Transcriptomique spatiale de la morphogenèse dentaire précoce dans un tissu embryonnaire de souris fixé au formol et à la paraffine

Summary

Le protocole actuel décrit l’utilisation de sections fixées au formol, enrichies en paraffine, provenant des régions craniofaciales E13.5 et E15.5 d’embryons de souris pour analyser les profils d’expression génique différentielle à l’aide de la transcriptomique spatiale.

Abstract

La dent en développement comprend des populations cellulaires diverses et hautement spécialisées qui travaillent ensemble pour maintenir une forme et une fonction appropriées. Élucider les interactions entre ces cellules et leur microenvironnement environnant est essentiel pour comprendre les mécanismes régulateurs sous-jacents au développement normal des dents. Les perturbations de ces processus peuvent entraîner des troubles congénitaux tels que l’agénésie dentaire, la dentinogenèse imparfaite et l’amélogenèse imparfaite. Malgré les progrès substantiels permis par le séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) dans la révélation de l’hétérogénéité cellulaire, il ne préserve pas le contexte spatial des cellules au sein des tissus, limitant la capacité à relier l’expression génique à l’architecture tissulaire. Les technologies transcriptomiques spatiales répondent à cette limitation en intégrant un profilage d’expression génique à haute résolution avec la préservation de l’architecture tissulaire native, permettant la localisation in situ des signatures moléculaires. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la collecte, la fixation et l’inclusion de la paraffine du tissu craniofacial embryonnaire de souris, adapté aux applications transcriptomiques spatiales en aval. Le flux de travail détaille la coupe optimisée et la manipulation des tissus fixés au formol, enfouis dans la paraffine, afin de préserver l’intégrité de l’ARN et la morphologie tissulaire pour une analyse spatiale à haute résolution. Cette méthode est compatible avec le séquençage et les plateformes de transcriptomie spatiale basées sur l’image, permettant un profilage transcriptique spatial reproductible de la morphogenèse dentaire précoce chez les embryons de souris. Cette approche offre des perspectives puissantes sur l’organisation spatiale et la dynamique fonctionnelle des structures craniofaciales dans les états développementaux et pathologiques, fournissant un cadre essentiel pour relier les mécanismes moléculaires à la morphologie tissulaire.

Introduction

Le développement dentaire repose sur une séquence hautement coordonnée de processus morphogénétiques lors de la croissance embryonnaire^précoce 1,2,3,4. Bien que de nombreux gènes clés et voies de signalisation aient été identifiés grâce à des études génétiques et développementales, notre compréhension de la manière dont ces facteurs interagissent pour façonner les structures craniofaciales individuelles reste limitée. Notamment, même avec des progrès substantiels dans la liaison de variantes génétiques spécifiques à des troubles dentaires syndromiques et non syndromiques, les mécanismes moléculaires détaillés sous-jacents à la morphogenèse spécifique à la structure ne sont pas encore entièrement^définis 1,2,3,4. Cette lacune de connaissances continue de limiter la progression des stratégies thérapeutiques ciblées pour l’agénésie dentaire ou d’autres aberrations dentaires.

Le séquençage d’ARNm unicellulaire (scRNA-seq) a permis la découverte de types cellulaires jusque-là non reconnus dans des tissus sains et malades, ainsi que l’identification de plusieurs sous-types cellulaires à partir de profils d’expression génique distincts. Cependant, comme scRNA-seq nécessite la dissociation des tissus en cellules uniques, l’information sur la position spatiale originale de chaque cellule dans le tissu est perdue. En conséquence, ces ensembles de données ne capturent pas la manière dont les cellules sont organisées par rapport à l’architecture^{tissulaire 5,6,7}. De plus, les interactions cellulaires prédites reposent sur la présence d’interactions complémentaires de transcrits, mais ne prennent pas en compte l’information spatiale réelle, ce qui est important pour déterminer si de telles interactions se produisent in^{vivo 5,6,7}.

La technologie de transcriptomique spatiale permet un profilage à haut débit de l’expression génique tout en conservant l’information spatiale dans les sections^{tissulaires 8,9}. Les technologies de transcriptomie spatiale sont soit basées sur^l’imagerie 10,11,12, soit ^{basées sur le séquençage 12,13}. Les approches de transcriptomique spatiale pilotées par imagerie utilisent FISH pour détecter et mesurer l’expression génique ciblée avec une précision spatiale cellulaire ou subcellulaire. En revanche, les technologies basées sur le séquençage capturent l’expression génique à l’échelle du transcriptome à une résolution spatiale plus faible. La transcriptomique spatiale basée sur le séquençage utilise une stratégie visant à atteindre une résolution quasi monocellulaire avec une couverture du transcriptome entier (~20 000 gènes), en soutenant des analyses exploratoires impartiales, tandis que la transcriptomique spatiale basée sur l’image cible les panels géniques (jusqu’à ~5 000 gènes), permettant une analyse précise basée sur des hypothèses de voies spécifiques et d’interactions^{cellulaires 14}.

Les avancées technologiques en transcriptomique spatiale permettent désormais l’analyse de l’expression génique au sein de l’architecture tissulaire préservée. Les flux de travail à base de paraffine fixée au formol (FFPE) et à la cryosection offrent des approches complémentaires pour la transcriptomique^{spatiale 15, 16, 17}. Le FFPE offre une préservation supérieure de l’architecture tissulaire, permettant une cartographie spatiale précise de l’expression génique dans des tissus structurellement complexes tels que les dents en développement et les plateformes palatines. Dans notre étude et d’autres, la fixation et l’archivage du FFPE ont permis d’obtenir des données transcriptomiques spatiales hautement précises^{et reproductibles 18}. Les flux de travail de cryosection préservent l’intégrité de l’ARN mais sont plus sujets à la distorsion^{tissulaire 18}. Par conséquent, le FFPE a été sélectionné pour cette étude. Alors que le succès de scRNA-seq dépend en grande partie du maintien d’une grande intégrité de l’ARN, la transcriptomique spatiale nécessite également une morphologie tissulaire de haute qualité pour localiser avec précision les signaux d’expression génique à des caractéristiques histologiques spécifiques.

Ce protocole convient surtout aux tissus craniofaciaux embryonnaires de souris en FFPE couvrant les premiers stades du développement, où la préservation de l’architecture tissulaire fine est cruciale pour l’analyse transcriptomique spatiale. Le flux de travail est susceptible de fonctionner de manière sous-optimale sur des échantillons trop fixés, des blocs de paraffine mal orientés ou des tissus avec une intégrité ARN compromise, ce qui peut entraîner une baisse de la qualité du signal et une perte de résolution spatiale. L’application réussie de cette méthode est attestée par une morphologie tissulaire intacte, une distorsion minimale des sections et des signaux transcriptomiques robustes et spatialement résolus qui correspondent aux caractéristiques histologiques.

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), dans le cadre du protocole d’étude animale #21-031.

1. Préparation de l’animal expérimental et collecte des tissus

1. Associez un mâle et une femelle sains et fertiles à Mus musculus pour des accouplements chronométrés. Identifier les femelles enceintes par la présence d’un bouchon vaginal, désigné comme jour embryonnaire (E) 0,5.
2. Euthanasiez les femelles gestantes par inhalation de CO₂ suivie d’une luxation cervicale. Placez le couché de l’animal sur une surface chirurgicale stérile absorbante et désinfectez la zone abdominale avec 70 % d’éthanol le long du site d’incision prévu.
3. Réalisez une incision abdominale médio-abdominale à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, puis ouvrez soigneusement la paroi péritonéale avec des ciseaux microchirurgicaux pour exposer les cornes utérines. Externalisez doucement la chaîne utérine à l’aide de pinces contondantes. Isoler les embryons en libérant le tissu utérin le long du myomètre et en sectionnant l’oviducte et l’attache médiane de la corne utérine.
4. Transférez immédiatement des embryons entiers dans des PBS 1x froids et stériles dans une boîte de Petri de 10 cm.
5. Séparez soigneusement chaque embryon des membranes utérine, amniotique et chorionique environnantes, puis transférez-le dans une nouvelle boîte de 10 cm contenant un PBS 1x stérile et glacé.
6. Disséquez les têtes embryonnaires aux stades de développement souhaités à l’aide d’une lame chirurgicale stérile, puis rincez-les une fois dans un PBS bien froid et 1x avant un traitement supplémentaire.

2. Fixation et traitement du tissu

1. Disséquez les têtes embryonnaires de souris aux stades de développement souhaités et fixez du formol tampon neutre à 10 % toute la nuit à température ambiante sur un shaker.
2. Après fixation, retirez le formol, puis rincez les échantillons avec 1x PBS avant de les transférer à 70 % d’éthanol pour stockage. Effectuez la déshydratation des tissus, le nettoyage et l’infiltration de paraffine à l’aide d’un processeur de tissus automatisé.
3. Enfoncer les têtes embryonnaires dans la paraffine avec une orientation soit dans le plan coronal, soit dans le plan sagittal.
4. Après la solidification de la cire, retirez les blocs de paraffine des moules, placez-les dans des contenants hermétiques ou des sacs zip-lock, et conservez-les à 4 °C jusqu’à la coupe.
   REMARQUE : Les blocs FFPE peuvent être stockés plusieurs années avant d’être coupés sans compromettre l’intégrité tissulaire.

3. Traitement du tissu FFPE pour la transcriptomique spatiale

1. Désinfectez les surfaces de travail et les instruments avec 70 % d’éthanol, suivis d’un traitement avec une solution décontaminante à RNase afin de minimiser la dégradation de l’ARN.
2. Préparez un bain-marie contenant de l’eau déionisée et maintenez-le à 40 °C, en ajustant la température entre 40 °C et 43 °C selon les besoins selon le stade embryonnaire ou les caractéristiques tissulaires.
3. Installez le microtome, installez une nouvelle lame après l’avoir doucement essuyée avec une solution décontaminante de RNase, fixez la lame et réglez l’angle de dégagement à 10°.
   REMARQUE : Assurez-vous que la nouvelle lame est utilisée pour la coupe afin d’obtenir des tranches de tissu précises. Modifier l’angle de la lame du microtome peut avoir un impact significatif sur la qualité des sections, affectant l’intégrité des tissus, l’uniformité de l’épaisseur et la préservation des caractéristiques morphologiques.
4. Coupez l’excès de paraffine autour du tissu incrusté et montez le bloc de FFPE sur la phase froide du microtome.
5. Préparez et traitez des pinces et brosses propres avec une solution décontaminante à RNase avant utilisation.
6. Alignez la face du bloc de paraffine avec la lame du microtome, et effectuez des coupes de taille d’environ 12 μm jusqu’à ce que la région d’intérêt soit atteinte (par exemple, jusqu’à ce que la partie mésiale des molaires devienne visible dans les coupes coronales). Ajustez le bloc et la position des lames selon les besoins pour garantir des sections coronales symétriques et correctement orientées sur toute la tête.
7. Si l’isolement ARN des sections tissulaires doit être réalisé, il faut collecter directement des sections de 10 μm dans des tubes microcentrifuges de 1 mL et les traiter conformément aux recommandations du fabricant^19,20 pour l’évaluation de la qualité DV200.
8. Coupez des sections en série d’une épaisseur de 5 μm, et surveillez en continu la proximité de la zone d’intérêt en examinant les sections d’essai sur une lame classique au microscope.
9. Une fois près de la région d’intérêt, marquez soigneusement la zone tissulaire à l’aide d’une lame de scalpel n°11 sans la couper complètement, en deux régions stratégiquement espacées pour éviter que les sections ne s’enroulent ou n’adhérent. Après coupe, retirez toute paraffine attachée à l’aide des poils d’un pinceau fin.
10. Faites glisser les sections de tissu flottant sur le bain-marie à 41 °C pour permettre une relaxation douce et un aplatissement avant de les ramasser sur un toboggan.

4. Transcriptomique spatiale basée sur le séquençage

1. Prélever des coupes de tissu sur les lames en verre recommandées, en veillant à ce que toutes les régions d’intérêt soient contenues dans une zone de 6,5 × 6,5 mm. Lorsque plusieurs sections adjacentes sont placées sur la même culasse, réchauffez brièvement les lames sur un chauffe-culasse à 40 °C pour favoriser l’adhérence et éviter le détachement des sections précédemment placées. Une fois toutes les sections positionnées, incubez les lames dans un chauffe-lames couvert à 60 °C pendant 2 heures pour renforcer l’adhérence des tissus.
   REMARQUE : Les sections dépassant la zone de 6,5 × 6,5 mm n’ont pas été traitées.
2. Après l’incubation, effectuer une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) selon un protocole standard de coloration H&E, en substituant l’eau du robinet par l’eau déionisée afin de préserver l’intégrité de l’ARN.
3. Monter des couvercles en utilisant 80 % de glycérol et acquérir des images H&E haute résolution, fournissant une image de référence de meilleure qualité pour remplacer l’image H&E typique générée par le système d’imagerie par diapositives et transfert tissulaire.
4. Après l’imagerie, retirez les lames en immergeant les lames individuellement dans des tubes de 50 mL contenant de l’eau déionisée, puis préparez les lames pour leur soumission à l’installation de carottage pour un traitement ultérieur.

5. Transcriptomique spatiale basée sur l’image

REMARQUE : Des lames ont été fournies par le^{fabricant 20}, chacune contenant une zone imaginable désignée (lignes délimitées) mesurant 12 mm × 24 mm, avec une zone de placement d’échantillons disponible d’environ 235 mm² (10,45 mm × 22,45 mm).

1. Placez les sections tissulaires entièrement dans cette zone définie, en veillant à ce que les sections, y compris la paraffine résiduelle, ne se chevauchent pas. Lors de la place de plusieurs sections adjacentes, réchauffez brièvement les lames sur un chauffe-glissière à 40 °C pour favoriser l’adhérence et éviter le détachement des sections précédemment montées.
2. Une fois toutes les sections de tissu positionnées, placez les lames dans un chauffe-lames couvert et faites couver toute la nuit à 40 °C pour garantir une bonne adhérence.
3. Après l’incubation, suivez le protocole¹⁹ du fabricant pour traiter les lames et les charger dans la machine pour le séquençage de l’ARN, le protocole étant vérifié avec la version la plus récente, car les détails procéduraux sont soumis à des mises à jour périodiques.
   REMARQUE : Toutes les matières dangereuses produites pendant le protocole, telles que le formol, l’éthanol et les solutions décontaminantes à RNase, doivent être éliminées conformément aux politiques de sécurité institutionnelles et aux réglementations locales, en utilisant des contenants de déchets chimiques appropriés, des méthodes d’élimination des biohazards et des pratiques de hottes à fumée.

Results

Cette méthode décrit le traitement des têtes embryonnaires de souris fraîchement disséquées pour générer des échantillons de FFPE de tissus craniofaciaux, y compris la dent en développement, qui peuvent être facilement sectionnés par microtome tout en maintenant l’intégrité de l’ARN (Figure 1). Ce protocole a été appliqué avec succès aux têtes d’embryons E13.5 (jour embryonnaire 13.5), E15.5 et E16.5 pour les régions craniofaciales à haute résolution basées ...

Discussion

Dans ce travail, nous présentons un protocole détaillé pour préparer des blocs FFPE de têtes embryonnaires de souris, optimisés pour une utilisation avec des plateformes d’imagerie spatiale à haute résolution d’ARN, incluant la transcriptomique spatiale basée sur le séquençage et l’imagerie. Un objectif clé de ce protocole est de préserver à la fois la morphologie tissulaire et l’intégrité des acides nucléiques sur les sections entières de la tête, avec un accent particulier sur la régio...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  ; pour effectuer des lavages pendant le flux de travail
50 mL de tubes coniques (Ambion) sans ARNase	Thermo Fischer	AM12502	Utilisation pour stocker des échantillons dans différentes solutions
Vibrateur orbital avancé	VWR	6683-470	À utiliser pour secouer les tissus dans la solution de fixation pendant l’incubation
Alcool, 70 %, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	À utiliser pour nettoyer et désinfecter tout l’espace de travail
Processeur de tissu à vide automatisé	Leica Biosystems	ASP300S	Utilisation pour dégager la déshydratation, la réhydratation et l’infiltration de cire des échantillons
Verre de couverture Épaisseur 1,5, 25 mm x 25 mm   ;	Corning	2850-25	Utilisation pour le montage de la culasse dans le flux de travail Visium HD
Tampon de bleu Dako, prêt à l’emploi	Agilant Technologies	CS70230-2	Utilisation pour H& Coloration E
Éosine-Y avec phloxine	Fisher Scientific	22050198	Utilisation pour H& Coloration E
Hématoxyline, Mayer, solution aqueuse prête à l’emploi	Agilant Technologies	S330930-2	Utilisation pour H& Coloration E
Bain Marie HistoCore & nbsp ;	Leica Biosystems	HIS2326	Utilisez pour faire flotter les sections à 40-43 °C ; C pour éliminer les plis des sections FFPE & nbsp ;
Loupe browser  ; 9.0.0	10X Genomics, Inc.  ;		À utiliser pour analyser les données Visium HD   ;
Lames jetables à profil bas DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	À utiliser pour sectionner les blocs FFPE & nbsp ;
Formol tamponné neutre 10 %	Azer Scientific	NBF-4-G	À utiliser pour réparer les mouchoirs
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Thermo Fischer	AM9782	À utiliser pour nettoyer et retirer la RNase
Microtome rotatif semi-automatisé	Leica Biosystems	RM2245	Utilisez pour sectionner les blocs FFPE tels que rapportés dans les directives.
Chauffe-coulisse avec couvercle	Première & nbsp ;	XH2004	Utilisation pour l’incubation de lames à différentes températures
Slides Superfrost Plus & nbsp ;	Fisher Scientific	12-550-15  ;	Utilisation pour attacher des sections pour Vsium HD
Lame chirurgicale n° 11	Integra Miltex	4-311	Utilisation pour la notation des tissus FFPE
Paraplaste Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Utilisation pour effectuer l’infiltration tissulaire et l’implantation des tissus
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Utilisation pour collecter et disséquer des échantillons dans un PBS 1x
Glycérol UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Utilisation pour le montage Visium HD sur coulisse de verre de couverture avant CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000442	Utilisation pour les expériences de flux de travail Visium HD
Séquençage spatial de l’ARN Visium HD	10X Genomics, Inc.  ;	1000676	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales
Localisation in situ de l’ARN Xenium 5K   ;	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000724	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales
Analyseur de xénium	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000481	Utilisez l’imagerie de l’ARN Xenium et Xenium 5K   ;
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.  ;		À utiliser pour analyser les données Xenium   ;
Localisation in situ de l’ARN du xénium	10X Genomics, Inc.  ;	1000672	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales