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Prélèvement d’ADN environnemental sur des navires d’observation des baleines pour la surveillance des cétacés

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DOI :

10.3791/70334

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10 avril 2026

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1University of Iceland's Húsavík Research Center, Húsavík, Iceland, 2Applied Animal Ecology Research Unit, Department of Zoology, University of Innsbruck, 3Politecnico di Milano DICA Civil and Environmental Engineering Department, 4Department of Life and Environmental Science DISVA, Marche Polytechnic University, 5CetaceanWatching Lda, 6Tethys Research Institute, 7WasserCluster Lunz - Biologische Station GmbH

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit un flux de travail standardisé pour la collecte d’échantillons d’ADN environnemental de cétacés (eADN) à partir de navires d’observation des baleines. La faisabilité pour les chercheurs et les citoyens scientifiques formés est prioritaire, tandis que les conditions environnementales, le temps de filtration, la turbidité et la logistique à bord définissent les limites pratiques de son application.

Résumé

L’ADN environnemental (eADN) offre une approche non invasive pour surveiller les cétacés, mais son application généralisée depuis des plateformes opérationnelles nécessite des flux de travail d’échantillonnage standardisés et réalisables. Cette étude décrit un protocole de collecte d’ADN électronique de cétacés à partir de navires d’observation des baleines, conçu pour être mis en œuvre par des chercheurs et des citoyens scientifiques formés dans des conditions environnementales et logistiques définies. Cette approche intègre la collecte ciblée par empreintes de fluke, la filtration embarquée avec des filtres auto-conservants, et des analyses moléculaires en aval pour soutenir la génération de données opérationnellement réalisable dans des conditions réelles. Le protocole a été mis en œuvre lors de campagnes de terrain coordonnées menées en 2024 dans trois régions de l’Atlantique Nord et de la mer Méditerranée (Islande, Portugal et Italie), englobant plusieurs taxons de cétacés. La performance de la méthode a été évaluée à l’aide d’un test quantitatif PCR spécifique à l’espèce récemment développé, ciblant l’ADN mitochondrial de la baleine à bosse (Megaptera novaeangliae), démontrant des taux de détection constants sous des conditions environnementales et logistiques variables. En fournissant des conseils pratiques pour la mise en œuvre sur le terrain et le contrôle de la contamination, ce protocole soutient la surveillance des cétacés basés sur l’ADN électronique reproductible et facilite la comparabilité interrégionale dans les études de biodiversité marine.

Introduction

Une gestion efficace de la conservation de la mégafaune marine, y compris les cétacés et autres espèces à large répartition, est impérative pour la protection de la biodiversité. En tant que prédateurs de haut rang et ingénieurs des écosystèmes, les cétacés contribuent à la régulation trophique, au cycle des nutriments et à la résilience écologique à travers les bassinsocéaniques 1. Cependant, la génération de connaissances écologiques complètes pour ces espèces hautement mobiles reste un défi et repose souvent sur des programmes de suivi gourmandsen ressources 2. Les approches conventionnelles, telles que l’échantillonnage par biopsie, l’identification photo, la surveillance acoustique passive, la télémétrie par satellite et les relevés aériens, ont fourni des informations cruciales sur l’écologie descétacés 3,4,5,6,7, pourtant ces méthodes sont souvent coûteuses, logistiquement exigeantes, spatialement contraintes ou invasives, et soumises à une stricte surveillance éthique et réglementaire 8. En conséquence, la fréquence d’échantillonnage, la couverture géographique et les opportunités de participation des parties prenantes sont souvent limitées, notamment pour l’étude d’espèces à large répartition ou rares.

L’échantillonnage de l’ADN environnemental (eADN, défini comme le matériel génétique libéré par les organismes dans leur environnement) s’est imposé comme un outil puissant et non invasif pour détecter les espèces aquatiques à partir d’échantillonsd’eau 9,10. Les tests quantitatifs PCR spécifiques à chaque espèce (qPCR) ciblant des fragments d’ADN mitochondrial permettent une détection très sensible et spécifique des taxons marins, y compris lescétacés 11, 12, 14. Au-delà de la détection de présence/absence, la force relative du signal d’eADN et les séquences d’ADN cibles fournissent des informations précieuses relatives à la proximité, à l’abondance relative et aux schémas génétiques au niveau de la population 15,16,17,18,19. De plus, les échantillons environnementaux collectés près des baleines contiennent fréquemment de l’ADN provenant de taxons coexistants, y compris des espèces de proies, des symbiotes et des parasites, soutenant des associations écologiques pluslarges 20,21,22. Collectivement, ces avancées démontrent le potentiel des approches basées sur l’ADN électronique pour compléter les méthodes traditionnelles et élargir le champ de la recherche sur les cétacés à travers les systèmesmarins 23,24.

Malgré ces avantages, la surveillance basée sur l’ADN électronique de la mégafaune marine rencontre des défis persistants liés à l’échantillonnage représentatif, à la couverture spatiale et à la reproductibilité méthodologique, en particulier dans les systèmes marins ouverts où l’ADN est rapidementdilué 25,26 et où les espèces cibles ont de vastes aires de répartition et se trouvent à faible densité. Répondre à ces contraintes nécessite des cadres d’échantillonnage évolutifs et opérationnellement réalisables, applicables à de larges échelles spatiales et temporelles. Les initiatives de science citoyenne se sont révélées efficaces pour étendre la collecte de données écologiques tout en favorisant l’engagement public dans la conservation marine, ce qui en fait une voie prometteuse pour un suivi à grande échelle basé sur l’ADNélectronique 27,28,29,30. Les navires d’observation des baleines représentent une plateforme sous-utilisée mais très adaptée pour l’échantillonnage d’ADN, offrant un accès régulier aux habitats des cétacés à travers les saisons et régions 31,32,33. L’industrie mondiale de l’observation des baleines soutient de vastes réseauxopérationnels 34, et des études antérieures ont démontré la faisabilité de collecter de l’ADN électronique de cétacés à partir d’autres plateformes opportunistes, telles que des navires commerciaux, des ferries35, et par un échantillonnage ciblé intégré à l’identification photographique et aux observationscomportementales 36,37. L’expansion rapide de la recherche sur l’eADN a conduit à une innovation méthodologique substantielle, mais la variabilité biologique entre les systèmes marins et le rythme des avancées technologiques compliquent les efforts d’harmonisation des protocoles et d’assurance de la comparabilité entre les études. Des méthodologies de terrain standardisées mais adaptables sont donc essentielles, en particulier pour les initiatives multinationales de surveillanceà grande échelle 38.

La détection de l’eADN est influencée par le volume d’eau filtrée, la stratégie de filtration, le matériau filtrant et la taille des pores. Filtrer de plus grands volumes augmente généralement les rendements d’ADN électronique et la probabilité de détection des cibles vertébrées, y comprisles cétacés 39,40,41,42. Dans les eaux productives ou troubles, cependant, l’efficacité de filtration peut être limitée par un bouchon rapidedu filtrage 43,44, nécessitant des compromis entre volume atteignable et faisabilitéopérationnelle 45,46. L’échantillonnage à partir d’empreintes de flambée — la perturbation de surface créée par le coup de queue d’une baleine — a constamment démontré qu’elle améliore la détectabilité de l’eADN des cétacés, car le matériel biologique récemment libéré est concentré près dela surface 24,41,42,47,48. L’utilisation de systèmes de filtration fermés et auto-conservants réduit les étapes de manipulation et les risques de contamination, les rendant bien adaptés aux applications de sciencecitoyenne 38,42. De plus, l’inclusion de réplicés biologiques et de contrôles de terrain de routine minimise les défaillances de détection et améliore la fiabilité desdonnées 49,50,51.

Développement et validation du protocole
Le projeteWHALE 52 est une initiative transnationale qui réunit chercheurs, opérateurs d’observation des baleines et citoyens scientifiques à travers l’Europe pour surveiller la mégafaune marine à l’aide de l’ADN électronique. Les efforts d’échantillonnage ont ciblé plusieurs taxons de cétacés à travers l’Atlantique Nord et la mer Méditerranée, en utilisant un protocole central avec des adaptations régionales adaptées aux conditions environnementales et logistiques locales.

Ici, nous présentons un protocole standardisé de début en bout pour la collecte d’ADN électronique de cétacés à partir de navires d’observation des baleines, affiné grâce à l’analyse de 308 échantillons d’ADN électronique d’eau de mer, incluant deux réplications par échantillon et 21 témoins de terrain, collectés lors de campagnes coordonnées en 2024 dans la baie de Skjálfandi (Islande), les Açores (Portugal) et la mer de Ligurie (Italie). La méthode intègre la collecte ciblée par empreintes de fluke, la filtration embarquée à l’aide de filtres à ADN électronique auto-conservants, et des analyses moléculaires en aval.

Ce protocole est conçu pour être mis en œuvre dans des conditions réelles d’observation des baleines par des chercheurs formés et des citoyens scientifiques, où la filtration à bord peut être réalisée dans des conditions de mer calmes à modérées sans perturber les activités d’observation des baleines. Sa mise en œuvre nécessite une coordination avec les organisations participantes (par exemple, les opérateurs d’observation des baleines, les organisations à but non lucratif, les institutions de recherche) pour définir les stratégies d’échantillonnage et les objectifs de recherche. Bien que les paramètres de base doivent rester fixes pour garantir la reproductibilité et la comparabilité croisée, des ajustements alignés sur les protocoles peuvent être nécessaires sur des sites à forte turbidité, mouvement du vaisseau ou contraintes de temps, d’espace ou de personnel. Ces adaptations incluent le type de filtre, le volume d’eau filtrée réalisable et des équipements auxiliaires. Ils doivent être appliqués de manière cohérente dans chaque campagne d’échantillonnage et rapportés de manière transparente. Des directives opérationnelles détaillées et des considérations logistiques sont fournies dans les étapes et discussions du protocole afin de soutenir la qualité des données, la transparence et la comparabilité régionale.

Conception du test qPCR
Pour évaluer la performance du protocole, l’ADN électronique des baleines à bosse (Megaptera novaeangliae), une espèce migratrice bien étudiée régulièrement observée dans la baie de Skjálfandi (Islande)53 et saisonnièrement présente auxAçores 54, a été amplifié à partir d’échantillons collectés sur le terrain. Les flux de travail de lyse, extraction et qPCR de l’ADN ont été initialement optimisés grâce à un test en anneau interlaboratoire impliquant quatre laboratoires participants au projet eWHALE, améliorant ainsi la cohérence et l’applicabilité entreles 14 institutions.

Pour détecter de manière fiable la présence d’ADN électronique de baleine à bosse, un test qPCR spécifique à chaque espèce pour MGB (ligant de sillons mineurs) ciblant la région mitochondriale ND5 a été conçu et validé selon les directivesétablies 55 (Tableau 1). Des amorces d’oligonucléotides et une sonde ont été générées à l’aide d’un logiciel pour l’alignement et l’analyse des séquencesd’ADN 56, visant à maximiser la spécificité des espèces et l’efficacité d’amplification (Fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S1). La spécificité du test a été évaluée in vitro à l’aide de taxons cibles et non cibles (Balaenoptera acutorostrata, Delphinus delphis, Physeter macrocephalus, Homo sapiens). Les concentrations d’ADN utilisées pour générer les courbes standard qPCR ont été quantifiées à partir d’un standard ADN issu 42,57,58,59,60. La limite de détection (LOD) de l’analyse, définie comme la concentration la plus faible produisant des amplifications positives dans 95 % des réplications de l’échantillon, a étédéterminée à 11,61. Les détections d’ADN électronique de baleine à bosse ont été évaluées pour des échantillons de terrain en estimant la proportion de réactions positives et la force du signal (c’est-à-dire le seuil de cycle, la valeur de Ct) pour chaque réplication d’échantillon lors des mesures qPCR tripliquées, afin de tenir compte de la variabilité de l’amplification et d’améliorer la fiabilité de la détection 57,60,62. Les détections d’espèces ont ensuite été vérifiées par séquençage Sanger bidirectionnel, suivi d’une confirmation via l’analyseBLAST 63.

Les données qPCR sont présentées sous forme de la moyenne ± de l’écart-type (SD). La signification statistique entre les groupes a été évaluée à l’aide du test U non paramétrique de Mann-Whitney et du test t à deux échantillons de Welch. Les différences étaient considérées comme significatives à p < 0,05. Toutes les analyses ont été réalisées à l’aide du logicield’analyse statistique 64.

Protocole

Éthique et conformité réglementaire
Tous les efforts d’observation des cétacés et les prélèvements d’eau qui s’ensuivent doivent être effectués conformément aux réglementations nationales et régionales sur la faune. Effectuer des prélèvements exclusivement sur des navires autorisés opérant sous des permis valides d’observation ou de recherche de baleines. Maintenir des distances d’approche minimales avec l’espèce cible telles que définies par la réglementation locale et éviter toute manœuvre destinée uniquement à des fins d’échantillonnage. Les échantillons de tissus de baleines utilisés pour la validation des essais ont été collectés sous les permis régionaux respectifs et partagés entre les partenaires du projet eWHALE en conformité avec les réglementations nationales et institutionnelles.

REMARQUE : Examinez les documents suivants avant toute activité d’échantillonnage et rassemblez le matériel nécessaire : tableau des matériaux, kit d’échantillonnage d’ADN électronique (fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S2), matériaux utilisés pour collecter des échantillons d’ADN environnemental (Figure 1) et un aperçu des étapes d’échantillonnage et du flux de travail de filtration embarqué (Figure 2).

1. Préparation de l’échantillonnage d’ADN électronique

  1. Préparez les documents de terrain, y compris les fiches techniques de terrain et le protocole de terrain plastifié (Fichier Supplémentaire 2 et Fichier Supplémentaire 3).
  2. Préparez des gants de rechange, des filtres de rechange (un filtre par échantillon répliqué), un marqueur étanche et un contenant dédié aux déchets (Figure 1A).
    REMARQUE : Utilisez des filtres à ADN électroniques auto-conservateurs fermés (pore de 1,2 μm) pour minimiser les risques de manipulation et de contamination65,66.
  3. Préparez un ou plusieurs seaux rigides, adaptés au type de navire et à la configuration embarquée (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S3).
    1. Marquez les seaux à 10 L avec un marqueur permanent. Préparez plusieurs petits seaux si la manipulation de 10 L est impraticable.
    2. Attachez une corde solidement au godet si la portée par-dessus bord est limitée.
      REMARQUE : Utilisez des seaux à couvercle pour minimiser les déversements lorsque le mouvement du récipient est excessif (Figure 1B).
    3. Préparez un contenant secondaire d’ADN électronique pour combiner des volumes plus petits et une boîte de transport supplémentaire pour garantir un transport sans contamination des seaux si nécessaire (Figure 1C).
  4. Préparez une pompe à eau péristaltique ou à vide portable (Figure 1D). Chargez complètement la pompe avant l’embarquement et coupez l’alimentation immédiatement avant l’utilisation.
  5. Attribuer des rôles d’échantillonnage, de filtration et d’enregistrement des données avant le départ.
    ATTENTION : Portez des gants lors de toute manipulation d’équipement et changez de gants entre les tâches.

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Figure 1 : Matériel de travail de terrain utilisé pour collecter des échantillons d’ADN environnemental. (A) Boîte à outils avec filtres eADN auto-conservants, conteneur à déchets, flacon presseur avec eau de Javel domestique diluée (1:10), gants, fiche technique de terrain et stylo imperméable ; (B) exemples de types de seaux pour l’échantillonnage d’ADN électronique ; (C) exemples de conteneurs eADN supplémentaires pour le transport et le filtrage de grands volumes et conteneur pour le transport de seaux à bord ; (D) exemples de pompes portatives pour la filtration de l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 2 : Schéma conceptuel de l’échantillonnage d’ADN environnemental à bord des bateaux d’observation des baleines. L’illustration décrit des étapes guidées, incluant la collecte d’échantillons d’eau et la filtration à bord. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

2. Nettoyage des équipements

  1. Mettez des gants jetables avant de nettoyer.
  2. Préparez une solution d’eau de Javel en diluant de l’eau de Javel domestique (hypochlorite de sodium à 5-6 %) à 1:10 avec de l’eau purifiée (~50 mL par trip).
  3. Appliquez la solution en éclaboussant uniformément toutes les surfaces sur tous les seaux, couvercles, contenants et tubes de pompe. Maintenez un temps minimum de contact avec l’eau de Javel de 2 à 5 minutes sur toutes les surfaces.
  4. Rincez soigneusement avec de l’eau du robinet 3 fois (Figure 3).
  5. Faites sécher les matériaux à l’air libre dans un endroit sécurisé et stockez-les dans un endroit sûr et propre avant l’embarquement.

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Figure 3 : Étapes pour le nettoyage du matériel. (A) Appliquer la solution d’eau de Javel domestique diluée (1:10) ; (B) s’étaler uniformément à l’aide de gants sans ADN ; (C) rincer soigneusement trois fois avec de l’eau du robinet ; et (D) répéter le processus pour des matériaux supplémentaires si applicable (par exemple, des contenants d’eADN). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

3. Collecte d’échantillons d’eau

REMARQUE : Respectez toutes les réglementations de sécurité à bord de chaque navire ou plateforme, y compris l’utilisation de gilets de sauvetage ou de salopettes de flottaison lorsque nécessaire.

  1. Emmenez tous les matériaux à bord avant l’arrivée des passagers et stockez-les dans un espace propre désigné.
  2. Coordonnez le moment d’échantillonnage et le positionnement du navire avec l’équipage du navire.
  3. Observez les schémas de resurfaçage pour anticiper les plongées de baleines (Figure 4). Mettez de nouveaux gants avant de prélever des échantillons.
  4. Collectez 20 L d’eau de mer dès que possible (pas plus de 10 minutes en accéléré) à partir de l’empreinte de la douche après la plongée de la baleine, afin de générer deux répliques d’échantillons de 10 L.
  5. Transportez l’eau collectée vers une station de filtration désignée à bord, à l’aide de couvercles ou d’un contenant stérilisé supplémentaire pour éviter les déversements (si nécessaire).
  6. Notez l’identité de l’espèce, les coordonnées GPS, l’heure et l’identification de la réplique de l’échantillon dans la fiche technique.
  7. Changez de gants immédiatement après votre rapport.

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Figure 4 : Séquence de la baleine à bosse qui émerge à la surface. (A) Souffle de baleine ; (B) cambrer le dos et lever la queue avant de plonger ; (C) motif d’empreintes de fléchette à la surface après la plongée de la baleine. Attribution de l’image : Ocean Missions (A,B,C, 2024). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

4. filtration de l’ADNe

  1. Ouvrez le sac filtrant et manipulez le filtre uniquement près de la sortie (Fichier supplémentaire 1 - Figure supplémentaire S4).
  2. Insérez l’entrée dans le tuba et connectez le tuyau de la pompe à la sortie (Figure 5A,B).
  3. Immergez le tuba dans l’échantillon d’eau sans immerger le boîtier du filtre (Figure 5C).
  4. Réglez la pompe (voir Tableau des matériaux pour les types de pompes) à un débit rapide et constant.
  5. Filtrez 10 L en continu tout en surveillant la stabilité du débit (vérifiez les bulles d’air, déchirures, déchirures ou défauts d’étanchéité).
    REMARQUE : Terminez la filtration à une durée maximale de 45 min.
  6. Inversez le filtre et faites tourner la pompe pendant 30 à 60 secondes pour éliminer l’eau résiduelle. Confirmez qu’il ne reste aucune humidité visible dans le boîtier du filtre.
  7. Coupez la pompe et débranchez le tuyau.
  8. Jetez le tuba dans le contenant à déchets, placez le filtre dans son sac d’origine et étiquetez-le immédiatement.
  9. Conservez les filtres à bord dans un contenant rigide fermé ou dans une boîte de refroidissement (si la température ambiante > 20 °C), à l’écart de la lumière directe du soleil et des zones passagers.
  10. Changez les gants et répétez la filtration pour la deuxième réplique.

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Figure 5 : Étapes pour configurer le système de filtration embarqué. (A) fixer l’entrée du filtre (partie blanche) au tuba (tub) ; (B) raccorder le tuyau de la pompe à la sortie du filtre (partie jaune) ; et (C) immerger une partie du tuba dans l’échantillon d’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

5. Contrôles négatifs sur le terrain et rapports de données

  1. Filtrez un contrôle négatif de champ après chaque cinq échantillons d’empreintes de fluke.
  2. Utilisez l’eau ciblée sans ADN immédiatement après son retour à terre et avant le nettoyage de l’équipement.
  3. Transférez toutes les données dans le tableau numérique d’échantillonnage d’eADN après chaque voyage (Fichier Supplémentaire 4).

6. Stockage et expédition filtrés

  1. Conservez les filtres à ADN électronique auto-conservants dans un contenant sûr et sec, dans une pièce ombragée à température ambiante — ou dans un réfrigérateur si la température ambiante dépasse 20 °C — pendant un maximum de 3 mois avant l’expédition.
  2. Inspectez visuellement les sacs filtrants pour détecter de l’humidité avant l’expédition.
  3. Marquez et envoyez les filtres dans des conteneurs isolés avec des plaques de glace vers le laboratoire désigné.

7. Analyse en laboratoire

REMARQUE : Effectuez toutes les procédures de laboratoire dans des pièces dédiées stérilisées aux UV, avec une ventilation adéquate et des établis séparés pour les PCR, en utilisant des gants sans ADN et des vêtementsde protection 55, 67, 68.

  1. Lyse de l’ADN
    1. Étiquetez un tube de réaction de 2 mL par filtre.
    2. Placez le filtre dans une fiole Erlenmeyer de 200 mL et jetez le couvercle en caoutchouc (Figure 6A).
    3. À l’aide de pinces sans ADN, repliez la membrane (fichier supplémentaire 1-Figure supplémentaire S5) en un triangle et transférez-la dans le tube de réaction de 2 mL, avec la pointe orientée vers le bas (Figure 6B-D).
    4. Ajoutez 380 μL de tampon TES et 20 μL de protéinase K (voir le tableau des matériaux) à chaque tube de réaction, ce qui donne 400 μL de tampon de lyse (Figure 6E).
    5. Vortex brièvement et incuber à 56 °C pendant ≥3 h avec agitation (Figure 6F).
    6. Centrifugeuse à 18 626 × g pendant 10 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Un lysat clair à légèrement coloré indique une digestion réussie.
      REMARQUE : Le protocole peut être temporairement arrêté à ce stade si les lysats sont stockés à -20 °C.
  2. Extraction d’ADN
    1. Couver les lysats à 56 °C pendant 10 minutes avant l’extraction.
    2. Réactifs d’extraction de pipettes dans les plaques de lavage et les plaques d’élution, tenant compte des contrôles négatifs et des erreurs de pipetage69 (voir Fichier Supplémentaire 1-Tableau Supplémentaire S1).
    3. Incluez un blank d’extraction par plaque à l’aide du tampon TES.
    4. Transférez 300 μL de lysat dans chaque puits de la plaque de liaison. Ajoutez 300 μL d’AL tampon et 300 μL d’alcool isopropylique à chaque puits. Utilisez plusieurs plaques de liaison si le volume total de lysat dépasse 300 μL et ajoutez 30 μL de particules magnétiques pour la liaison des acides nucléiques par puits à la première plaque de liaison (Tableau des matériaux).
    5. Couvrez la plaque de liaison avec un couvercle de tige.
    6. Exécutez le programme préliminaire d’absorption de l’ADN pour deux plaques de liaison (un total de 400 μL de lysat ; voir le tableau des matériaux et la figure 7) ainsi que le protocole d’extraction automatisée sur un robot de laboratoire à billes magnétiques.
    7. Jetez les produits chimiques d’extraction dans des conteneurs à déchets désignés.
    8. Transférer l’ADN élué dans des tubes de réaction marqués de 1,5 mL et stocker à −20 °C.
      REMARQUE : Le protocole peut être temporairement interrompu à ce stade. Des étapes supplémentaires de retrait des inhibiteurs peuvent être réalisées à ce stade.
  3. qPCR
    1. Préparez et quantifiez les standards de l’ADN des espèces cibles à l’aide d’extraits de tissu et d’un test dsDNA à haute sensibilité basé sur la fluorescence, conformément aux instructions du fabricant (Tableau des matériaux). Générez une courbe standard à huit points par dilution série (1:10) à partir de 10 ng/μL11,55. Des normes aliquotes avant la qPCR pour minimiser les cycles de gel-dégel.
      REMARQUE : Le protocole peut être temporairement interrompu à ce stade.
    2. Préparez toutes les réactions qPCR en triple exemplaire à l’aide de plaques à 96 puits.
    3. Inclure un contrôle sans gabarit (eau de qualité moléculaire) et un blank d’extraction par plaque qPCR.
    4. Préparez le master mix selon le fichier supplémentaire 1 - Tableau supplémentaire S2 et la figure 8A.
    5. Dans une hotte de chargement d’ADN, ajoutez les standards d’ADN préalablement préparés et 3 μL d’extrait d’ADN à chaque puits contenant le mélange maître (Figure 8B).
    6. Scellez la plaque avec un film d’étanchéité (Figure 8C).
    7. Centrifugez à 3 500 × g pendant 10 s et chargez-la dans le thermocycleur quantitatif PCR en temps réel (Figure 8D,E).
    8. Effectuez le test dans des conditions de cycle optimisées, spécifiées dans le tableau 2, et enregistrez les données à l’aide du logiciel du fabricant (Table of Materials)11.

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Figure 6 : Flux de travail pour la lyse de l’ADN. (A) Retirer le bouchon en caoutchouc du filtre eADN auto-conservateur et le placer dans un flasque d’Erlenmeyer ; (B) stériliser deux paires de pinces en les enflammant trois fois ; (C) plier la membrane filtrante ; (D) l’insérer dans un tube de 2 mL ; (E) ajouter le tampon de lyse et la protéinase K, et (F) incuber des échantillons à 56 °C pendant 3 heures. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Matériaux et équipements utilisés pour l’extraction d’ADN. (A) Lier, laver et élutionner les plaques, consommables et réactifs pour la préparation à l’extraction ; et (B) le robot de laboratoire à billes magnétiques utilisé pour le traitement des échantillons. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 8 : Flux de travail pour qPCR. (A) Préparer le master mix dans une pièce précédemment stérilisée aux UV (sous une hotte de travail dédiée à la préparation des master mixes) ; (B) charger des standards, extraits et contrôles d’ADN dans une station de chargement d’ADN suivant le motif montré ; (C) plaque de scellement ; (D) centrifugeuse ; (E) chargez dans le thermocycleur quantitatif PCR en temps réel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Résultats

Un total de 154 échantillons d’empreintes de flambée (308 filtres eADN) ont été collectés en 2024 grâce à ce protocole optimisé, comprenant 96 filtres dans la baie de Skálfandi (Islande ; 9 témoins de terrain et 76 répliques de baleine à bosse) obtenus de mars à novembre, 151 filtres aux Açores (Portugal ; 12 témoins de terrain et 15 réplications de baleine à bosse) obtenus en juillet et 61 filtres en mer de Ligurie (Italie ; 4 témoins de terrain) obtenus de mai à octobre. Tous les échantillons impliquaient la collecte de jusqu’à 10 L d’eau de mer (deux réplications par échantillon d’empreinte fluke) à l’aide de filtres eADN auto-conservants (Tableau 3). Deux types de contrôles négatifs ont été collectés lors des travaux de terrain : l’eau purifiée filtrée après nettoyage de l’eau de Javel de l’équipement, et l’eau de mer recueillie lors de la réentrée dans le(s) port(s)42. Ce dernier a été intentionnellement filtré avant le nettoyage de l’eau de Javel afin d’évaluer une éventuelle contamination croisée avec l’ADN électronique des cétacés lors de l’échantillonnage. Les échantillons étaient expédiés de chaque site d’échantillonnage en deux lots vers l’Unité de recherche en écologie animale appliquée, Département de zoologie de l’Université d’Innsbruck (Autriche) pour traitement en laboratoire.

Analyse et performance de contrôle
Un sous-ensemble de 44 filtres (30 répliqués incluant 2 témoins de terrain de la baie de Skjálfandi, Islande, et 14 filtres, dont 1 témoin de champ des eaux entourant l’île de Faïal et Pico, aux Açores, au Portugal) a été analysé pour l’ADN électronique de la baleine à bosse (Figure 9). Le signal a été mesuré en réactions qPCR tripliquées. Un échantillon (c’est-à-dire un filtre eADN) était considéré comme positif, si une qPCR sur trois se réplique amplifiée. La limite de détection (LOD) du test dans cette étude a été calculée à 0,0001 ng/μL (Ct moyen du LOD = 35,8). Parmi les 41 filtres analysés, 20 (49 %) ont donné des amplifications, tandis que 24 (58 %) n’ont montré aucune amplification. Les non-détections (absence de valeur Ct) reflètent très probablement soit l’absence, soit des concentrations extrêmement faibles d’ADN cible. Les non-détections comprenaient 5 des 13 filtres provenant des Açores (38 %) et 19 des 28 filtres d’Islande (68 %). Les blancs d’extraction ont été examinés pour l’ADN de vertébrés marins à l’aide du testMarVer3 70 et n’ont montré aucune amplification détectable, indiquant qu’il n’y avait pas de contamination croisée lors de l’extraction de l’ADN. Les contrôles de terrain (NC) et les contrôles qPCR (NT) n’ont donné aucune amplification, confirmant l’absence de contamination lors du travail de terrain et du dépistage qPCR (Tableau 4).

Parmi les 20 filtres positifs, neuf (22 %) ont donné au moins une valeur de Ct en dessous de la limite de détection de l’analyse (LOD ; 0,0001 ng/μL) et ont donc été classés comme détections fiables. Cela comprenait 4 des 8 filtres des Açores (50 %) et 5 des 12 filtres d’Islande (42 %). 11 filtres supplémentaires (27 %) ont produit une ou plusieurs valeurs de Ct au-dessus du LOD, comprenant 4 filtres des Açores (50 %) et 7 d’Islande (58 %), indiquant des détections plausibles (Figure 10). L’analyse comparative a révélé une valeur de seuil de cycle moyen (Ct) légèrement plus basse pour les filtres des Açores (34,7 ± 3,60 ; n = 8) comparé aux filtres islandais (36,9 ± 3,60 ; n = 10). Le test U de Mann-Whitney a démontré que cette différence n’était pas statistiquement significative (U = 199,0, p = 0,204). Étant donné la relation inverse entre la valeur de Ct et la force du signal ADN, les résultats indiquent des concentrations légèrement plus élevées d’ADN électronique cible de baleines à bosse dans les filtres des Açores (Figure 11).

Contraintes de faisabilité
Le nombre d’échantillons d’empreintes de fluke par voyage variait selon la durée du trajet et les conditions météorologiques. Environ deux à trois échantillons (jusqu’à six filtres eADN) ont été prélevés lors de missions de 3 h aux Açores, deux à quatre échantillons durant ~8 heures en Italie (obtenant jusqu’à huit filtres), et un à deux échantillons (jusqu’à 4 filtres) lors de missions de 3,2 heures en Islande. Les performances de filtration étaient généralement élevées aux Açores et en Italie. Aux Açores, 10 L d’eau de mer ont été filtrés de façon constante en 10-15 minutes, tandis qu’en Italie, le même volume a été filtré en environ 10 minutes. En Islande, les volumes filtrés variaient de 4,5 à 10 L (moyenne = 8,5 L), avec un temps de filtration moyen de ~40 min dû à des bouchons fréquents du filtre, probablement à cause des particules dans l’eau de la zone étudiée. Plus précisément, 10 L ont été filtrés avec succès pour 46 des 98 filtres (47 %), des volumes entre 7 L et 10 L ont été obtenus pour 31 filtres (32 %), et des volumes entre 4 L et 7 L ont été obtenus pour 21 filtres (21 %) (Fichier supplémentaire 1-Tableau supplémentaire S3).

Le protocole recommande la filtration d’un témoin négatif de champ après chaque cinq échantillons d’empreintes de fluke. Cependant, dans des conditions opérationnelles d’observation des baleines, cela n’a pas pu être entièrement réalisé dans l’étude de cas décrite en raison de contraintes logistiques, notamment la disponibilité limitée des filtres, les contraintes de temps et les retards d’expédition. Cela a réduit les ratios témoins/échantillons réalisables à 1:10,7 en Islande (9/96), 1:12,6 aux Açores (12/151) et 1:15,3 en Italie (4/61). Malgré ces écarts, aucun contrôle négatif sur le terrain ou en laboratoire n’a montré d’amplification.

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Figure 9 : Aperçu des emplacements des échantillons. Des points noirs sur la carte représentent les lieux où des échantillons ont été prélevés sur une empreinte de bataille de baleine à bosse dans la baie de Skjálfandi (Islande) et aux Açores. Le nom du filtre eADN est indiqué près de la région d’échantillonnage correspondante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 10 : Détections à partir d’un sous-ensemble de filtres d’ADN électronique des Açores et de l’Islande. QPCR signifie les valeurs de Ct et la force du signal ADN pour les détections positives aux Açores et en Islande (au moins un réplicat positif par PCR), avec SD et LOD. Les barres sont colorées selon la force du signal par rapport au LOD : bleu foncé = signal fort (Ct ≤ 35,8) indique des détections fiables, bleu clair = signal faible (Ct > 35,8) indique des détections plausibles. Les barres d’erreur SD représentent la variabilité entre les réplications PCR. La ligne rouge pointillée indique le LOD (Ct = 35,8). Les valeurs moyennes de Ct sont indiquées au-dessus de chaque barre. Abréviations : Ct = seuil de cycle ; SD = écart-type ; LOD = limite de détection. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

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Figure 11 : Valeurs moyennes du seuil de cycle pour la détection d’ADN des baleines à bosse aux Açores et en Islande. Les lignes noires à l’intérieur des boîtes indiquent la médiane, et les carrés rouges représentent les valeurs moyennes de Ct (SD), tandis que les moustaches représentent les valeurs minimales et maximales pour les Açores et l’Islande. Le test U de Mann-Whitney a démontré que cette différence n’était pas statistiquement significative (U = 199,0, p = 0,204). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

Tableau 1 : Séquences d’amorce et de sonde pour le test qPCR ciblé sur ND5. Ces séquences incluent des amorces avant et arrière, des séquences de sonde MGB (5′-3′), la température optimale de recuit et la limite de détection (LOD) par test. (*) La LOD est définie comme la plus faible concentration d’ADN (ng/μL) de l’ADN de l’espèce cible, à laquelle ≥95 % des réplications PCR ont donné une amplification positive. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 2 : Conditions de cyclage optimisées pour le test qPCR eDNA de la baleine à bosse. Ces réglages optimisés de qPCR sont 95°C pendant 10 minutes (activation enzymatique), puis 40 cycles à 95°C pendant 15 s (dénaturation) et 60°C pendant 90 s (recuit/extension). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 3 : Aperçu de la configuration de l’échantillonnage sur le terrain. Aperçu des régions d’échantillonnage, des partenaires de terrain, des types de navires, des espèces ciblées, des périodes d’échantillonnage et des réplications d’échantillons à travers les Açores, l’Islande et l’Italie. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Tableau 4 : résumé de la détection qPCR pour les échantillons environnementaux et les témoins témoins. Les détections positives (surlignées en jaune), la qPCR répliquent les valeurs de Ct et les résultats de détection sont affichés ; les échantillons ont été classés positifs lorsqu’au moins un des réplicés qPCR a montré une amplification. « No Ct » indique aucune amplification, les contrôles négatifs n’ont montré aucune amplification, et la série de dilution standard de M. novaeangliae utilisée pour définir la performance du test et le LOD est incluse en bas du tableau. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Fichier supplémentaire 1 : Contient des figures et tableaux supplémentaires, fournissant des informations supplémentaires sur l’application du protocole, y compris le kit d’échantillonnage d’eDNA pour la conception de l’amorce, les types de navires d’observation des baleines, les caractéristiques du filtre à ADN auto-conservant, les volumes de réactifs pour l’extraction d’ADN et les réactions qPCR, ainsi que les variations des taux de filtration selon les régions d’échantillonnage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 2 : Fiche technique de terrain utilisée lors de l’échantillonnage d’ADN électronique des cétacés. Formulaire standardisé pour enregistrer les métadonnées de croisière, les observations des cétacés, ainsi que les informations d’échantillonnage et de filtre. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Dossier supplémentaire 3 : Protocole de terrain étape par étape pour l’échantillonnage d’ADN électronique des cétacés à bord des navires d’observation des baleines, incluant le nettoyage des équipements, la collecte de l’eau de mer et la filtration à bord, le rapport d’échantillons et le stockage. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 4 : Modèle de feuille de calcul d’échantillonnage d’ADN électronique pour cétacés. Formulaire standardisé pour enregistrer les informations d’échantillonnage après la collecte et la filtration embarquée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Faisabilité opérationnelle et mise en œuvre sur le terrain
Le protocole présenté ici apporte un flux de travail standardisé à l’ADN électronique qui équilibre la sensibilité à la détection avec les contraintes réelles. En intégrant un échantillonnage à grand volume ciblant flukeprint, une filtration embarquée à l’aide de filtres fermés auto-conservants, et des mesures standardisées de contrôle de la contamination, le protocole offre un cadre reproductible pouvant être appliqué à travers les régions et les campagnes d’échantillonnage. Cette approche s’inscrit dans la reconnaissance croissante de l’ADN électronique comme complément économique et évolutif aux techniques conventionnelles de surveillance marine 9,10,22.

Les précédentes études sur l’eADN sur les cétacés se sont largement appuyées sur des échantillonnages d’eau de mer basés sur des transects provenant de grands navires de recherche ou sur des échantillonnages opportunistes de petit volume près des observations de cétacés. Les approches basées sur les transects permettent une large couverture spatiale mais capturent souvent des signaux d’ADN dilués et découplés temporellement, limitant la détection d’espèces rares outransitoires 71, même lorsque l’échantillonnage est proche de la surface, nécessitant généralement des vaisseaux spécialisés etdes infrastructures 25,37,72. Inversement, un échantillonnage en faible volume près des baleines en surface améliore la spécificité de la rencontre mais reste sujet aux faux négatifs en raison de volumes d’eau limités et de pratiques de filtrationincohérentes 72,73. En ciblant explicitement les empreintes de flukeempre et en filtrant de grands volumes à bord, le flux de travail présenté ici augmente la probabilité de capturer l’ADN électronique de cétacés à faible concentration tout en restant réalisable sous les contraintes de temps et d’espace typiques des opérations d’observation des baleines. L’utilisation de filtres fermés et auto-conservants minimise encore les risques de manipulation et de contamination, éliminant le besoin de tampons de conservation appliqués sur le terrain et simplifiant la logistique dans des conditions à bordcontraintes 42,66.

Pour garantir la comparabilité croisée, les paramètres suivants doivent rester fixes au sein d’une campagne d’échantillonnage : collecte directe d’eau de mer à partir d’empreintes de doublures de cétacés visibles ; deux répliques biologiques de 10 L par empreinte de colère ; l’utilisation de filtres à ADN électroniques auto-conservants est implacable lors des mesures standardisées de contrôle de la contamination, y compris des contrôles négatifs réguliers sur le champ à une fréquence minimale définie ; et un dépistage qPCR spécifique à chaque espèce effectué en triple exemplaire avec des témoins appropriés. D’autres paramètres peuvent varier sans compromettre le cadre méthodologique, à condition qu’ils soient appliqués de manière cohérente et transparente, notamment l’équipement et la manipulation de l’eau, la taille des pores du filtre, le type de pompe et la configuration du tube, la durée de filtration et le volume filtré atteignable en conditions de bouchon, la logistique des échantillons à bord et les conditions de stockage à court terme avant l’expédition. Comme de nombreuses étapes de traitement dans les études d’eADN restent variables, il est fortement recommandé de rapporter rigoureusement toutes les étapes d’échantillonnage et d’analyse.

La faisabilité de ce protocole est la plus élevée en état de mer calme à modérée (≤ Beaufort 3), avec une turbidité faible à modérée, lorsque le temps et l’espace à bord permettent le traitement de deux filtres à ADN électronique par empreinte flukeprint et d’un volume d’eau filtré de 10 L par filtre. En pratique, des scientifiques formés peuvent échantillonner jusqu’à Beaufort 3, mais les citoyens scientifiques ne devraient travailler que dans des conditions calmes (Beaufort 1-2), en raison du mouvement et des turbulences des navires, malgré des missions d’observation des baleines qui se déroulent parfois à Beaufort 3. La filtration doit commencer dès que possible après la collecte d’eau afin de minimiser la dégradation del’ADN 47,74. Les stratégies d’échantillonnage qui minimisent la dilution de l’ADN électronique de surface induite par l’hélice, telles que l’échantillonnage sous le vent et les côtés inférieurs du navire, renforcent la précision du ciblage et la fiabilité desdétections 47. Éviter les manœuvres inverses et empêcher les cordes (attachées à des seaux) de toucher les échantillons d’eau de mer réduit encore le risque de contamination, conformément aux meilleures pratiques d’ADNaquatique 38. Selon la configuration et la logistique du navire (par exemple, hauteur, mouvement et espace disponible à bord), deux stratégies d’échantillonnage sont prises en charge si appliquées de manière cohérente : (i) la collecte et la filtration indépendantes de deux répliques de 10 L à l’aide de deux seaux séparés, ou (ii) la collecte d’un seul échantillon d’eau de 20 L transférée dans un contenant stérile scellé pour un transport sécurisé à bord, puis divisée en deux répliques de 10 L pour la filtration. Un volume de filtration de 10 L par filtre représente un compromis pratique entre la probabilité de détection et l’effort de filtration dans des conditions d’observation des baleines.

Des volumes plus importants augmentent la probabilité de capture d’ADNe électronique rare ou de faible concentration, et réduisent les faux négatifs courants dans les études sur lescétacés 39,40,75, tout en restant opérationnellement réalisables lorsqu’ils sont associés à des filtres auto-conservants et à de grandes tailles de pores 42. Des charges de particules élevées, des mouvements du navire, un espace de pont limité ou des contraintes de temps peuvent réduire l’efficacité de filtration et les volumes atteignables, limitant ainsi l’applicabilité du protocole. Dans de tels cas, des adaptations alignées sur les protocoles, telles que la réduction des volumes d’eau ou des tailles alternatives de pores de filtre, peuvent être nécessaires et doivent être appliquées de manière cohérente au sein des campagnes d’échantillonnage afin de maintenir la comparabilité des données. La durée du voyage, le moment des rencontres avec les baleines et la capacité de filtration déterminent le nombre d’échantillons atteignable. Lors des excursions standard de 3 heures pour observer les baleines, un à deux échantillons d’empreintes de flukemark (parfois trois) peuvent généralement être réalisés sans perturber les opérations ni l’expérience de science citoyenne. Lors des expéditions plus longues, la capacité d’échantillonnage s’adapte à l’effort quotidien d’observation des baleines (par exemple, ~8 h/jour dans notre étude de cas en Italie). En pratique, l’échantillonnage d’eDNA pourrait être mis en œuvre dans les trois sites lors des pics d’activité touristique.

Succès de l’amplification de l’eADN et contrôle de la contamination
Les échantillons environnementaux, en particulier ceux collectés dans des eaux riches en nutriments, peuvent contenir des inhibiteurs PCR capables de supprimer l’amplification et de générer des fauxnégatifs 76. Bien qu’aucune inhibition n’ait été détectée lors d’analyses antérieures sur des échantillons islandais dans le même projet42, l’inclusion d’une étape de retrait des inhibiteurs a assuré un succès constant de l’amplification (voir Tableau des matériaux) et correspond aux recommandations de bonnes pratiques pour les flux de travail d’eADNaquatique 14,55.

Une performance constante de détection qPCR entre régions indique que le protocole capture de manière fiable l’ADN électronique des cétacés dans des conditions environnementales diverses. De légères variations de Ct reflètent probablement des différences régionales de température, de turbidité et de productivité, qui influencent la libération, la dégradation et la dispersion de l’eADN75,76. La limite de détection du test (0,0001 ng/μL) se situe dans la plage de sensibilité rapportée pour d’autres tests validés sur les cétacés développés dans le cadre du projeteWHALE 14,11,42. Les taux de détection étaient cohérents avec les études antérieures publiées basées sur des empreintes de fluke, soulignant l’influence du comportement de l’espèce et de la fréquence des apparitions sur le succès de la détection 41,42,47. Des standards d’ADN issus des tissus ont été utilisés pour la quantification de la qPCR, reflétant une pratique courante dans la recherche sur l’ADN numérique 57,72,77,78,79. Bien que cette approche puisse introduire une variance dans la quantificationabsolue 11,61,80,81,82,83, en particulier pour les échantillons environnementaux à faible concentration et hétérogènes84,85, elle reflète la complexité réellede l’échantillon 55,86. L’utilisation d’étalons synthétiques pourrait améliorer la reproductibilité quantitative et la comparabilité inter-études, et est recommandée pour de futuresapplications 11,87.

Les sources potentielles de contamination incluent le transfert croisé d’échantillons, ainsi que l’introduction d’ADN humain ou non ciblé lors des étapes de manipulation, ce qui peut entraîner des faux positifs88. Un contrôle strict de la contamination est essentiel lors des traitements de terrain et en laboratoire, en particulier dans les conditions contraintes typiques des opérations de science citoyenne. Les changements de gants de routine, l’utilisation d’équipements sans ADN, de systèmes de filtration fermés, la formation standardisée, l’inclusion régulière de contrôles sur le terrain et en laboratoire, la documentation des événements de contamination potentiels et la validation des essais selon les cadres établis sont essentiels pour garantir la fiabilité des données et la détectiondes espèces 11,31,49,51,55,89. Bien que l’utilisation du plastique soit une limitation inévitable de l’échantillonnage moléculaire sur le terrain, la consommation a été minimisée lorsque cela était possible, et des matériaux de filtration partiellement biodégradables ont été utilisés66.

Limitations, évolutivité et implications futures
Le bouchon du filtre reste une contrainte clé dans des environnements turbulents ou productifs comme la baie de Skjálfandi (Islande), où la matière organique en suspension et la densité du plancton ont probablement réduit l’efficacité de filtrationà 43,90. L’enregistrement de la durée de filtration, les indicateurs de bouchon du filtre tels que la réduction du débit, la présence de bulles d’air visibles dans le filtre ou la déformation de la pompe, ainsi que la limitation du temps de filtration à environ 45 minutes par réplication permettent l’interprétation et la comparaison en aval. L’utilisation d’un dispositif flottant stérilisé pour suspendre le filtre ou des sacs de filtration alimentés par gravité peut potentiellement réduire le temps de manipulation pendant la filtration, bien que ces derniers puissent être incompatibles avec les filtres à ADN électronique auto-conservants et les grands volumes (≥1 L)91. Des filtres de pores plus grands (≥ 5 μm) peuvent encore améliorer les taux de filtration, bien que l’efficacité de détection spécifique au taxon doive être évaluée lors d’un échantillonnage pilote pour l’ADN électronique descétacés 45,92.

Les considérations clés avant l’échantillonnage à grande échelle incluent : la priorité accordée à la filtration embarquée plutôt qu’un traitement différé, le maintien de volumes d’eau et une configuration de filtre constants, la réalisation d’échantillonnages pilotes pour optimiser la filtration dans des conditions locales, et l’alignement de l’effort d’échantillonnage avec la capacité du navire et la durée du trajet. Des outils de saisie de données numériques permettant un enregistrement structuré sur le terrain par des citoyens scientifiques sont recommandés pour les applicationsfutures 93.

L’application réussie de ce flux de travail de bout en bout démontre sa robustesse sous contraintes opérationnelles tout en mettant en lumière les limites liées à l’espace, au temps, aux conditions météorologiques et aux risques de contamination inhérents aux contextes de la sciencecitoyenne 10,94. Malgré ces contraintes, les navires d’observation des baleines représentent une plateforme puissante et sous-utilisée pour le suivi des cétacés à ADN lorsque la formation et la supervision standardisées sontassurées 31,32,42,95. L’intégration de ce flux de travail avec des outils établis de surveillance des cétacés, tels que l’identification photo, l’acoustique passive et l’échantillonnage par biopsie, peut relier les détections génétiques aux données comportementales et démographiques. Bien que cette étude se concentre sur la détection spécifique à l’espèce par qPCR, de futures applications pourraient intégrer le métabarcoding de l’ADN ou des analyses génétiques de population, élargissant ainsi la valeur écologique et de conservation de la surveillance de l’eADN des cétacés.

À mesure que les approches basées sur l’ADN électronique continuent de prospérer, ce flux de travail offre une base évolutive pour intégrer la surveillance génétique dans les programmes existants d’observation et de conservation marine, en particulier dans les zones chaudes des cétacés et les écosystèmes sensibles.

Déclarations de divulgation

Belén García Ovide est la fondatrice et directrice exécutive d’Ocean Missions, une organisation à but non lucratif axée sur la conservation des océans et basée à Húsavík, dans le nord-est de l’Islande. Ocean Missions coordonne les prélèvements provenant des navires d’observation des baleines en Islande, ainsi que des navires d’expédition arctiques. Elle représente également North Sailing, une entreprise d’observation des baleines à Húsavík, dans le cadre du projet eWHALE. Ces affiliations n’ont pas influencé la conception de l’étude, la collecte des données, l’analyse ou l’interprétation des résultats.

Remerciements

Nous souhaitons remercier toutes les personnes impliquées dans le travail de terrain et en laboratoire, à savoir :

i) Aidan Mabey, Matteo Tosato, Anouk Adolph, Jeanne Laporte, Romi Neerot et Isabell Österle, qui ont participé à des échantillons collectés dans la baie de Skjálfandi, en Islande ; ii) Dania Tesei, Michael Costa, Rita Norberto, Marlene Schwandt, Rita Leitão, Ricardo Ventura, Martijn Schouten, Giada Viscontini, Katharina Leeb, Anthony Le Floch, Francisco Nunes, Renato Cardoso, Faustine Darius, Monique Schouten, Laura Biet aux Açores (Portugal) ; iii) Sandra Schallhart, Jana Robertson en Autriche ; et iv) Sabina Airoldi, Mario Gabualdi, Marina Costa, Morgana Vighi, Nino Pierantonio, Roberto Raineri pour la collecte de données dans le sanctuaire de Pelagos (Italie).

Cette recherche a été financée par Biodiversa+, le Partenariat européen pour la biodiversité dans le cadre de l’appel conjoint BiodivProtect 2021-2022 pour les propositions de recherche, cofinancée par la Commission européenne (GA n° 101052342) et avec les organismes de financement : 1) Le Centre islandais de recherche (RANNÍS), (subvention n° 229030), 2) le Ministère des Universités et de la Recherche (MUR), à partir du compte spécial FIRST et IGRUE relatif au partenariat européen Biodiversa+ Call 2021 - projet eWHALE, 3) le Fonds autrichien pour la science (FWF) [doi : 10.55776/I6389] et le fonds de publication de l’Université d’Innsbruck.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Filtres eADN alternatifs : SterivexTM / WaterraMerck Millipore/Waterra Pumps LimitedSVHVL10RC/NA0,45 & micro ; M pores. Exiger des tampons de préservation de l’eADN  ;
AW1, AW2, tampons AEQiagen  ;   ;19081, 19072, 19077Solutions tampons utilisées pour la purification de l’ADN lors de l’extraction
Solution d’eau de Javel (1:10)MJ - Denk mit, HygienereinigerPersonnaliséDécontamination de surface. Toutes les étapes des processus de laboratoire
SeauxBoutiques de plaisance, matériel de pêche, AmazonRigide. Caoutchouc ou plastique dur (&ge ; 10 L). Une ou plusieurs selon la configuration du prélèvement et la logistique embarquée
Réactif de nettoyage, Express PCR  ;ExoSAP-IT75001.1.EAPréparation des produits PCR pour le séquençage Sanger
Boîte de refroidissementLogementContenant rigide isolé ou sac de refroidissement
Gants jetables, tailles Large (L) et Medium (M),
sans poudre		Kimberly-Clark43431, 55090Gants jetables en nitrile ou en latex, boîte de 100 unités. Quantité requise : 1 boîte pour 10 - 15 trajets
Normes ADN (3 & mu ; L)  ;NAPersonnaliséDilution en série d’ADN tissulaire (8 points, 10 ng/& micro ; L) de baleine à bosse. Étalonnage en qPCR
Vêtements de laboratoire sans danger ADNFalano, PP-Overall081-2900Toutes les étapes des processus de laboratoire.
Conteneur d’ADNeMagasins d’habitation ou de quincaillerieNACouvercle, durable, transparent (&ge ; 10 L).   ;
Plaque d’élution, couvercle de tige, plaques de lavage, plaque de liaisonQiagen19581, 997004, 1031656, 302570Plastiques utilisés pour l’extraction d’ADN & nbsp ;
Éthanol (8:10)Endure, ACS ISO sonneDiversStérilisation au banc. Toutes les étapes du laboratoire
Fiches techniques de terrain
Essai à haute sensibilité basé sur la fluorescenceThermo Fisher ScientificQ32851Essai à haute sensibilité dsDNA de Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis)
Centrifugeuse à grande vitesse (24 000 tr/min)Hettich Zentrifugen  ;Sépare le surnageant contenant de l’ADN des débris. Lyse de l’ADN
Plaques de glaceMagasins d’habitationRefroidissement des échantillons à l’intérieur d’un conteneur maritime
Amorces IPC directe et inverseTechnologies ADN intégréesNAProduit personnalisé utilisé pour l’amplification de l’ADN des espèces cibles
Sondes qPCR IPC PrimeTimeTechnologies ADN intégréesNAProduit personnalisé utilisé pour l’amplification de l’ADN des espèces cibles
Hotte à écoulement laminaire & nbsp ;Produits du laboratoire KendroVFS1206Environnement stérile pour la préparation de réactifs dans la préparation qPCR
Protocole de champ illustré laminé   ;Personnalisé
Tampon de lyseQiagen79216Tampon de lyse DNeasy AL. Alternative au tampon TES + Protéinase K
Magnétique de perles & ndash ; Robot ADN baséTête PCR KingFisher Apex 965400910Logiciels : BindIx PC  ;
Particules magnétiques pour la liaison aux acides nucléiques (30 & micro ; L)Qiagen67563Des particules MagAttrait. Facilite la liaison de l’ADN aux billes magnétiques lors de l’extraction d’ADN
Master mix (5 & mu ; L)EMM, Life Technologies4396838TaqMan Mix Maître Environnemental (2.0)
Mini-centrifugeuse à plaques tournantes   ;LabnetC1000Distiller les gouttelettes liquides et la condensation provenant de la PCR et des microplaques
Kit d’élimination des inhibiteurs PCR OneStep-96Recherche ZYMOD6035Purification et élimination des contaminants dans les extraits d’eADN   ;
Plaques PCRBio-RadHSP9601Hard-Shell 96-Puits
Pipettes + pointes filtrées stérilesPipettes : BIOHIT, Embouts de filtre : Biozym Safe & nbsp ; Conseils pour les scellés & nbsp ; ProfessionnelDiversDes pipettes manuelles ou électroniques peuvent être utilisées à différents volumes maximaux
Centrifugeuse à trotage à plaques   ;NANAEnlève les bulles avant qPCR  ;
Protéinase KAvantor VWRA4392.0010Digère les protéines pour aider à libérer l’ADN lors de la lyse
Eau purifiéeMilliQNAEau sans RNASE, utilisée pour les contrôles négatifs et la solution de nettoyage   ;
Tubes de réaction (2 mL)Eppendorf30120094Lyse de l’ADN
Thermocycleur quantitatif PCR en temps réelAnalytikjenaNAPlateforme QTower 3G. Amplifie et quantifie l’ADN en temps réel
CordesNavigation de plaisance, quincailleries, ports de pêcheNAMatériau résistant (par exemple, polyéthylène ou corde tressée). Longueur au moins deux fois la hauteur du navire
Film d’étanchéité, adhésif, optiqueBio-RadMSB1001Microsceau 'B'. Scellez la plaque PRC avant la PCR
Filtres eADN auto-conservantsSmith-Root  ;11579-251.2 & micro ; M pores. Montant par campagne d’échantillonnage : selon les besoins
Conteneur maritimeLaboratoires, pharmacies, AmazonDiversIsolation en polystyrène
Logiciels pour l’alignement et l’analyse de séquences biologiquesÉdition de la biographieVersion 7Éditeur et programme d’analyse d’alignement de séquences biologiques convivial pour Windows 95/98/NT
Bouteille à presserLaboratoires, pharmaciesDiversRempli d’eau de Javel ménagère (1:10)
Logiciels d’analyse statistiqueÉquipe R Studio. (2023)Version 4.2.1
Gants stérilisés sans ADNSempercare  ; Édition79712Toutes les étapes des processus de laboratoire.
Tampon TESProduit personnalisé, équivalent au tampon de lyse DNeasy
Contenant de déchets toxiquesÉlimination sécurisée des déchets dangereux. Toutes les étapes
lampe UV   ;SterilAIRStérilisation de la hotte pour la préparation de la qPCR
Vortex-genie 2 mélangeur vortex & nbsp ;Thermo Fisher Scientific50728002Homogénéise et mélange les réactifs. Lyse de l’ADN, extraction
Conteneur à déchetsMagasins d’habitationPetit contenant rigide
Pompe à eau (péristaltique/vide)Eijkelkamp ; Solinst/Smith-Root  ;12.34.SB ; 410/12099Pompes portables
Marqueur étancheDivers

Références

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