Un flux de travail pour visualiser la dynamique conformationnelle des protéines à partir de cartes cryo-EM utilisant la synthétase d’asparagine humaine

Summary

Ce protocole décrit comment effectuer une analyse de variabilité 3D (3DVA) dans CryoSPARC et un raffinement de la variabilité dans Phenix afin d’analyser l’hétérogénéité conformationnelle des données cryo-EM. En prenant l’asparagine synthétase humaine comme exemple, il décrit comment générer des cartes de variabilité, visualiser les composantes principales et affiner les modèles atomiques correspondants.

Abstract

Cet article présente un flux de travail complet pour analyser l’hétérogénéité conformationnelle dans les données de cryomicroscopie électrone à particule unique (cryo-EM) en utilisant l’analyse de variabilité 3D (3DVA) en CryoSPARC et le raffinement de la variabilité en Phenix. Le protocole décrit comment calculer des cartes de variabilité le long des composantes principales dérivées d’images de particules, visualiser les modes principaux de variation structurelle et affiner les ensembles correspondants de modèles atomiques selon les référentiels de variabilité individuels. Les résultats comprennent une série de cartes de variabilité 3D, des structures atomiques multi-modèles affinées représentant des états conformationnels discrets, ainsi que des fichiers de visualisation adaptés à l’analyse comparative des structures et à la génération de films. Ce flux de travail est largement applicable aux reconstructions cryo-EM dans la plage de résolution (typiquement ~2,0-6,0 Å) où l’hétérogénéité conformationnelle peut être interprétée de manière significative au niveau de la colonne vertébrale et de la chaîne latérale. Il est particulièrement adapté à la capture de mouvements continus dans le domaine, de mouvements de flexion de charnière et de réarrangements locaux coordonnés qui ne sont pas facilement résolus par une classification discrète seule. L’utilisation combinée de cartes de variabilité et d’ensembles de modèles affinés permet une comparaison structurelle directe des extrêmes conformationnels, soutient des analyses quantitatives telles que les calculs de fluctuation des racines moyennes au carré (RMSF), et fournit un cadre pour relier les caractéristiques structurelles dynamiques à des hypothèses biochimiques ou fonctionnelles. L’asparagine synthétase humaine (ASNS) est utilisée comme exemple pour démontrer la mise en œuvre pratique du flux de travail.

Introduction

La caractérisation de l’hétérogénéité conformationnelle dans les structures macromoléculaires est un aspect de plus en plus important de l’analyse cryo-microscopie électrone à particule unique (cryo-EM). L’objectif de ce protocole est de fournir un flux de travail pratique pour extraire, visualiser et affiner les modes dominants de variabilité structurelle directement à partir des ensembles de données cryo-EM, en utilisant l’analyse de variabilité tridimensionnelle (3DVA) dans CryoSPARC¹ combinée à l’affinement de la variabilité dans^{Phenix 2}. Cet article vise à guider les lecteurs pour déterminer si cette approche computationnelle est appropriée pour leurs données et pour comprendre les types de sorties générées par le flux de travail.

Les techniques expérimentales traditionnelles (par exemple, l’échange hydrogène-deutérium, la spectroscopie RMN, la spectrométrie de masse) fournissent des informations précieuses sur les mouvements des^{protéines 3,4,5}, mais sont souvent limitées par la taille moléculaire, les besoins en échantillons ou la complexité expérimentale. Les avancées en cryo-EM ont permis une détermination de structure à haute résolution pour des systèmes grands et hétérogènes, permettant d’analyser la variabilité conformationnelle au sein des populations de particules. L’analyse de variabilité 3D (3DVA), implémentée dans CryoSPARC¹, décompose les ensembles de données de particules cryo-EM en composants principaux décrivant les modes dominants et continus de variation structurelle. Combinée à l’affinement de la variabilité dans^{Phenix 2}, cette approche produit des modèles atomiques correspondant à des positions discrètes le long de chaque composant principal, permettant la visualisation et la comparaison de conformations alternatives dérivées de données expérimentales.

Ce protocole est mieux adapté aux ensembles de données cryo-EM reconstruits à une résolution proche de l’atomique à intermédiaire (typiquement ~2-6 Å). À des résolutions plus élevées, le flux de travail peut capturer des réarrangements de la chaîne dorsale et une variabilité limitée de la chaîne^{latérale 6}, tandis qu’à des résolutions plus basses, il est plus approprié pour identifier les mouvements au niveau du domaine ou de la structure secondaire ^2,7. La méthode est adaptée à la capture des modes de mouvement dominants et continus qui sont largement peuplés dans le jeu de données, tels que les mouvements charnières, la respiration de domaine ou les réarrangements coordonnés entre domaines ou sous-unités. Un nombre suffisant de particules et une couverture angulaire sont essentiels, et l’interprétation peut être limitée dans les régions flexibles ou faiblement résolues où les positions des chaînes latérales restent ambiguës. Comparé à la classification^{ciblée 8} ou aux stratégies de sous-classification étendues, le flux de travail de raffinement de variabilité 3D représente l’hétérogénéité conformationnelle comme des trajectoires continues plutôt que des classes discrètes. Cela rend la méthode particulièrement utile pour l’analyse exploratoire des enzymes, des machines moléculaires et des complexes multi-domaines qui sont censés échantillonner plusieurs conformations.

La synthétase d’asparagine humaine (ASNS) est utilisée comme exemple illustratif pour démontrer la mise en œuvre du protocole. L’ASNS est une amidotransférase dépendante de la glutamine, composée de deux domaines fonctionnels reliés par un tunnel d’ammoniac^{intramoléculaire 9,10}. Des études antérieures ont suggéré que des modifications conformationnelles impliquant des résidus tels qu’Arg-142 contribuent à la modulation de ce tunnel⁶. Dans cet article, l’ASNS sert uniquement de système représentatif pour démontrer comment la 3DVA et le raffinement de la variabilité génèrent des cartes de variabilité, des ensembles de modèles atomiques affinés et des visualisations. L’interprétation mécanistique détaillée est remise aux sections Résultats et Discussion. Bien que les simulations de dynamique moléculaire (MD) soient souvent utilisées comme approche complémentaire pour explorer les paysages^{conformationnels 11,12}, la MD n’est pas requise pour ce protocole. Les comparaisons avec les simulations MD peuvent être effectuées comme une analyse optionnelle en aval, mais le flux de travail décrit ici (Figure 1) se concentre exclusivement sur l’extraction et la visualisation de l’hétérogénéité conformationnelle à partir des données cryo-EM.

Figure 1. Aperçu du flux de travail. Une carte cryo-EM consensuelle est reconstruite à partir de données à particule unique et soumise à une analyse de variabilité tridimensionnelle (3DVA) pour générer des cartes de variabilité selon les composantes principales. Le raffinement de la variabilité (Phenix.varref) utilise le modèle atomique consensuel pour générer des modèles atomiques correspondants à des fins de visualisation et de comparaison. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Protocol

1. Préparation des données

1. Génération d’une carte EM consensuelle
   1. Utiliser la cryomicroscopie électron-à particule unique (cryo-EM) pour déterminer la structure 3D consensuelle du complexe macromoléculaire.
   2. Vitrifierez les échantillons sur des cryo-grilles et imagez à l’aide d’un microscope électronique à transmission haute tension équipé d’un détecteur d’électrons direct.
   3. Traiter les films collectés pour corriger le mouvement induit par le faisceau, estimer les paramètres d’imagerie et sélectionner les images des particules.
   4. Effectuer une classification itérative et un raffinement des particules afin de générer une carte EM consensuelle.
   5. Effectuer le traitement des données à l’aide de CryoSPARC (v4 ou supérieur)¹³, puisque l’analyse de variabilité 3D (3DVA) sera implémentée.
2. Générer un modèle de consensus
   1. Construis un modèle atomique et affine-le selon la carte consensuelle. Valider la qualité du modèle affinée en utilisant des critères standards
      REMARQUE : Pour les ASNS, la structure a été déterminée à l’aide d’une stratégie de sélection de particules basée sur un modèle. Un modèle dérivé de la structure aux rayons X de l’ASNS humain modifié par DON (PDB 6GQ3)⁹a été utilisé pour sélectionner efficacement des particules de haute qualité dans CryoSPARC¹³. Ces particules ont subi des cycles itératifs de classification 2D, de reconstruction ab initio, et d’affinements hétérogènes et non uniformes avec la symétrie C2 imposée, donnant une application consensuelle de 3,5 Å. Le modèle atomique a été généré en utilisant la structure cristalline⁹ dans la carte EM, suivi d’un raffinement en espace réel dans Phenix^14,15 et d’un ajustement manuel dans Coot¹⁶, produisant la structure ASNS consensuelle finale telle que^{décrite 6}.

2. Réalisation d’analyses de variabilité 3D (3DVA)

1. Utilisez la pile de particules et le masque (pas une carte finale raffinée) pour un raffinement final
   REMARQUE : Souvent, les résultats d’un travail de raffinement non uniforme sont utilisés pour la 3DVA.
2. Créez un travail de variabilité 3D dans CryoSPARC. Empilez les particules d’entrée et masquez à partir du travail de raffinement non uniforme.
3. Définir le nombre de modes à résoudre : nombre de composants principaux (PC) à 5.
   REMARQUE : Parce que les structures macromoléculaires existent dans l’espace tridimensionnel, au moins trois PC sont généralement nécessaires pour décrire leurs principaux modes de mouvement spatiaux. Pour s’assurer que des variations conformationnelles supplémentaires, potentiellement plus petites mais fonctionnellement pertinentes, ne soient pas négligées, deux PC supplémentaires ont été inclus.
4. Réglez la résolution du filtre à 4,0 Å, et la résolution passe-haut à 20. Laissez tous les autres paramètres par défaut. Commencez le travail.
   REMARQUE : La « résolution du filtre » de 4,0 Å a été réglée pour correspondre à la qualité globale du jeu de données tout en évitant le surapprentissage au bruit de haute fréquence. Puisque la carte de consensus finale a été déterminée à une résolution de 3,5 Å, appliquer une résolution de filtre légèrement inférieure (4,0 Å) a permis que l’analyse de variabilité se concentre sur de véritables mouvements structurels plutôt que sur le bruit proche de la limite de résolution.
5. Obtenir un ensemble de volumes de variabilité en sortie (Figure 2A)

3. Affichage 3D de la variabilité

1. Créez un travail d’affichage de variabilité 3D dans CryoSPARC pour visualiser les changements conformationnels continus identifiés par le 3DVA.
2. Entrez la pile de particules et les volumes de variabilité générés par le travail 3DVA.
3. Sélectionnez Simple en mode sortie (voir ci-dessous).
4. Réglez la résolution du filtre à 4,0 et la résolution passe-haut à 20. Laissez tous les autres paramètres à leurs valeurs par défaut. Commencez le travail.
5. Obtenir 20 applications de variabilité comme résultat (frame 0 à 19) correspondant à 5 composantes principales (PC) de 0 à 4 (Figure 2B)
   REMARQUE : Le « mode simple » dans le programme 3D Variability Display offre une visualisation simple des changements conformationnels le long de chaque composant principal. Ce mode génère des trajectoires linéaires entre les états extrêmes identifiés par la 3DVA, permettant une interprétation claire et directe des mouvements au sein de la population de particules.

4. Préparation des données pour les films et affinage des variables 3D Phenix

1. Télécharger les cartes de variabilité 3DVA : Téléchargez les fichiers zip contenant les cartes de variabilité pour les PC 0-4 (cinq zips au total) depuis CryoSPARC.
2. Organiser les annuaires : Créer un dossier parent (par exemple, 3DVA/). À l’intérieur, créez un sous-dossier pour chaque composant principal (comp0, comp1, comp2, comp3, comp4).
3. Déplacez chaque zip dans son dossier correspondant et dézippez le contenu.
4. Confirmez que chaque dossier contient 20 cartes de variabilité (trames 0 à 19) et répétez pour comp1-comp4.
   REMARQUE : Maintenez des dossiers séparés pour chaque composant principal afin d’éviter de mélanger les images entre les PC.

5. Préparer des films rapides dans UCSF Chimera (Optionnel) ¹⁷

1. Ouvrez l’outil Série de volumes : lancez Chimera, puis naviguez vers Outils → Données de volume → série de volumes. Une nouvelle fenêtre de la série de volumes s’ouvrira.
2. Chargez les cartes : Cliquez sur Ouvrir et sélectionnez les 20 applications correspondant à un composant principal (par exemple, comp0).
3. Ajustez les paramètres de visualisation : Ouvrez le Volume Viewer, définissez le seuil de densité approprié et attribuez une couleur à la carte.
   REMARQUE : Dans cet exemple, le bleu ciel a été utilisé (Figure 3).
4. Mouvement d’aperçu : Dans la fenêtre Série de volume , réglez la direction de lecture sur Osciller, puis cliquez sur Lecture pour afficher une transition continue de l’image 0 → 19 → 0.
5. Répétez pour les composants supplémentaires : Répétez les étapes 5.2-5.4 pour les autres composants principaux selon les besoins.
6. Générez un fichier vidéo en utilisant une saisie en ligne de commande : Exportez un film en ouvrant la ligne de commande Chimera et en exécutant le Fichier de Codage Supplémentaire 1.
   REMARQUE : La série mrc par composant et 20 images (par exemple, compX_frame000-019.mrc) est les entrées pour le raffinement des variables 3D Phenix. Gardez les dossiers composants séparés (comp0-comp4) pour éviter de mélanger les trames entre les PC.

6. Génération de modèles par raffinement de variabilité en phenix

REMARQUE : Phenix.varref peut être exécuté depuis n’importe quel répertoire tant que les chemins complets vers les cartes d’entrée et le modèle sont spécifiés. Cependant, pour plus de clarté organisationnelle, il est recommandé d’effectuer l’affinement dans un sous-répertoire dédié pour chaque PC.

1. Copiez le fichier final du modèle consensus affiné dans le sous-répertoire correspondant à chaque PC.
2. Depuis chaque sous-répertoire, exécutez Phenix.varref depuis la ligne de commande en utilisant la syntaxe suivante :
   phenix.varref consensus_model.pdb *frame_*.mrc résolution=4 nproc=20 models_per_map=50
3. Régler la résolution à 4,0 Å pour correspondre à la résolution effective des cartes 3DVA
4. Régler nproc au nombre de processeurs disponibles (20 dans cet exemple, mais cela peut varier selon les ressources de calcul disponibles)
5. Réglez models_per_map à 50 modèles (par défaut).
   REMARQUE : Pour chaque carte, 50 modèles sont générés avec des contraintes ajustées à la résolution des données 3DVA. Le modèle le mieux adapté à chaque carte est automatiquement conservé. Le fichier de sortie résultant contient 20 modèles affinés correspondant aux 20 cartes de variabilité. La sortie consiste en un bundle PDB contenant 20 modèles affinés, ainsi que des fichiers cartographiques individuels.
6. N’appliquez pas d’affûtage supplémentaire lors du raffinage de la variabilité. Utilisez les cartes de variabilité générées par CryoSPARC (filtrées à 4,0 Å) directement comme entrées pour phenix.varref.

7. Visualisation

1. Ouvrez le bundle PDB dans ChimeraX¹⁸ pour charger simultanément les 20 modèles affinés.
2. Utilisez le panneau Modèles pour afficher sélectivement des images individuelles ou des modèles spécifiques d’intérêt pour comparaison et analyse (Figure 4). Alternativement, chaque modèle affiné peut aussi être ouvert individuellement dans ChimeraX ou Chimera.

8. Préparation des données pour l’analyse

REMARQUE : L’exécution de la syntaxe ci-dessus génère un fibré PDB contenant 20 modèles de variables et chaque application individuelle. Pour la plupart des analyses, seuls deux modèles — correspondant aux repères 0 et 19 — sont nécessaires, car ils représentent les deux états conformationnels extrêmes le long de la composante principale (PC) sélectionnée.

1. Ouvrez le bundle PDB dans ChimeraX, sélectionnez le modèle 1.1 (trame 0) et le modèle 1.20 (trame 19), et enregistrez chaque modèle comme un fichier PDB séparé (Figure 4).
2. Modifier les fichiers PDB résultants pour isoler les résidus d’intérêt. Cela peut se faire manuellement ou via Phenix.pdb.tools.
3. Comparez les deux fichiers PDB modifiés pour identifier les changements conformationnels dans la dorsale ou les chaînes latérales.
4. Pour comparer les deux modèles PDB, superposez les structures modifiées à l’aide de la fonction MatchMaker dans Chimera.
   REMARQUE : Pour un alignement fiable, MatchMaker nécessite généralement au moins 10 à 15 résidus qui se chevauchent. Dans notre cas, seuls 6 résidus ont été analysés ; cependant, la superposition réussie a été obtenue en tirant parti de la nature homodimérique de l’ASNS – alors que seuls 6 résidus restaient dans la chaîne A, la chaîne B était intacte et servait de référence pour l’alignement.

Results

Cette section présente des résultats représentatifs générés par l’analyse de variabilité 3D (3DVA) et le flux de travail de raffinement de la variabilité, et fournit des conseils sur leur interprétation. La synthétase d’asparagine humaine (ASNS) est utilisée comme jeu de données illustratif pour démontrer les résultats réussis, les artefacts courants et les analyses comparatives rendues possibles par le protocole. L’ensemble complet des cartes de variabilité dérivées de la 3DVA et les modèles affinés correspondants génér...

Discussion

Étapes critiques du protocole et points de décision
L’utilisation efficace de ce protocole dépend de plusieurs étapes clés du flux de travail. La qualité de la pile de particules et du masque utilisés pour le raffinement cryo-EM final est cruciale, car l’analyse de variabilité 3D (3DVA) fonctionne directement sur ces entrées plutôt que sur une carte post-traitée. La sélection du nombre de composants principaux (PC) doit refléter la taille du jeu de données et la compl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CryoSPARC v4.4+	Structura Biotechnology	https://cryosparc.com	Logiciels pour le traitement cryo-EM
Phenix v1.24+	Phenix Consortium	https://phenix-online.org	Logiciels pour le raffinement de la variabilité
Chimère de l’UCSF	Ressource pour le biocalcul, la visualisation et l’informatique, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/	Logiciels pour la visualisation moléculaire
UCSF ChimeraX	Ressource pour le biocalcul, la visualisation et l’informatique, UCSF	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	Logiciels pour la visualisation moléculaire
CPPTRAJ	Suite logicielle de dynamique moléculaire AMBER	https://amberhub.chpc.utah.edu/cpptraj/	Outils Python pour le calcul RMSF
Linux Workstation (système GPU assemblé en interne)
Boîtier de station de travail	Supermicro	https://www.supermicro.com	Boîtier de station de travail : Supermicro CSE-743TQ-1200B-SQ 1200W 4U Server Super Chassi  ;
CPU	Intel  ;	https://www.intel.com	CPU : XEON E5-2690V3 x2
Carte mère	Supermicro	https://www.supermicro.com	Carte mère : Supermicro Extended ATX DDR4 LGA 2011 Motherboard X10DAI-O
Mémoire	Crucial	https://www.crucial.com	Mémoire : Crucial 64GB Kit (16GBx4) DDR4 2133 (PC4-2133) DR x4 ECC enregistré. Mémoire serveur 288 broches CT4K16G4RFD4213 / CT4C16G4RFD4213 x2
Disque dur	Western Digital	https://www.westerndigital.com	DISQUE DUR : WD RE 4 To Disque dur d’entreprise
CONTRÔLEUR RAID	LSI Logic	https://www.broadcom.com	CONTRÔLEUR RAID : Kit LSI Logic MegaRAID SAS 9271-8i
GPU	NVIDIA  ;	https://www.nvidia.com	Carte graphique Quadro M6000 avec 24 Go de mémoire GDDR5