induire la formation de hCO en culture en suspension, centrifugez les plaques à 500 x g pendant 5 minutes à température ambiante. Après centrifugation, il y aura une grande pellete de cellules (Figure 2D) – si cette pellete n’est pas circonscrite, répétez la centrifugation.
      REMARQUE : Toutes les cellules ne s’incorporeront pas dans le hCO, qui apparaîtra sous forme de granule cellulaire circonscrite, avec des cellules individuelles visibles à la microscopie en champ clair. Certains débris unicellulaires dans la plaque entourant le hCO sont normaux.
  8. Différenciation D3 : Ajout de médias pour diluer ROCKi
    1. Préparez 10 mL de milieu D3 (5 μM IWP2, 50 μg/mL d’acide ascorbique en RB-) par plaque. À l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 100 μL de média D3 à chaque puits, sans retirer aucun support.
      REMARQUE : À ce stade, les hCOs se seront condensés en un sphéroïde sombre et bien circonscrit. Les cellules individuelles ne seront pas visibles (Figure 2E).
  9. Différenciation D4 : Échange vers un média D4
    1. Retirez 100 μL de milieu D3 et remplacez-les par 100 μL de milieu D4 (5 μM IWP2 en RB-). Pour réduire le risque d’aspiration, inclinez la plaque vers vous à un angle d’environ 45° et tenez une pipette multicanal à un angle d’environ 90° par rapport à la paroi latérale de la plaque. Placez la pipette multicanal fermement sur la paroi latérale du puits et aspirez lentement 100 μL de milieu, en vérifiant de temps en temps les pointes de la pipette pour détecter des hCOs aspirés.
      REMARQUE : les hCOs sont en culture en suspension, et l’aspiration des hCOs lors du retrait du substrat est courante. Pour réduire le risque d’aspiration, inclinez la plaque vers vous à un angle d’environ 45° et tenez une pipette multicanal à un angle d’environ 90° par rapport à la paroi latérale de la plaque. Placez la pipette multicanal fermement sur la paroi latérale du puits et aspirez lentement 100 μL de milieu, en vérifiant intermittemment les pointes de la pipette pour détecter des hCOs aspirés.
    2. Remplacez par 100 μL de média D4.
  10. Différenciation D6 : support de maintenance hCO
    1. Retirez 100 μL du milieu D4 et remplacez-les par 100 μL de milieu D6+ (RPMI-1640 avec supplément à 2 % de B27 (RB+)).
  11. Différenciation D8
    1. Continuez à échanger le milieu tous les deux jours en retirant 100 μL et en remplaçant par 100 μL de milieu D6+ frais. Les hCOs devraient grossir, conserver des bords lisses et commencer à battre autour de D6-11 s’ils sont différenciés avec succès (Figure 2F). Les hCOs apparaîtront toujours sous forme de sphéroïdes sombres et bien circonscrits, et les cellules individuelles ne seront pas visibles.

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Figure 2 : Chronologie de la différenciation des hCO. Chronologie de la différenciation des organoïdes. (A) Colonies d’iPSC 1 jour avant l’initiation de la différenciation (D-1). Notez des colonies distinctes, d’apparence plate. (B) iPSC au jour de l’initiation de la différenciation (D0) à ~90 % de confluence. (C) Organoïde à la différenciation D2 immédiatement après la formation de l’organoïde dans une plaque d’attache ultra-basse à 96 puits. La flèche indique un exemple de cristaux IWP2 en forme d’aiguille. (D) Organoïdes à la différenciation D3. Notez une compactation organoïde significative due à la formation de jonctions cellule-cellule ; À ce stade, certains débris cellulaires non incorporés sont normaux. (E) Organoïdes à la différenciation D10. (F) La flèche indique une colonie d’iPSC avec des cellules allongées et fines à l’apparence pavée, indiquant une différenciation spontanée potentielle. Barres d’échelle = 1000 μm pour les panneaux A-E, barre d’échelle = 400 μm pour le panneau F. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

2. Collecte et fixation des hCOs pour l’immunocoloration

  1. À l’aide d’une pipette de 1000 μL dont la pointe est coupée, transférez les hCOs dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL. Une fois tous les hCOs transférés, attendez qu’ils s’enfoncent au fond du tube et retirez doucement l’excès de substrat. Lavez les hCOs 1 fois avec du PBS, attendez quelques secondes que les hCOs s’enfoncent au fond du tube, puis retirez doucement l’excès de PBS.
  2. Fixez les hCOs avec 4 % de PFA pendant 30 minutes à température ambiante.
    REMARQUE : Certains anticorps peuvent nécessiter une fixation de l’acétone ou du méthanol pour des performances optimales. Consultez les directives du fabricant.

3. Immunocoloration à montage complet

  1. Transférez le nombre désiré de hCOs fixes dans un tube microcentrifuge de 1,7 mL. Retirez la solution fixative et lavez-la avec du PBS contenant 0,1 % Tween-20 (PBS-T).
    1. Pour laver les hCOs, enlevez autant que possible l’excès de fixateur. Faites attention à ne pas déranger les hCOs au fond du tube. Ajoutez ~1 mL de PBS-T et attendez quelques secondes que les hCOs descendent au fond du tube avant de passer à l’étape suivante.
  2. Diluez l’anticorps primaire à une concentration souhaitée dans la solution colorante (sérum de veau néonatal à 10 %, 1 % de DMSO dans 0,1 % PBS-T). Ajoutez 50 à 100 μL de solution primaire d’anticorps par tube de microcentrifuge (ou un volume suffisant pour couvrir tous les hCOs de chaque tube).
  3. Incubez pendant 24 heures à 4 °C sur un shaker/rocker. Retirez l’excès d’anticorps primaire puis effectuez trois lavages d’une heure dans du PBS-T à température ambiante. Effectuez un lavage final toute la nuit sous PBS-T à 4 °C pour vous assurer que tout excès d’anticorps est éliminé.
  4. Diluez l’anticorps secondaire à une concentration souhaitée dans la solution colorante et ajoutez 50 à 100 μL de solution d’anticorps par tube de microcentrifuge (ou un volume suffisant pour couvrir tous les hCOs de chaque tube).
  5. Incubez les hCOs avec l’anticorps secondaire pendant 24 heures à 4 °C sur une plateforme de secouement. Retirez l’excès d’anticorps secondaire puis effectuez trois lavages d’une heure dans le PBS-T à température ambiante. Effectuez un lavage final toute la nuit dans PBS-T à 4 °C pour s’assurer que tout excès d’anticorps est éliminé.
  6. Pour l’imagerie montée complète, transférez les hCOs à l’aide d’une pipette de 1000 μL dont la pointe est coupée vers une lame en verre chargée positivement. Retirez l’excès de PBS-T et ajoutez quelques gouttes de support de montage pour couvrir les hCOs. Placez soigneusement un abri de couverture pour aplatir les hCOs.
    REMARQUE : Pour préserver l’architecture 3D du hCO, utilisez un joint en caoutchouc ou un ruban double face autour des bords de la glissière pour augmenter la hauteur du coulissement. L’utilisation d’un support de dégagement peut être utile pour améliorer l’imagerie via le hCO, surtout si les hCOs ne sont pas aplatis.

4. Coupe et encastrement

  1. Après fixation, couvrez les hCOs à 30 % de saccharose toute la nuit à 4 °C pour la cryoprotection. À l’aide d’une pipette de 1000 μL dont la pointe est coupée, transférez le nombre désiré de hCOs dans un moule plastique de 12 mm x 12 mm. Retirez soigneusement l’excès de solution de saccharose, en veillant à ne pas aspirer les hCOs.
    REMARQUE : Il est utile de pipeter 30 % de saccharose vers le haut et vers le bas dans la pointe avant de transférer pour éviter que les hCOs ne collent sur le côté de la pointe.
  2. Ajoutez une petite goutte d’OCT, juste assez pour couvrir les hCOs. À l’aide d’une pince fine ou d’une pointe de pipette, repositionnez doucement les hCOs dans l’OCT de façon à ce que les hCOs ne soient pas agglutinés et qu’aucun hCOs ne soit près des bords du moule. Assurez-vous que tous les hCOs soient aussi proches que possible du fond du moule afin de maximiser le nombre de hCOs présents dans une seule cryosection.
  3. Congelez cette première couche d’OCT en plaçant le moule dans une glacière en polystyrène avec une couche de glace sèche au fond. Attendez quelques minutes que l’OCT durcisse, puis déplacez la moisissure de la glace sèche vers le dessus de travail. Ajoutez de l’OCT supplémentaire jusqu’à ce que le moule soit rempli. Attends que la première couche d’OCT fonde complètement avant de revenir à la glace sèche.
  4. Conserver les hCOs congelés et intégrés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à la cryosection.
  5. Lorsque vous êtes prêt à sectionner, alignez le bloc hCO du mieux possible et commencez à couper le bloc. Placez périodiquement une section sur une glissière chargée et inspectez visuellement chaque section à la recherche de hCOs. Lorsque les hCOs sont visualisés, passez à des sections de 6 μm.
    REMARQUE : Le taux d’attrition des hCOs lors de l’incorporation et du coupement est d’au moins 10 %. Planifiez en conséquence.

5. Coupes de tissu TUNEL et immunocoloration

  1. Utilisez un stylo pap pour tracer une bordure hydrophobe autour des sections de tissu qui doivent être colorées. Le lavage se glisse une fois dans PBS 0,1 % Tween (PBS-T) pour dissoudre l’OCT.
  2. Ajoutez un tampon de blocage (10 % de sérum pour veaux néonatals, 1 % de DMSO, dans PBS-T) pendant 1 heure à température ambiante.
  3. Préparez la solution primaire d’anticorps. Commencez par la concentration recommandée par le fabricant pour l’immunofluorescence, mais la concentration peut devoir être ajustée empiriquement.
    REMARQUE : Sinon, la coloration TUNEL peut être effectuée à ce moment selon le protocole du fabricant.
  4. Retirez le tampon de blocage de la glissière. Ajoutez suffisamment de solution primaire d’anticorps pour couvrir les sections de hCO. Incubez l’anticorps primaire toute la nuit à 4 °C ou 3 heures à 37 °C. Lavez les lames 3 fois pendant 5 minutes chacune dans un bocal Coplin rempli de PBS-T à température ambiante.
  5. Préparez une solution secondaire de coloration anticorps dans un tampon de blocage, y compris DAPI ou un autre marqueur pan-nucléaire. Ajoutez suffisamment de solution secondaire de coloration par anticorps pour recouvrir les sections de hCO. Incuber à l’abri de la lumière pendant 1 h à température ambiante.
  6. Lavez les lames 3 fois pendant 5 minutes dans un bocal Coplin rempli de PBS-T à température ambiante. Monter avec un couverdissage avec le support de montage désiré.

6. Quantification de la localisation nucléaire avec CardioCount

REMARQUE : CardioCount est une méthode basée sur l’apprentissage profond pour évaluer les noyaux du CM à partir d’imagesmicroscopiques 40. Initialement développé pour évaluer le cycle du MC, CardioCount est performant pour plusieurs colorations nucléaires, y compris TUNEL40.

  1. Pour utiliser CardioCount, téléchargez le package CardioCount depuis GitHub ou importez-le sur Google Colab (https://github.com/karraresearchgroup/CardioCount.git, https://drive.google.com/file/d/13iwp9JoHPhs2ONSFkZTGxbEXCGwBFVYx/, https://drive.google.com/drive/folders/1-f9h7MvCBsiCngJnV8-f_lplAJpUeeE3). CardioCount Version 1 fonctionne sur un environnement Python 3.
  2. Exportez les images pour la quantification sous forme de fichiers individuels de 512 x 512 pixels .tif avec des canaux rouge, bleu et vert fusionnés, où le canal rouge est un marqueur nucléaire CM, le bleu un marqueur nucléaire général, et le vert un marqueur nucléaire en cycle (c’est-à-dire Ki67) ou un marqueur apoptotique (c’est-à-dire TUNEL). Créez un dossier parent dans Google Drive pour cette expérience et téléchargez les tiffs fusionnés en sous-dossier.
    REMARQUE : CardioCount a été entraîné sur des colorations nucléaires qui remplissent le noyau. Les marqueurs cycliques plus ponctués, comme Aurora B ou PH3, peuvent ne pas être compatibles avec CardioCount.
  3. Ouvre le carnet CardioCount dans Google CoLab. Exécutez Cell 1.1 pour vérifier l’accès aux unités de traitement graphique (GPU). Utilisez Cell 1.2 pour connecter CoLab Notebook à Google Drive.
  4. Exécute Cell 1.3 pour charger CardioCount et Dependences dans Google Colab. Modifier le fichier kfile pour lire le nom du chemin menant à l’endroit où le dossier PRODUCTION_LVADMLPaper_Colab_Libraries a été enregistré lors du téléchargement.
  5. Dans la cellule 2.0, modifier base_folder pour lire le nom du chemin du dossier parent contenant le sous-dossier des images à analyser. Exécutez Cell 2.0 pour lier ce dossier à CoLab.
  6. Dans la cellule 2.1.1, modifiez orig_image_folder pour qu’il corresponde au nom du dossier contenant les images à analyser. Modifier channel_to_remove pour lire le vert et modifier new_image_folder pour nommer le sous-dossier sous base_folder où toutes les images avec le canal vert supprimé (rouge/bleu) seront sauvegardées. Répétez cette étape pour supprimer le canal rouge, en veillant à modifier new_image_folder pour distinguer le sous-dossier contenant les images dont le canal rouge est supprimé (vert/bleu).
  7. Dans la cellule 2.1.2, recadrez les images en 512 x 512 pour les images rouge/bleu. Assurez-vous que le uncropped_image_folder correspond au nom new_image_folder créé à l’étape 6.6. Pour les images rouge/bleu. Nommez destination_image_folder pour désigner le sous-dossier où les images recadrées, rouge/bleu seront sauvegardées. Répétez cette étape pour recadrer les images vertes/bleues. Enfin, répétez cette étape pour recadrer les tiffs fusionnés à 3 canaux originaux logés dans base_folder.
  8. Exécutez la cellule 2.2 pour générer des cartes de probabilité. Le nom data_specific_folder le nom des images rouge/bleu et verte/bleu générées en destination_image_folder à partir de la cellule 2.1.2. Pour model_dir, saisissez le chemin du fichier vers un dossier contenant des modèles de segmentation. Pour segmenter les noyaux rouges, utilisez le modèle erg_rb_opt, et saisissez 200 pour l’époque. Renomme probmap_directory_name pour désigner le dossier où les cartes de probabilité rouge/bleue seront sauvegardées. Répétez cette étape pour les images vertes/bleues. Pour segmenter les noyaux verts, utilisez le modèle edu_mouse_bg_opt, et saisissez 100 pour l’époque.
  9. Dans la cellule 2.3.1, des cartes d’objets seront créées à partir des cartes de probabilité générées à l’étape 6.8. Le input_folder portera le nom du destination_image_folder de la cellule 2.1.2 qui contient des images de la carte de probabilité rouge/bleue générées dans la cellule 2.1.2. Nommez les output_folder où les images rouges/bleues à seuils seront stockées. Fixez un seuil de confiance pour la segmentation nucléaire (plage de 0,0 à 1,0). Run Cell 2.3.1. Répétez cette étape pour les images vertes/bleues.
    REMARQUE : Les seuils de confiance concernant les noyaux dépendront de l’ensemble de données. Commencez par un seuil de 0,9 et ajustez plus haut si c’est trop indulgent et plus bas si c’est trop strict, en fonction d’une inspection aléatoire des cartes de probabilité.
  10. Dans la cellule 2.3.2, le nombre de cellules dans les cartes d’objets générées à l’étape 6.10 sera compté et exporté dans un fichier .csv. Le count_folder portera le nom du output_folder de la cellule 2.3.1 où les images rouge/bleu à seuil sont sauvegardées. Pour exclure les objets touchant la bordure d’une image, assurez-vous que ignore_border_cells lit Vrai. Renommez csv_path sur le nom de chemin du base_folder où tous les sous-dossiers sont stockés. Modifie le nom du CSV pour qu’il reflète les comptes des objets rouges/bleus. Répétez cette étape pour les images bleu/vert.
  11. Dans la cellule 2.4, les noyaux doubles positifs verts/rouges seront comptés. Renommer img_folder avec le nom du sous-dossier généré à l’étape 6.8 qui contient des images recadrées à 3 canaux. Renommer childcell_folder en output_folder depuis la cellule 2.3.1 où les images rouge/bleu à seuil sont sauvegardés. Renommer parentcell_folder en output_folder depuis la cellule 2.3.1 où les images vert/bleu à seuil sont sauvegardées. Renommer dest_folder pour désigner le dossier où les cartes d’objets doublement positives seront sauvegardées. Renommer csv_path pour désigner le nom du chemin et le nom du fichier dans la base_folder où tous les sous-dossiers sont stockés et modifier le nom csv pour refléter les comptes des objets doublement positifs.
  12. Vérifiez la segmentation précise en comparant les décomptes de rouge, vert et double positif générés par image à l’image brute.
    1. Si CardioCount surestime systématiquement le nombre de noyaux dans une image par rapport à ce qu’un évaluateur aveuglé compterait, répétez l’étape 6.9 avec un seuil de confiance plus élevé, et répète les étapes 6.10-6.11. Si CardioCount sous-estime le nombre de noyaux dans une image par rapport à ce qu’un évaluateur aveuglé compterait, répétez l’étape 6.9 avec un seuil de confiance plus bas, et reprends les étapes 6.10-6.11.
  13. Additionner tous les décomptes pour chaque hCO pour les noyaux rouges, verts et doubles positifs. Calculez le pourcentage de noyaux cyclés comme (noyaux doublement positifs / noyaux totaux de CM rouges) x 100 pour chaque organoïde.

7. Lésion par hypoxie et réoxygénation

  1. Préparez un milieu hypoxique (119 mM NaCl, 12 mM KCl, 1,2 mMNaH 2PO4, 1,3 mMMgSO 4, 0,5 mMMgCl 2, 0,9 mMCaCl 2, 20 mM lactate de sodium, et 5 mM HEPES, pH = 6,4)5.
  2. Dans un flasque de culture cellulaire, transférez 5 mL de milieu hypoxique par plaque de 96 puits de hCO. Placez la fiole de culture cellulaire dans la chambre d’hypoxie, puis rincez avec un gaz anoxique (5 % CO2, 95 %N 2) pendant 3 minutes. Incubez à 37 °C pendant au moins 1 heure avant d’initier l’hypoxie.
  3. Retirez tous les supports des hCOs. Commencez par retirer ~150 μL avec une pipette multicanal de tous les puits. Ensuite, utilisez une pipette de 200 μL pour retirer soigneusement le reste du milieu des puits individuels, sans perturber les hCOs.
    REMARQUE : Le retrait de tous les milieux de tous les puits est essentiel pour obtenir des dommages reproductibles.
  4. Ajoutez 50 μL de milieux hypoxiaux à chaque puits. Placez la plaque de hCO dans la chambre d’hypoxie et rinçez avec du gaz anoxique (5 % de CO2, 95 % deN 2) pendant 3 minutes. Placez la chambre d’hypoxie dans l’incubateur à 37 °C pendant 6 heures.
  5. Pour initier la réoxygénation, retirez les hCOs de la chambre d’hypoxie et alimentez avec 150 μL de milieu RB+ préchauffé. Laissez au moins 3 heures de réoxygénation à 37 °C avant d’effectuer les tests en aval.

8. Essai de libération de lactate déshydrogénase

  1. Collecter 20 μL de milieux provenant des puits de hCOs blessés et non blessés au moment souhaité après avoir initié la réperfusion. Diluer 1:10 dans 180 μL de tampon de stockage de LDH (200 mM Tris-HCl (pH 7,3), 10 % de glycérol, 1 % de BSA). Conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer l’analyse. Pipette plusieurs fois pour mélanger les médiums avant la collecte
  2. Dégel des médias gelés. Ajouter 45 μL de tampon de stockage LDH à un puits d’une plaque de 96 puits à paroi noire, fond clair, pour chaque échantillon de milieu à analyser. Ajoutez 5 μL de milieu dilué 1:10 à chaque puits pour une dilution finale de 1:100. Préparez le réactif de détection de LDH en mélangeant 50 μL de mélange enzymatique de détection LDH et 0,25 μL de substrat réductase pour chaque échantillon à analyser.
  3. Ajoutez 50 μL de réactif de détection de LDH à chaque puits contenant un milieu dilué 1:100. Incubez à température ambiante, protégée de la lumière, pendant 60 minutes. Analyse du signal bioluminescent sur un lecteur de plaques compatible.

9. Imagerie calcique

  1. Préparez une solution colorante au calcium avec du RPMI-1640 sans phénol, 0,04 % pluronique et 5 μM Cal520-AM. Protégez les échantillons de la lumière.
  2. Retirez 100 μL de milieu de chaque puits destiné à l’imagerie calcique. Ajoutez 100 μL de solution colorante au calcium et incubez à 37 °C, à l’abri de la lumière, pendant 30 minutes.
  3. Retirez 100 μL de milieu de chaque puits avec un colorant calcique et remplacez par 100 μL de RPMI-1640 sans phénol. Incubez pendant 30 minutes à 1 h à 37 °C pour permettre le lavage du colorant.
  4. À l’aide d’un microscope doté de capacités d’imagerie/flux continu, placez la plaque d’attache ultra-basse à 96 puits en position de travail. Avec un objectif de 10x, identifiez la base d’un hCO et surveillez les transitoires Cal520.
  5. Capturez des enregistrements de 30 s de transitoires calciques à température ambiante. Si vous utilisez un microscope confocal, il ne sera pas possible d’imager à travers l’ensemble du hCO. Sélectionnez un plan focal près de la base du hCO, où les contours cellulaires sont visibles lors des transitoires calciques.

10. Analyse des transitoires calciques (Figure 3)

  1. L’analyse des transitoires calciques peut être réalisée à l’aide de divers logiciels d’analyse des pics. Voici des instructions pour l’analyse utilisant le plugin SpikyImageJ 41 (https://pccv.univ-tours.fr/ImageJ/Spiky/).
  2. Ajoutez cinq régions d’intérêt (ROI) de 2 x 2 pixels au gestionnaire de ROI réparties sur des cellules visibles dans chaque hCO. Veillez à ne pas chevaucher les ROI avec les noyaux cellulaires ou les frontières cellulaires, car le mouvement du hCO peut affecter l’analyse des transitoires.
  3. Dans la section Analyser > Set Mesures, sélectionnez Intensité grise moyenne. Dans le gestionnaire de ROI, sélectionnez Multi-Mesure pour capturer l’intensité grise moyenne à tous les ROI et toutes les images de l’enregistrement.
  4. Enregistrez un fichier .csv contenant l’intensité grise moyenne pour tous les ROI. Sauvegardez toutes les positions de ROI pour chaque image pour référence ultérieure.
  5. Dans un nouveau tableur, ajoutez une colonne pour les temps(s). Calculez le temps à chaque image en divisant les 30 s par le nombre total d’images, puis en multipliant par le nombre d’images. Enregistrez ceci comme une .csv éditée.
  6. Ouvrez le fichier .csv édité à Fiji et ouvrez le plugin Spike. Dans Options d’analyse, sélectionnez les paramètres d’analyse souhaités.
  7. Temps de tracé sur l’axe des X, et Intensité grise moyenne pour le ROI #1 sur l’axe des Y. Sélectionnez Analyser les pics, et confirmez l’annotation correcte de la ligne de base, du début/fin du pic et de l’amplitude du pic. Si le mauvais nombre de pics est identifié, modifiez les paramètres dans les options d’analyse, y compris l’amplitude minimale du pic à partir de la ligne de base, et commencez le seuil de pic jusqu’à ce que l’identification du pic soit réussie.
  8. Sauvegardez tous les fichiers intermédiaires. Les battements par minute (bpm) peuvent être calculés en divisant 60 par la moyenne des intervalles pic à pic pour chaque ROI.
  9. Répétez l’analyse ci-dessus pour tous les ROI par hCO.

figure-protocol-3
Figure 3 : Analyse des transients calciques. (A) La case rouge indique le bouton qui ouvre le menu déroulant pour choisir les paramètres d’analyse. (B) La case rouge indique le bouton pour tracer le temps (s) par rapport à l’intensité grise moyenne à partir d’un ROI au sein d’un hCO représentatif non blessé. (C) La case rouge indique le bouton pour sélectionner l’analyse de pic. (D) Analyse représentative des traces et pics des transitoires calciques à partir d’un hCO non lésé. Les triangles rouges indiquent le maximum de pointe, les carrés roses représentent la pente maximale pour le montage et le descendant des sommets, la case verte indique le début du pic, et la boîte bleue indique la ligne de base. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En suivant le protocole ci-dessus, on devrait produire des hCOs bien formés qui commencent à battre entre les jours de différenciation 7 et 12 (D7-12). Lorsque les hCOs mûrissent après le 25e jour, il est possible que les contractions spontanées ne soient plus visibles sans stimulation électrique. Les blessures H/R peuvent être pratiquées à tout moment après que les hCOs commencent à battre – nous pratiquons généralement une blessure sur des hCOs âgés de 15 jours (D15) ou plus tard.

...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Voici un protocole étape par étape pour générer et blesser les hCOs auto-assemblants avec H/R. Les maladies cardiaques ischémiques se caractérisent par un remodelage physiopathologique, incluant la mort des cardiomyocytes, le remodelage fibrotique, les dysfonctionnements électriques et le déclin fonctionnel. Ces perturbations sont observées dans le système modèle de hCO, incluant une augmentation des CM de TUNEL+, une augmentation de la libération de LDH, une augmentation de l...

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Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail est soutenu par R01 HL157277 (RK), AHA 24PRE1186062 (LP), F30 HL175908-01 (LP), et le programme de formation des scientifiques médicaux de l’Université Duke T32 5T32GM145449-03 (LP).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Solution d’AccutaseSigma-AldrichA6964-500ML
Anticorps anti-cardiaque troponine TAbcamEPR20266
Supplément de B-27 (50X), sans sérumGibco17504044
Supplément de vitamine B-27, sans insulineGibcoA1895602
Lecteur de plaques BioTek Synergy Neo2BioTek
Cal-520, AMAAT Bioquest21131
CardioCount V1Karra LabPMID : 38984052
Lignée cellulaire (Homo sapiens, mâle) - Ligne iPSC DU11Noyau de cellules souches de l’Université Duke
Lames de microscope chargées, verre blancVWR89500-496
CHIR 99021Tocris4423
CloneRSTEMCELL Technologies5888
Microplaques Corning 96-Well Clear Ultra Low AttachmentFisher7007
Réservoirs de pipet jetablesVWR89094-678
DMEM/F-12, HEPESGibco11330057
EVOS Fluorescent MicroscopeEVOS
Matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit Geltrex, sans LDEV, qualifiée pour cellules souchesGibcoA1413302
Activine humaine : une protéine recombinantePEPROTECH INC/Life Technologies120-14E-50UG
IWP-2STEMCELL Technologies72124
Acide L-Ascorbique (Cristallin/ACS certifié)Fisher ScientificA61-100
Anti-Vimentine pour sourisDSHBAMF-17b
mTeSR PlusSTEMCELL Technologies100-0276
Plaques de culture cellulaire multipuits &ndash ; 12 puitsVWR10062-894
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
ReLeSRSTEMCELL Technologies100-0483
RPMI 1640 MoyenGibco11875119
RPMI 1640 Medium, sans rouge phénolGibco11835-030
ThiazovivinSTEMCELL Technologies72254
Composé Tissulaire-Tek O.C.T.SAKURA FINETEK USA INC (VWR)25608-930
Microscope confocal à disque tournant ZeissZeiss

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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