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Article de méthode

Caractérisation de l’ataxie induite par la tumeur dans un modèle de souris de Schwannome vestibulaire

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DOI :

10.3791/70329

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20 février 2026

 ,  ,  , 
1Edwin L. Steele Laboratories, Department of Radiation Oncology, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School

Dans cet article

Résumé

Nous avons développé un panel d’analyses comportementales pour étudier l’ataxie induite par la tumeur et évaluer les thérapies qui préservent la fonction neurologique dans un modèle murin de schwannome vestibulaire.

Résumé

La schwannomatose liée à NF2 (NF2-SWN) est un syndrome de prédisposition à la tumeur autosomique dominante causé par des mutations germinales du gène suppresseur tumoral NF2. La maladie se caractérise par le développement de schwannomes vestibulaires bilatéraux (SVV), qui s’élargissent progressivement et entraînent une perte auditive, un déséquilibre et des symptômes d’ataxie qui affectent profondément la qualité de vie des patients. Aucun traitement pharmacologique approuvé par la FDA n’est actuellement disponible. Parmi les déficits neurologiques, l’ataxie reste une manifestation particulièrement invalidante mais peu étudiée, principalement en raison du manque de modèles précliniques solides pour son évaluation. Dans cette étude, nous avons développé un ensemble d’analyses comportementales pour évaluer systématiquement l’ataxie induite par la tumeur dans un modèle murin orthotopique de perte auditive et d’ataxie associées au VS. Ces tests permettent de mesurer quantitativement les déficits d’équilibre et de coordination motrice résultant de la charge tumorale. Cette plateforme expérimentale permet des études mécanistes sur le dysfonctionnement cérébelleux induit par la tumeur et constitue un outil précieux pour l’évaluation préclinique des stratégies thérapeutiques. En intégrant les évaluations comportementales à la biologie tumorale et aux tests auditifs, cette approche facilite la caractérisation des effets des traitements suppressifs tumoraux et neuroprotecteurs. En fin de compte, ces tests offrent un cadre polyvalent qui peut également être appliqué à d’autres troubles neurologiques caractérisés par l’ataxie, élargissant ainsi leur utilité au-delà de la NF2-SWN.

Introduction

La schwannomatose liée à NF2 (NF2-SWN) est un syndrome rare de prédisposition tumorale héréditaire dominant, causé par des mutations du gène suppresseur de tumeur NF2, qui code pour la protéine cytosquelettiquemerlin 1. La perte de la fonction Merlin perturbe les voies de signalisation régulant la prolifération cellulaire, l’adhésion et la survie, prédisposant les individus affectés au développement de multiples tumeurs bénignes du système nerveux. La caractéristique de NF2-SWN est la formation de schwannomes vestibulaires bilatéraux (SV) - des tumeurs non malignes issues des cellules de Schwann qui apparaissent le long des nerfs vestibulocochléaires. Ces tumeurs s’agrandissent progressivement, comprimant les structures neuronales adjacentes et entraînant une perte auditive sensorieurale, des acouphènes et un dysfonctionnement du nerffacial 2.

Les patients atteints de SV bilatérale subissent fréquemment des lésions progressives du nerf vestibulaire et de l’appareil vestibulaire de l’oreille interne, entraînant un dysfonctionnement vestibulaire débilitant manifesté par un déséquilibre chronique, une ataxie et une instabilité de la démarche, ce qui altère gravement la mobilité et la qualitéde vie 3. Le degré de dysfonction vestibulaire est souvent corrélé à une charge tumorale et à une atteinte nerveuse. Ces symptômes persistent souvent même après le contrôle de la tumeur ou les efforts de préservation de l’audition, suggérant des mécanismes neurobiologiques complexes au-delà de la compression mécanique 4,5. Bien que des outils cliniques tels que les inventaires de handicaps de vertiges, l’analyse de la démarche, le test du réflexe vestibulo-oculaire (VOR) et la posturographie soient utilisés pour quantifier l’altération vestibulaire, les mécanismes sous-jacents de l’ataxie induite par la tumeur restent peu compris3. Malgré les avancées dans la compréhension moléculaire et l’introduction de thérapies ciblées telles que le bevacizumab, il n’existe toujours aucun traitement approuvé par la FDA qui préserve de manière fiable à la fois la fonction auditive et l’équilibre chez les patients atteints de NF2-SWN. La prise en charge des symptômes vestibulaires reste largement favorable, mettant en lumière un besoin clinique majeur non satisfait.

Un obstacle majeur à l’amélioration de la prise en charge clinique de l’ataxie associée au VS est l’absence de modèles précliniques reproduisant fidèlement les déficits de coordination vestibulaire et motrice observés chez les patients. La plupart des modèles animaux existants de SV se concentrent sur la croissance tumorale ou la perte auditive, sans reproduire les troubles caractéristiques de l’équilibre et de la coordination. De plus, les tests comportementaux standardisés pour évaluer objectivement l’ataxie et le dysfonctionnement vestibulaire en contexte préclinique ne sont pas bien établis. Cette lacune entrave l’investigation mécanistique et limite l’évaluation des thérapies candidates visant à préserver la fonction vestibulaire.

Ici, nous rapportons le développement d’un modèle murin VS présentant des phénotypes mesurables d’ataxie, accompagné d’un panel d’analyses comportementales spécifiquement conçues pour quantifier l’ataxie induite par la tumeur. Ce modèle offre une plateforme indispensable pour étudier les mécanismes sous-jacents au dysfonctionnement vestibulaire associé au VS et pour évaluer l’efficacité des interventions thérapeutiques visant à restaurer l’équilibre, la coordination et la fonction neurologique globale chez les patients atteints de NF2-SWN.

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Protocole

Les expériences animales ont été menées conformément au protocole approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Massachusetts General Brigham (MGB).

1. Modèle animal

  1. Inoculer les cellules Nf2-/- (cellules murines Nf2-/- exprimant le gène rapporteur de la luciférase Gaussia, Gluc) dans des souris C57/FVB immunocompétentes. À l’aide d’un dispositif d’injection stéréotaxique (Figure 1A), injectez à chaque souris 1 μL de 2 500 cellules tumorales dans la région CPA de l’hémisphèredroit 4,6.
  2. Utilisez à la fois des souris mâles et femelles (ratio 1:1) âgées de 8 à 12 semaines afin d’assurer une puissance statistique suffisante et d’examiner d’éventuelles différences liées au sexe. Les souris d’intérieur sont en groupes de 4 par cage sous un cycle clair/obscur de 12 heures, avec nourriture et eau disponibles à volonté.
    REMARQUE : Étant donné que les schwannomes se développent dans les nerfs vestibulaires des patients, nous avons utilisé le modèle de l’angle cérébellopontine (CPA). Le modèle CPA récapitule le microenvironnement intracrânien des SV.
  3. Groupe simulé : Pour évaluer les effets de la chirurgie animale et de l’implantation de cellules tumorales sur l’ataxie, incluez un groupe de chirurgie simulée, dans lequel les souris ont subi une chirurgie simulée et une injection de solution saline dans la région CPA.
  4. Inclure un groupe de souris non porteur de tumeurs comme témoin.
  5. Pour surveiller la progression tumorale, utilisez des cellules Nf2-/- exprimant le gène rapporteur de la luciférase Gaussia (Gluc), et mesurez la gluc plasmatique tous les 3 jours après l’implantation.
  6. En résumé, prélever 13 μL de sang dans les tubes EDTA pour éviter la coagulation. Transférez l’échantillon de sang sur une plaque à 96 puits et mesurez l’activité de la gluc comme décritprécédemment 6,7,8,9.

2. Tests d’ataxie

  1. Effectuez les quatre tests comportementaux dans une séquence fixe afin de minimiser la variabilité entre les animaux. Effectuer les tests dans l’ordre suivant : (1) test de prétention des membres postérieurs, (2) test de rebord, (3) évaluation de la foulée, et (4) évaluation de la kyphose. Prévoyez un intervalle minimum de repos de 2 à 5 minutes entre les tests en ramenant la souris dans sa cage d’origine. Surveillez l’animal pendant les périodes de repos et ne passez au test suivant que lorsque le comportement exploratoire normal reprend. Arrêtez les tests si des signes de stress ou de fatigue excessive sont observés. Complétez l’ensemble complet de quatre tests d’ataxie pour une cohorte de 10 souris en environ 45 à 60 minutes, y compris les intervalles de repos entre les tests.
  2. Test de prétension des membres postérieurs
    REMARQUE : Le test de claspage des membres postérieurs évalue la coordination neuromusculaire, le tonus moteur et le contrôle postural chez la souris. Les souris atteintes d’ataxie présentent une rétraction ou un agrippement des membres postérieurs vers l’abdomen, ce qui reflète une coordination motrice altérée et une régulation du tonusmusculaire 5.
    1. Saisissez doucement la souris par la base de la queue, assurant une prise sûre mais légère pour éviter l’inconfort. Soutenez brièvement l’animal sur le couvercle ou la main de la cage avant de le soulever pour réduire la réaction de sursaute.
    2. Soulevez lentement la souris pour qu’elle soit suspendue dans les airs, son corps complètement étendu et sans obstacles. Gardez la souris à au moins 10 cm au-dessus de la cage ou de la surface de test.
    3. Maintenez la position suspendue pendant environ 10 secondes et observez la position des membres postérieurs et de la queue sans tourner ni balancer l’animal.
    4. Évaluez la posture des membres postérieurs comme décrit ci-dessous.
      1. Identifiez une posture normale lorsque les deux membres postérieurs s’étendent vers l’extérieur et s’éloignent de l’abdomen.
      2. Identifier une posture anormale lorsque l’un ou les deux membres se rétractent vers l’abdomen ou se croisent, indiquant un claquement des membres postérieurs associé à une ataxie ou à un trouble neurologique.
    5. Enregistrez le comportement à l’aide d’un système de notation prédéfini ou capturez une courte vidéo pour une analyse post-hoc aveugle.
      REMARQUE : Limitez chaque test à ≤10 s pour minimiser le stress.
  3. Test de rebord
    REMARQUE : Le test de la corniche évalue l’équilibre, la coordination et le contrôle moteur fin chez la souris. Il mesure la capacité de l’animal à marcher le long d’une corniche étroite et à descendre en toute sécurité jusqu’à la cage sans perdre l’équilibre. Les souris souffrant de dysfonction cérébelleuse ou d’ataxie vestibulaire présentent généralement des glissades, des chutes ou une posture instable pendant cettetâche 5.
    1. Placez la cage sur une surface stable et plate à hauteur d’établi (~1 m).
    2. Reliez une extrémité de la cage de test (Figure 1C) au boîtier de logement (Figure 1D), en veillant à ce qu’il n’y ait aucun espace vertical ni obstruction entre les cages permettant à la souris de descendre en douceur et naturellement dans sa cage d’origine (Figure 1B) sans sauter ni tomber.
    3. Placez une caméra vidéo sur un trépied face au rebord à un angle de 30°-45° pour capturer à la fois les mouvements latéraux et la descente.
    4. Ajustez l’éclairage pour minimiser l’éblouissement et assurer une bonne visibilité des membres et de la queue de la souris.
    5. Soulevez doucement la souris par la base de la queue et soutenez son corps de l’autre main. Placez la souris au centre de la corniche de façon à ce que les quatre pattes soient à la surface. Relâchez la queue uniquement lorsque la souris semble équilibrée et alerte.
    6. Laissez la souris marcher librement le long du rebord sans qu’on y incite un peu. Enregistrez la souris pendant au moins 10 secondes ou jusqu’à ce qu’elle descende dans la cage.
    7. Observez sa capacité à s’équilibrer sur la corniche sans glisser et à marcher le long de la corniche vers la cage ou la plateforme.
    8. Effectuez trois essais indépendants par souris, avec un intervalle de repos de ~2 minutes entre les essais. Nettoyez la surface du rebord entre les animaux avec de l’éthanol à 70 % pour éliminer les signaux odorants.
    9. Effectuez tous les tests dans un environnement calme avec un éclairage constant et un minimum de bruit de fond ou de vibrations. Évitez de répéter le test excessivement le même jour, car la fatigue et les effets d’apprentissage peuvent influencer la performance.
  4. Évaluation de l’allure
    REMARQUE : Le test d’évaluation de la foulée évalue la coordination locomotrice, le rythme de foulée et la stabilité posturale chez des souris en mouvement libre. Les souris atteintes d’ataxie présentent souvent une foulée raccourcie, des mouvements inréguliers et un placement irrégulier des pattes, indiquant des défauts de coordination et de contrôlede l’équilibre 5.
    1. Alignez une piste droite et plate avec du papier blanc (8,5 × 11 pouces). Placez la cage de la maison au bout du papier pour encourager la souris à marcher sur le papier.
    2. Enrobez légèrement les pattes avant et arrière avec deux couleurs contrastées (par exemple, bleu pour les pattes avant, rouge pour les pattes arrière) à l’aide d’un tampon d’encre non toxique (Figure 1E).
    3. Placez la souris au début de la piste et laissez-la marcher librement sur le papier sans que l’on pique de l’extérieur.
    4. Observez et mesurez les paramètres suivants :
      Longueur de foulée : la distance entre les placements successifs de la même patte.
      Largeur de base : la distance latérale entre les empreintes postérieures gauche et droite.
    5. Effectuez deux à trois passages par souris, en laissant une pause entre les tests.
      REMARQUE : Utilisez une encre non toxique à séchage rapide et assurez-vous que seuls les coussinets de pattes sont recouverts. Remplacez le papier après chaque essai pour éviter les étalages. Appliquez l’encre avec parcimonie pour éviter de flouter les empreintes, car une excès d’encre réduit la précision des mesures de foulée.
  5. Évaluation de la cyphose
    REMARQUE : L’évaluation de la cyphose évalue l’alignement de la colonne vertébrale et les anomalies posturales lors de la locomotion naturelle. Les souris souffrant de dysfonction neurologique ou musculaire présentent souvent une courbure dorsale persistante ou une courbure de la colonnevertébrale 5.
    1. Placez la souris sur une surface et laissez-la marcher ou explorer librement pendant plusieurs secondes. Évitez de surprendre l’animal, car des mouvements brusques peuvent temporairement modifier la posture.
    2. Enregistrez une courte vidéo en vue latérale pour documenter la courbure du tronc.
    3. Observez la posture de la souris pendant la marche, en vous concentrant sur l’alignement de la colonne vertébrale et la courbure du tronc comme décrit ci-dessous.
      1. Identifiez une posture normale lorsque la souris maintient un dos droit ou légèrement cambré avec des mouvements corporels fluides.
      2. Identifier une posture anormale lorsque la souris présente une cyphose, caractérisée par une colonne anormalement voûtée ou courbée, un tronc rigide et une flexibilité réduite lors de la démarche.

3. Analyse du test d’ataxie

REMARQUE : Effectuer tous les scores comportementaux par un observateur aveuglé à l’attribution expérimentale de groupe afin de minimiser le biais de l’observateur.

  1. Évaluation des tests sur la corniche
    1. Attribuez un score de 3 si la souris marche le long du rebord en douceur, maintient l’équilibre et descend dans la cage sans glisser.
    2. Attribuez un score de 2 si la souris montre une légère déficience, comme une hésitation ou un léger glissement de patte, mais se remet et descend en toute sécurité.
    3. Attribuez un score de 1 si la souris présente une altération modérée, incluant des glissades fréquentes, une posture accroupie, une utilisation excessive de la queue pour l’équilibre ou une descente retardée.
    4. Attribuez un score de 0 si la souris montre une altération sévère, incapable d’équilibrer, tombe du rebord ou refuse de bouger.
  2. Évaluation du test de prétension des membres postérieurs
    1. Attribuez un score de 3 si la souris montre systématiquement les membres postérieurs écartés vers l’extérieur sans signe de présence.
    2. Attribuez un score de 2 si la souris présente une légère altération (altération), comme une rétraction intermittente d’un membre postérieur.
    3. Attribuer un score de 1 si la souris présente une altération modérée, caractérisée par une rétraction partielle des deux membres postérieurs maintenus près de l’abdomen.
    4. Attribuer un score de 0 si la souris montre une altération sévère, avec les deux membres postérieurs fermement serrés contre l’abdomen pendant la majeure partie de la période d’observation.
  3. Notation de la foulée
    1. Attribuez un score de 3 si la souris marche avec une démarche régulière et coordonnée et se déplace en ligne droite.
    2. Attribuez un score de 2 si la souris présente une légère altération des effets, comme marcher lentement avec une légère instabilité ou déviation latérale, boiter sur un côté, ou suivre de larges trajectoires circulaires.
    3. Attribuez un score de 1 si la souris présente une altération modérée, incluant une perturbation claire de la démarche, la marche avec seulement deux ou trois pattes, le traînement d’une partie du corps ou le mouvement en cercles serrés.
    4. Attribuer un score de 0 si la souris montre une altération sévère, est incapable de marcher efficacement, reste immobile ou montre des mouvements de roulement incontrôlés sur le côté.
  4. Notation de la kyphose
    1. Attribuez un score de 3 si la souris reste à plat, droite sur le dos, à la fois pendant le repos et la marche.
    2. Attribuez un score de 2 si la souris présente une légère altération du dos, avec une légère courbure du dos au repos qui se redresse pendant le mouvement.
    3. Attribuez un score de 1 si la souris présente une altération modérée, avec un dos modérément voûté au repos qui reste courbé pendant la marche.
    4. Attribuez un score de 0 si la souris présente une altération sévère, avec un dos fortement voûté pendant toute la période d’observation, ce qui limite les mouvements normaux.

4. Évaluation de la fiabilité inter-évaluateurs

  1. Former les observateurs à l’aide de vidéos d’exemple représentatives avant la notation formelle afin de standardiser l’interprétation des critères de notation.
  2. Pour minimiser le biais de l’observateur, évaluez tous les tests comportementaux indépendamment par deux observateurs entraînés, aveugles au moment du groupe de traitement et de l’expérience.
  3. Quantifier la fiabilité inter-évaluateurs pour chaque test comportemental en utilisant le coefficient kappa de Cohen. Interprétez les valeurs kappa comme suit : <0,40, mauvaise concordance ; 0,40-0,60, accord modéré ; 0,60-0,80, accord substantiel ; et >0,80, un accord presque parfait.
  4. Résoudre les écarts de notation par une revue conjointe des vidéos enregistrées et atteindre un scoreconsensuel de 5.

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Résultats

La croissance tumorale de CPA provoque une ataxie dans le modèle murin VS

Pour évaluer l’ataxie induite par la tumeur, nous avons établi deux cohortes expérimentales. Premièrement, pour évaluer les effets de la chirurgie animale et de l’implantation de cellules tumorales sur l’ataxie, les souris ont subi une chirurgie simulée et une injection de solution physiologique dans la région CPA. Les symptômes d’ataxie chez les souris du groupe sham ont été comparés à ceux chez les sou...

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Discussion

Les tests comportementaux décrits ici fournissent un cadre solide et quantitatif pour évaluer les déficits d’ataxie et de coordination motrice dans les modèles murins de SV et de troubles vestibulaires associés. Adaptés à partir de protocoles établis pour des modèles de maladies neurodégénératives, tels que la maladie de Huntington et l’ataxie spinocérébelleuse10, ces tests sont bien adaptés pour caractériser la dysfonction vestibu...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas exister de conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous remercions le Dr Peigen Huang pour son aide aux études animales.
Cette étude a été soutenue par les NIH R01-NS126187 et R01-DC020724 (à L.X.), le prix de nouveau chercheur du Département de la Défense (W81XWH-16-1-0219, à L.X.), le prix de recherche initié par l’investigateur (W81XWH-20-1-0222, à L.X.), le prix d’essai clinique (W81XWH2210439, à L.X.), l’initiative de découverte de médicaments de la Children’s Tumor Foundation (à L.X.), le prix de recherche clinique de la Children’s Tumor Foundation (à L.X.), le prix Mission Boost de l’American Cancer Society (MBGII-24-1255260-01-MBG à L.X.), et le prix de jeune chercheur de la Children’s Tumor Foundation (à S.L.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Sérum bovin fœtal   ;ThermoFisherA5670701
Luminomètre microplaque GloMax 96   ;PromegaGM3000
Sous-coussinet de procédure bleu McKessonMcKesson75402
Supplément de croissance cellulaire de Schwann   ;ScienCell1752

Références

  1. Evans, D. R. Neurofibromatosis type 2 (NF2): a clinical and molecular review. Orphanet journal of rare diseases. Orphanet journal of rare diseases. , (2009).
  2. Evans, D. G., et al. Incidence of vestibular schwannoma and neurofibromatosis 2 in the North West of England over a 10-year period: higher incidence than previously thought. Otology & neurotology. , (2005).
  3. Madhani, A. S., et al. Vestibular dysfunction in NF2-related schwannomatosis. Brain Communications. , (2023).
  4. Chen, J., et al. A cerebellopontine angle mouse model for the investigation of tumor biology, hearing, and neurological function in NF2-related vestibular schwannoma. Nature protocols. , (2019).
  5. Lu, S., et al. Integrating Ataxia Evaluation into Tumor-Induced Hearing Loss Model to Comprehensively Study NF2-Related Schwannomatosis. Cancers. , (2024).
  6. Zhao, Y., et al. Targeting the cMET pathway augments radiation response without adverse effect on hearing in NF2 schwannoma models. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2018).
  7. Chung, E., et al. Secreted Gaussia luciferase as a biomarker for monitoring tumor progression and treatment response of systemic metastases. PloS one. , (2009).
  8. Tannous, B. A. Gaussia luciferase reporter assay for monitoring biological processes in culture and in vivo. Nature protocols. , (2009).
  9. Kodack, D. P., et al. Combined targeting of HER2 and VEGFR2 for effective treatment of HER2-amplified breast cancer brain metastases. Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).
  10. Guyenet, S. J., et al. A simple composite phenotype scoring system for evaluating mouse models of cerebellar ataxia. Journal of visualized experiments: JoVE. , (2010).

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Réimpressions et autorisations

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