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Article de méthode

Mesure de la production d’oxyde nitrique dans les cultures cellulaires épithéliales trachéales de la souris différenciées à l’interface air-liquide

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DOI :

10.3791/70311

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3 juillet 2026

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1Department of Medicine, University of Maryland School of Medicine, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Maryland School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour quantifier la production d’oxyde nitrique (NO) dans les cultures épithéliales des voies respiratoires différenciées à l’interface air–liquide (ALI) en mesurant le nitrite dans les sécrétions apicales à l’aide d’un test chimiluminescence à base de triiodures.

Résumé

Les cultures épithéliales des voies respiratoires différenciées à l’interface air-liquide (ALI) fournissent un modèle physiologiquement pertinent pour étudier la signalisation de l’oxyde nitrique (NO) dans les cellules ciliées. Ici, nous décrivons un protocole pour quantifier la production de NO en mesurant le nitrite (NO₂⁻), un produit d’oxydation stable du NO, dans des échantillons prélevés à partir de cellules épithéliales trachéales de souris différenciées par l’ALI. Les lavages apicaux, milieux basaux et lysats cellulaires sont collectés et analysés à l’aide d’un test chimiluminescence à base de triiodure couplé à un analyseur d’oxyde nitrique (NOA). Lors de l’injection dans le récipient réactionnel, le nitrite est chimiquement réduit en NO, qui est détecté par la chimiluminescence à base d’ozone. L’intensité du signal est quantifiée et convertie en picomoles de nitrite à l’aide d’une courbe d’étalonnage standard, et les valeurs sont normalisées en protéines cellulaires totales. La performance du test est validée par modulation pharmacologique des niveaux de NO. Lors d’un traitement avec le donneur de NO diéthylénétriamine NONOate (DETA-NONOate) et l’inhibiteur de la NO synthase N(ω)-Nitro-L-arginine (L-NAME), nous observons des différences significatives dans les niveaux de nitrites selon les conditions. Le signal le plus robuste et reproductible est observé dans les lavages apicaux, correspondant à la quantité de NO libérée par l’épithélium des voies respiratoires. Cette méthode détecte de manière fiable le NO dans des échantillons d’épithélios différenciés par l’IA, fournissant une plateforme in vitro précise pour quantifier la production de NO et modéliser les maladies associées au métabolisme anormal du NO.

Introduction

Une caractéristique de plusieurs maladies des voies respiratoires, notamment l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), la mucoviscidose (FQ) et la dyskinésie ciliaire primaire (DCP), est l’homéostasie altérée de l’oxyde nitrique (NO), mesurable par des variations des niveaux de NO expirés, qui peuvent varier fortement dans ces maladies, étant élevées dans la BPCO et l’asthme 1,2, tandis qu’elles sont fortement réduites dans la mucoviscité et laDCP 3. 4. Ces maladies présentent fréquemment des anomalies dans les cils mobiles épithéliaux des voies respiratoires, les principaux effecteurs du dégagementmucociliaire 5. Parce que le NO et ses voies de signalisation en aval sont des régulateurs critiques de la motilité ciliaire, comprendre comment la production et la signalisation du NO sont modifiées dans ces contextes est essentiel pour élucider les mécanismes du dysfonctionnement mucociliaire. En conséquence, une méthode permettant une détection précise de la production et de la libération de NO dans les épithélios des voies respiratoires offre un outil précieux pour disséquer la régulation et le rôle physiologique de cette molécule de signalisation. De telles approches sont particulièrement utiles dans les contextes expérimentaux où la mesure directe du NO est difficile en raison de sa courte demi-vie et de sa réactivité rapide.

Le NO régule la biogenèse et la fonction des cils des voies respiratoires en influençant la polarité cellulaire ciliée et le battement coordonné des cils mobiles 6,7,8. Cependant, les mécanismes qui maintiennent l’absence d’homéostasie dans les voies respiratoires restent incomplètement compris. Les cultures épithéliales des voies respiratoires différenciées à l’interface air-liquide (ALI) fournissent un système précieux in vitro pour étudier ces mécanismes. Actuellement, ce modèle est largement utilisé pour étudier l’impact des insultes environnementales sur l’épithéliumdes voies respiratoires 9,10,11 et pour élucider la physiopathologie des maladies des voiesrespiratoires 12. Comparés aux cultures submergéesconventionnelles 13,14, les épithélios différenciés par ALI reproduisent plus fidèlement l’architecture et la fonction des voies respiratoires natives, incluant la polarisation épithéliale, la différenciation mucociliaire et l’échange gaz-liquide réaliste, ce qui les rend particulièrement adaptés à l’étude de la libération de NO apicaux, de la signalisation et des fonctions ciliaires associées. Ce système est donc bien adapté aux expériences visant à quantifier les métabolites dérivés du NO libérés dans la lumière des voies respiratoires, en particulier dans des conditions de différenciation épithéliale ou de manipulation pharmacologique.

Une mesure précise de la concentration de NO est essentielle, car des niveaux excessifs et déficients de NO peuvent altéré la fonction ciliaire. Actuellement, les méthodes basées sur des sondes fluorescentes (par exemple, diaminofluorescéines, DAF) disponibles pour détecter le NO ne sont que semi-quantitatives et limitées par la sensibilité au pH, la dépendance à l’oxygène et le manque de spécificité, car elles peuvent réagir avec les oxydants cellulaires et les antioxydants, ce qui permet des mesuressemi-quantitatives 15. De plus, les capteurs électrochimiques (par exemple, les électrodes ampérométriques sensibles au NO) permettent la détection en temps réel duNO 16 mais peuvent être difficiles à mettre en œuvre dans des systèmes biologiques complexes en raison de l’absence de courte demi-vie, des interférences dues au biofoulement de la surface de l’électrode par espèce redox active, et des difficultés à maintenir une étalonnagestable 17. Des approches alternatives basées sur la chimiluminescence, incluant la détection directe de NO en phase gazeuse et des tests réducteurs ciblant différentes espèces d’oxydes d’azote, ont également été décrites, mais leur application aux cultures épithéliales des voies respiratoires reste inexplorée. Ces limitations soulignent la nécessité de méthodes sensibles et quantitatives capables de détecter de manière fiable de faibles niveaux d’espèces dérivées du NO dans des échantillons biologiques de petit volume. Pour surmonter ces limitations, nous avons mis en place un protocole visant à quantifier le NO dans les sécrétions apicales collectées à partir de l’épithélium des voies respiratoires différenciées par l’IA à l’aide d’un analyseur d’oxyde nitrique (NOA). Le NOA est un détecteur à base de chimiluminescence hautement sensible, traditionnellement utilisé pour mesurer les métabolites du NO dans des échantillons chimiques et plus récemment adapté à l’analyse d’échantillons biologiques, y compris le sang, les homogénates tissulaires et les surnadants en culturecellulaire 7,18,19. Le NO est une molécule de signalisation hautement réactive rapidement oxydée en nitrite dans les tissus sous des niveaux d’oxygène normaux, avec une demi-vie exceptionnellement courte. Ainsi, le nitrite en tant que produit final de l’oxydation du NO sert d’indicateur de la production totale de NO dans les systèmesbiologiques 20,21,22. Cette méthode de chimiluminescence sensible et reproductible permet de détecter le nitrite/NO aux niveauxpicomolaires 23,24, ce qui la rend idéale pour mesurer de petites variations dans des échantillons biologiques à faible volume, tels que ceux issus de cultures MTEC ALI. Cependant, cette approche convient surtout aux conditions où l’accumulation de nitrites reflète la production récente de NO et peut être influencée par des facteurs tels que la manipulation de l’échantillon, la contamination par des nitrites de fond et l’état de différenciation épithéliale. Par conséquent, des contrôles appropriés et une conception expérimentale soigneuse sont nécessaires pour garantir une interprétation précise des résultats.

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Protocole

Toutes les procédures animales ont été examinées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université du Maryland (Protocole # AUP–00004632).

REMARQUE : Le protocole nécessite environ 2 jours pour l’isolement des cellules épithéliales trachéales de souris (MTEC), suivis de 7 à 10 jours pour l’expansion, 5 à 6 jours pour la prolifération dans les inserts transwell, 21 jours pour la différenciation (temps nécessaire pour acquérir suffisamment de cellules multi-ciliées), 24 heures de traitement médicamenteux et un jour supplémentaire pour la collecte d’échantillons, ainsi que la calibration des NOA, injections et acquisition de données.

1. Préparation des médias et des solutions

REMARQUE : Consultez le tableau 1 pour les détails sur les ingrédients du support.

  1. Les médias F–12 de Ham
    1. Préparez la solution à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Ajoutez 5 mL d’antibiotiques 100× de pénicilline/streptomycine et 0,5 mL d’amphotérecine B (Fungizone) à 500 mL de milieu F12 de Ham dans une bouteille stérile.
    2. Mélangez en inversant doucement la bouteille 5 à 10 fois pour assurer un mélange complet. Filtrez, stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans des conditions stériles, et conservez-la à 4 °C.
      ATTENTION : La pénicilline/streptomycine et l’amphotéricine B sont des agents antimicrobiens pouvant provoquer des irritations ou des réactions allergiques. Manipulez avec un équipement de protection individuelle approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire.
  2. Solution pronase
    1. Ajoutez 15 mg de pronase à 10 mL de milieu F12 de Ham stérile dans un tube stérile pour obtenir une solution à 0,15 % de pronase. Mélangez en inversant doucement ou en pipettant de haut en bas jusqu’à ce que la pronase soit complètement dissoute. Préparez frais immédiatement avant utilisation.
  3. Solution DNase I
    1. Ajoutez 5 mg de DNase pancréatique brute I à 9 mL de medium F12 de Ham et 1 mL de solution sérique sérique de 10 mg/mL (BSA) dans un tube stérile pour obtenir une solution de DNase I à 0,5 mg/mL.
    2. Mélangez doucement en pipettant de haut en bas jusqu’à ce que la DNase I soit complètement dissoute, évitant la formation de bulles. Une fois complètement dissous, on aliquote la solution dans des tubes microcentrifuge stériles de 1 mL et on la conserve à -20 °C.
  4. Média F12 de Ham avec sérum bovin fœtal (FBS)
    1. Préparez la solution à température ambiante à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Ajoutez 10 mL de sérum bovin fœtal (FBS) à 40 mL de milieu F12 de Ham avec des antibiotiques dans un tube conique stérile pour obtenir 20 % de FBS dans un milieu F12.
    2. Mélangez doucement en inversant le tube 5 à 10 fois jusqu’à ce que la solution soit homogène. Filtrez, stérilisez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans des conditions stériles, et conservez-la à 4 °C.
  5. Supports d’extension MTEC
    1. Préparez le milieu d’expansion MTEC à température ambiante à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire stérile en combinant les composants listés dans le tableau 1 dans une bouteille stérile.
    2. Mélangez soigneusement en faisant doucement tourner ou en inversant le récipient jusqu’à ce que tous les composants soient complètement combinés. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans des conditions stériles.
    3. Ajouter l’inhibiteur ROCK Y–27632 (solution stock de 5 mM) à une concentration finale de 10 μM et l’inhibiteur de la sécrétase Notch γ–secretase DAPT (solution stock de 10 mM) à une concentration finale de 5 μM juste avant utilisation, puis mélanger doucement par inversion.
  6. Supports de prolifération MTEC
    1. Préparez le milieu de prolifération MTEC à température ambiante à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire stérile en combinant les composants listés dans le Tableau 1.
    2. Mélangez soigneusement par inversion douce ou en tourbillonnant jusqu’à ce que tous les composants soient complètement combinés. Filtrez pour stériliser le milieu à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans des conditions stériles.
    3. Juste avant utilisation, ajoutez l’inhibiteur de ROCK Y–27632 (solution stock de 5 mM) à une concentration finale de 10 μM et l’acide rétinoïque (solution stock de 5 μM) à une concentration finale de 0,05 μM. Mélangez doucement par inversion avant utilisation.
  7. Supports de différenciation MTEC
    1. Préparez le milieu de différenciation MTEC à température ambiante à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire stérile en combinant les composants listés dans le tableau 1 dans un récipient stérile.
    2. Mélangez soigneusement par inversion douce ou en tourbillonnant jusqu’à ce que tous les composants soient complètement combinés. Filtrez pour stériliser le milieu à l’aide d’un filtre de 0,22 μm dans des conditions stériles.
    3. Juste avant utilisation, ajoutez de l’acide rétinoïque à une concentration finale de 0,05 μM et mélangez doucement par inversion.

2. Isolement des cellules épithéliales de la trachée de la souris (MTEC)

  1. Euthanasiez trois souris adultes (âgées de 8 à 20 semaines) par inhalation de dioxyde de carbone (CO2) dans une chambre d’euthanasie approuvée selon les directives institutionnelles de l’IACUC. Confirmez le décès avant la collecte des tissus.
  2. Placez l’animal dorsalement (poitrine vers le haut) sur une surface aseptique. À l’aide de pinces propres, soulevez doucement la peau et découpez-la avec des ciseaux chirurgicaux de la lèvre inférieure jusqu’à l’abdomen pour exposer la trachée.
  3. Écartez les glandes salivaires et retirez le tissu conjonctif et le muscle trachéale pour exposer les anneaux cartilagineux. Disséquez toute la longueur de la trachée et placez-la dans une boîte de Petri contenant le médium F12 stérile de Ham. Combinez trois trachées dans un seul plat.
  4. Transférez le plat dans une hotte à flux laminaire et placez la trachée sur un autre plat avec le medium F12 de Ham’s frais. Retirez tout tissu extratrachéal et coupez la trachée longitudinalement à travers la lumière.
  5. Transférez toutes les trachées dans un tube conique à bouchon à vis de 50 mL contenant une solution stérile de 10 mL à 0,15 % de pronase. Incuber à 4 °C pendant 16 à 18 heures.

3. Isolation des cellules et expansion initiale

  1. Le lendemain, inversez le tube contenant les tissus 10 à 15 fois pour déloger les cellules épithéliales et incubez à 4 °C pendant 45 minutes. Arrêtez la réaction pronase en ajoutant 10 mL de substrat de Ham’s contenant 20 % de FBS et mélangez en inversant 10 à 15 fois.
  2. Ajoutez 10 mL de medium F12 de Ham avec FBS à trois tubes de 15 mL. Avec une pipette Pasteur, transférez séquentiellement le tissu trachéal du tube de 50 mL vers le premier, deuxième et troisième tube de 15 mL et inversez-les 10 à 15 fois dans chaque tube pour déloger les cellules épithéliales trachéales. Jetez le tissu après le transfert final.
  3. Combinez tout le média des trois tubes coniques de 15 mL avec le milieu du tube de 50 mL. Centrifugez à 360 × g pendant 10 minutes à 4 °C. Retirez soigneusement le surnageant et ajoutez 0,5 mL de solution DNase I à 0,5 mg/mL. Incubez sur glace pendant 5 minutes.
  4. Centrifugez à 360 × g pendant 5 minutes à 4 °C. Éliminez soigneusement le surnageant et remettez la pellete cellulaire en suspension dans 7 à 10 mL de milieu d’expansion MTEC.

4. Expansion et différenciation du MTEC

  1. Préparez un flacon de culture cellulaire T75 enrobé de collagène en utilisant 10 mL de collagène I (queue de rat) à 50 μg/mL et incubez à 37 °C pendant 16 à 18 heures. Aspirez la solution de collagène du flasque T75 et lavez le flasque trois fois avec du PBS (1×). Laissez la fiole sécher complètement.
  2. Semez la suspension cellulaire composée de 7 à 10 mL de milieu d’expansion MTEC contenant les cellules dans la fiole recouverte de collagène. Placez la fiole dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2. Remplacez le milieu d’expansion tous les 2 ou 3 jours et surveillez le nombre de cellules jusqu’à 70 % de confluence.
  3. À 70 % de confluence, ajoutez 1 mL de solution d’Accutase et incubez pendant 10 à 15 minutes à 37 °C pour détacher la monocouche cellulaire. Resuspendez les cellules dans 10 mL de milieu de prolifération MTEC. Centrifugez à 1057 × g pendant 5 minutes à température ambiante.
  4. Jetez le surnageant, resuspendez les cellules dans un milieu de prolifération et comptez les cellules.
  5. Graines 2 × 10cellules 5 dans un volume de 0,5 mL par insert transwell (diamètre de membrane de 12 mm, pore membranaire de 0,4 μm) pré-enduites de collagène. Ajoutez 1,5 mL de milieu dans la chambre basale de chaque insert et placez le transwell dans l’incubateur à 37 °C.
  6. Changez le milieu dans la chambre apicale et basale au 3e jour et laissez les cellules atteindre 100 % de confluence, généralement au 5e ou 6e jour. Incluez un insert sans cellules comme témoin.
  7. Une fois confluent, lavez les cellules apicalement avec 0,5 mL de milieu de différenciation MTEC. Initier l’interface air-liquide (ALI) en ajoutant 0,75 mL de milieu de différenciation uniquement à la chambre basale, laissant les cellules de la chambre apicale exposées à l’air.
  8. Tous les 2 à 3 jours, lavez les cellules de la surface apicale avec un milieu de différenciation et remplacez le milieu basal. Laissez les cellules se différencier à l’ALI pendant 21 jours.

5. Immunomarquage et imagerie des cellules épithéliales ciliées

  1. Aux jours 7, 14 et 21 de l’ALI, fixez les cellules avec 4 % de paraformoldéhyde (PFA).
  2. Effectuer un immunomarquage des cellules avec l’anticorps anti-FoxJ1 pour détecter FoxJ1, un facteur de transcription essentiel à la ciliogenèsemobile 25,26, et l’anticorps anti-acétylée α–tubuline pour détecter la α–tubuline acétylée, un marqueur structural des cils mobiles selon les protocolespubliés 27,28,29.
    ATTENTION : Le PFA est un produit chimique dangereux, il faut donc porter des EPI appropriés (gants en nitrile et blouse de laboratoire au minimum) lors de la fixation des cellules.
  3. Acquérir des images des cellules immunomarquées par microscopie confocale à l’aide d’un objectif de 40× ou 60×. Collectez des piles Z couvrant une profondeur de 10 μm avec chaque étape de 0,5 μm.
  4. Réglez la puissance du laser, le gain du détecteur et les réglages d’exposition pour éviter la saturation du signal et maintenir des paramètres d’acquisition comparables entre les échantillons.
  5. Quantifiez les cellules positives à la tubuline FoxJ1 ou acétylées en pourcentage de cellules totales (DAPI-positives) par région d’intérêt (ROI) en utilisant le plugin de compteur cellulaire dans le logiciel d’imagerie FIJI.
  6. Dans le logiciel GraphPad Prism (v. 10.0), générez des graphiques et effectuez des analyses statistiques à l’aide d’un test t de Student à deux queues après avoir évalué la distribution des données pour la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk.

6. Traitement médicamenteux de l’épithélium différencié des voies respiratoires

  1. Au jour 21 de l’ALI, préparez un milieu de différenciation (3 mL pour les cellules en trois inserts) dans un tube stérile à température ambiante.
  2. Ajoutez 7,5 μL de diéthylène triamine–NONOate ou DETA/NO à partir d’une solution d’origine de 100 mM (préparée dans 10 mM de NaOH) au milieu de différenciation pour obtenir la concentration finale de 250 μM en 3 mL. Mélangez doucement par inversion et utilisez immédiatement.
  3. Ajoutez 750 μL de la solution finale dans chacune des trois chambres basales de cellules différenciées et incubez pendant 24 heures à 37 °C.
  4. Préparez 1 mM d’ester méthylique Nω-Nitro-L-Arginine (L–NAME) en ajoutant 30 μL de la solution d’origine L-NAME de 100 mM (préparée en DMSO) à un milieu de différenciation MTEC pour un volume total de 3 mL.
  5. Ajoutez 750 μL de la solution finale à chacune des trois chambres basales et incubez pendant 24 heures à 37 °C.
  6. Ajoutez 30 μL de sulfoxyde de diméthyle (DMSO) uniquement (groupe non traité) à 3 mL de milieu basal (1 % v/v).
  7. Ajoutez 750 μL de la solution finale dans la chambre basale de trois inserts (non traités).

7. Collecte d’échantillons

REMARQUE : Pour l’analyse de l’AO, il est nécessaire de regrouper les échantillons de mieux, de lavage apical et de lysat cellulaire à partir de trois inserts.

  1. Au jour 22 de l’ALI, prélever des échantillons de l’épithélium différenciateur des voies respiratoires en commençant par 750 μL de milieux basaux provenant de chacun des trois inserts par groupe expérimental.
  2. Collecter les milieux basaux incubés dans des inserts sans cellules pour servir de témoin vierge en tenant compte d’une contamination externe éventuelle aux nitrites.
  3. Regroupez les milieux basaux de trois inserts et stockez immédiatement à -20 °C jusqu’à l’injection dans le NOA.
  4. Pour collecter le nitrite/NO présent dans le mucus apical de l’épithélium, ajoutez 50 μL de PBS (1×) pré-chauffé (stérile, aliquoté et congelé) sur les cellules de chaque insert et incubez pendant 30 minutes à 37 °C.
    REMARQUE : Pendant les 30 minutes d’incubation des cellules avec PBS pour collecter le lavage apical, le PBS peut également être ajouté dans la chambre basale pour maintenir l’hydratation des deux côtés des cellules.
  5. Collectez le PBS contenant le mucus recouvrant l’épithélium.
  6. Regroupez les lavages PBS de trois inserts pour obtenir environ 150 μL de mucus apical/PBS de chaque condition expérimentale, ce qui sera suffisant pour deux injections de NOA.
  7. Conservez les échantillons de lavage apical à -20 °C jusqu’à une utilisation ultérieure.
  8. Conservez également le tampon de lavage PBS pour l’utiliser comme contrôle vierge lors des injections de NOA.
  9. Lavez les côtés apical et basal des cellules en trois inserts avec 500 μL de PBS préchauffé deux fois.
  10. Ajoutez 500 μL de solution d’Accutase apicalement et incubez pendant 15 à 20 minutes jusqu’à ce que les cellules se détachent complètement des membranes.
  11. Une fois complètement détaché, ajoutez un média RPMI-1640 sans sérum aux cellules (au ratio 3:1 entre milieu et Accutase).
  12. Regroupez les cellules détachées des trois inserts dans un seul tube.
  13. Faites tourner les cellules à 3000 × g pendant 5 minutes à 4 °C.
  14. Resuspendez la pellete cellulaire dans 50 μL de solution de lyse (tampon RIPA + cocktail inhibiteur de protéase Halt 1×) et incubez sur glace pendant 45 minutes.
  15. Faites tourner le lysat à 14 800 × g pendant 20 minutes à 4 °C et collectez du surnageant.
  16. Utilisez 3 μL de lysat de cellule entière pour déterminer la concentration en protéines via le test de l’acide bicinchoninique (BCA).
  17. Diluez la solution de lysat restante 1:1 dans un tampon RIPA pour obtenir un volume suffisant pour deux injections de NOA de 50 μL.
  18. Conservez les lysats à -80 °C jusqu’à leur injection dans le NOA à -20 °C.
  19. Conservez le tampon RIPA utilisé pour resuspendre la granule cellulaire à -20 °C afin qu’il serve de blanc et de contrôle de la contamination pour les échantillons de lysate.

8. Calibration du NOA et injections d’échantillons

  1. Préparez un réactif triiodide en dissolvant 400 mg d’iodure de potassium et 250 mg d’iode dans 28 mL d’acide acétique glaciaire et 8 mL d’eau ultrapure.
  2. Effectuer la préparation du réactif triiodure dans une hotte chimique en utilisant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, gants et protection oculaire).
    ATTENTION : L’iode et l’acide acétique glaciaire sont dangereux et peuvent provoquer irritation et corrosion de la peau et des yeux.
  3. Conserver à température ambiante et utiliser dans les deux semaines suivant la préparation.
  4. Préparez 1 mM de solution de bouillon de nitrite de sodium dans de l’eau sans nitrites.
  5. Conservez la solution d’origine à -20 °C jusqu’à utilisation.
  6. Préparez de nouveaux standards de travail (0,125–4,0 μM) dans le PBS immédiatement avant les injections.
    REMARQUE : Pour la calibration des NOA, utilisez un PBS stérile et fortement condensé afin de minimiser la contamination aux nitrites.
  7. Activez le gaz porteur d’azote (N2) et initiez le flux de gaz à travers le système.
  8. Assemblez le récipient de purge en verre et ajoutez 4 mL de réactif triiodure dans le récipient avec 20 μL d’anti-mousse diluée à 1:10.
  9. Bouchez-le fermement avec un septum maintenu en place par le bouchon à vis pour assurer un joint hermétique.
  10. Versez 10 mL d’hydroxyde de sodium (NaOH) dans le siphon à NaOH.
  11. Sur l’écran de l’instrument NOA (nCLD 88), sélectionnez Mesure, sélectionnez Gaz et Fourne.
  12. Réglez l’instrument sur MR2:50,00, correspondant à une plage de mesure entre 0 et 50 parties par milliard de NO, et sélectionnez Rapide pour le réglage du filtre.
  13. Ajustez la pression d’azote jusqu’à ce que la pression du réacteur se stabilise entre 27 et 29 psi (186–200 kPa).
  14. Ouvrez le logiciel de graphiques eDAQ sur l’ordinateur connecté au NOA.
  15. Réglez la plage d’acquisition à 10/s et la tension à 10 V.
  16. Naviguez dans Configuration > Paramètres de chaîne, sélectionnez Canal 1.
  17. Réglez l’échelle d’affichage à 2:1 sur le logiciel NOA.
  18. Commencez l’acquisition des données sur l’instrument NOA et dans le logiciel.
  19. Surveillez la base jusqu’à ce qu’elle se stabilise.
  20. Injectez 10 μL de PBS à travers le cloison nasale dans le récipient de purge à l’aide d’une seringue Hamilton pour confirmer la stabilité de base.
  21. Enregistrez le signal chimiluminescent pour chaque injection.
  22. Injecter 10 μL de l’étalon de nitrite de 0,125 μM dans le récipient de purge.
  23. Répétez deux fois pour chaque standard nitrite, afin d’obtenir des mesures en double qui seront ensuite moyennées.
  24. Annoter chaque injection dans l’onglet Commentaires (par exemple, 10 μL 0,5 μM nitrite).
  25. Essuyez la seringue sur un tissu sans peluches et rincez 3 à 4 fois avec de l’eau stérile sans nitrites pour éliminer l’excès de triiodure.
  26. Répétez cette étape de nettoyage après chaque injection.
  27. Laissez le signal revenir à la ligne de base entre les injections (20–30 s).
  28. Ouvrez la fenêtre d’analyse de flux .
  29. Examinez les valeurs de hauteur et de temps de pic pour chaque injection dans la table d’analyse.
  30. Surlignez chaque pic et ajustez la sélection pour calculer la surface sous la courbe (AUC).
  31. Basculez l’affichage de S à C pour activer le mode étalonnage.
  32. Entrez les quantités connues de nitrites pour chaque étalon dans la colonne Quantité .
  33. Cliquez sur le bouton Courbe d’étalonnage pour générer la courbe standard.
  34. Vérifiez que la courbe d’étalonnage respecte les critères d’acceptation (R2 ≥ 0,99).
  35. Des échantillons biologiques de dégel préalablement prélevés à partir de cultures ALI sur glace.
  36. Injecter 50 μL de milieu sans cellules vierges dans le récipient de purge.
  37. Injectez 50 μL de chaque échantillon de milieu basal dans le récipient de purge.
  38. Enregistrez le signal de chimiluminescence pour chaque injection.
  39. Effectuer des injections en double (50 μL chacune) pour chaque échantillon.
    REMARQUE : Les injections de 50 μL entraînent une formation fréquente de bulles. Pour limiter ce problème, remplacez régulièrement le réactif triiodure par de l’anti-mousse dans le récipient de purge.
  40. Annoter chaque échantillon dans l’onglet Commentaires avant l’injection.
  41. Injecter 50 μL de PBS sans cellules (blank apical) dans le récipient de purge.
  42. Injectez des échantillons de lavage apical (deux injections de 50 μL par échantillon) et enregistrez les pics de signal correspondants.
  43. Injecter deux fois le tampon RIPA, suivi d’échantillons de lysat (deux injections de 50 μL par échantillon) et enregistrer les pics de signal correspondants.
    REMARQUE : Laissez toujours la trace chimiluminescente revenir à la ligne de base et se stabiliser. Attendez 20 à 30 secondes, puis injectez l’échantillon suivant.
  44. À la fin des injections d’échantillons, ouvrez la fenêtre d’analyse de flux .
  45. Surlignez chaque pic d’échantillon pour calculer la surface sous la courbe (AUC).
  46. Déterminez les concentrations de nitrites pour chaque échantillon à l’aide de la courbe d’étalonnage générée à partir de solutions standard.

9. Collecte, normalisation et analyse des données

  1. Exportez les données, y compris la hauteur de pic (V), la surface sous la courbe (V.s) et la surface moyenne sous la courbe depuis la fonction d’analyse de flux dans le logiciel eDAQ vers un fichier Excel. Le fichier exporté tabulera la hauteur (V) par rapport au temps (s) des traces de signal pour l’ensemble de l’expérience NOA.
  2. Déterminez les picomoles (pmol) de nitrite injectés dans le NOA en multipliant la concentration de nitrite (μM) par le volume d’injection (μL).
  3. Faites la moyenne des picomoles (pmol) de nitrite mesurés en témoins (milieu sans cellules, tampon de lavage PBS ou tampon RIPA).
  4. Soustrayez les valeurs de contrôle correspondantes du PMOL mesuré dans chaque injection d’échantillon de 50 μL.
  5. Déterminez le total des picoles (pmol) de nitrite dans chaque échantillon en multipliant le pmol mesuré dans la partie injectée de l’échantillon par le volume total exact de l’échantillon collecté. Utilisez 750 μL pour le milieu, 150 μL pour le lavage apical et environ 90–100 μL pour le lysat.
  6. De plus, pour les lysats uniquement, multipliez le pmol total de nitrite par 2 pour tenir compte du facteur de dilution.
  7. Normaliser le pmol de nitrite obtenu pour chaque échantillon en divisant ces valeurs par la quantité totale de protéines (μg) présente dans le lysat de l’échantillon correspondant, obtenue précédemment via le test BCA.
  8. Faites la moyenne des niveaux de nitrites (pmol/μg) issus des injections en double pour chaque échantillon.
  9. Tracez les niveaux de nitrites normalisés (pmol/μg de protéine totale) pour chaque échantillon à l’aide du logiciel GraphPad Prism.
  10. Évaluer la répartition des données pour la normalité à l’aide du test de Shapiro-Wilk.
  11. Effectuer une analyse statistique à l’aide d’un test t des étudiants à deux volets.

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Résultats

L’objectif global de cette procédure est de quantifier les niveaux d’oxyde nitrique (NO) dans les cultures de cellules épithéliales trachéales de souris (MTEC) différenciées à l’interface air-liquide (ALI). Les cellules primaires sont isolées et différenciées selon les protocolesétablis 27,28. Au cours de 21 jours à l’ALI, les cellules sont différenciées en un épithélium pseudostratifié des voies respiratoires contenant

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Discussion

Les cellules multi-ciliées dans l’épithélium des voies respiratoires sont essentielles à la synthèse et à la signalisation du NO, ce qui est à son tour essentiel pour réguler le battement ciliaire, le dégagement mucociliaire et l’homéostasie des voies respiratoires 6,7,8. Le NO est une molécule hautement réactive et même de petits changements dans les niveaux de NO sont a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Mark T. Gladwin (doyen et professeur à la faculté de médecine de l’Université du Maryland) pour ses conseils sur la conception des études. Nous remercions également le Noyau de microscopie confocale de la Faculté de médecine du Maryland (Baltimore, MD) pour son accès aux ressources de microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par la subvention 5R01HL168775 des National Institutes of Health (NIH) accordée au Dr Paola Corti.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
4′,6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI)ThermoFisher Scientific62248dilué 1:2000 pour l'immunomarquage
50 mL Tube de centrifugation filtre (0,22 µm)CellTreat229710Pour la préparation de solutions stériles
500 mL Unités de filtrationThermoFisher Scientific566-0020Pour la préparation de milieux stériles
AccutaseSigmaA6964
Amphotèrecine BThermoFisher Scientific15290026
Extrait de pituitaire bovinThermoFisher Scientific13028014
Albumine sérique bovineSigmaA7906
Toxine cholériqueSigmaC8052
Collagène IThermoFisher ScientificA1048301
Microscope confocalNikonMicroscope inversé W1 Spinning disk Ti2 avec caméra sCMOS Hamamatsu
Inserts Corning TranswellSigmaCLS3460
Diéthylènetriamine NONOate (DETA-NONOate)Cayman Chemical82120
Média DMEM/F-12ThermoFisher Scientific11330032
DNase ISigmaDN25
Sérum bovin foetalSigmaF4135
Cocktail inhibiteur de protéase Halt 1XThermoFisher Scientific1860932
Mélange de nutriments Ham's F1-12ThermoFisher Scientific11765054
Solution d'insulineSigmaI0516
Chlorhydrate d'isoprotérénolSigmaI6504
Média sans sérum pour kératinocytesThermoFisher Scientific17005042
Facteur de croissance épidermique murinSigmaE4127
N(G)-Nitro-L-arginine méthyle ester (L-NAME)SigmaN5751
NuSerumCorning355100
Penicilline-StreptomycineSigmaP4333
Tampon phosphate-saline (PBS)ThermoFisher Scientific10010023
Kit d'analyse de protéines Pierce BCAThermoFisher Scientific23227
PronaseSigma10165921001
Acide rétinoïqueSigmaR2625
Inhibiteur de la Rho kinase (Y-27632 chlorhydrate)Cayman ChemicalTOM-C837Z37
Tampon RIPASigmaR0278
Média RPMI-1640ThermoFisher Scientific11875093
Nitrite de sodium SigmaS2252
TransferrineSigmaT8158
Anticorps anti-tubuline alpha acétylée (souris)SigmaT6793dilué 1:200 pour l'immunomarquage
Anticorps anti-FoxJ1 alpha (souris)ThermoFisher Scientific14-9965-80dilué 1:200 pour l'immunomarquage
Anticorps secondaire Cy3 anti-sourisThermoFisher ScientificA10521dilué 1:1000 pour l'immunomarquage
Inhibiteur gamma-sécrétase IX (DAPT)SigmaD5942

Références

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Mesure de la production d’oxyde nitrique dans les cultures cellulaires épithéliales trachéales de la souris différenciées à l’interface air-liquide
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