Transcriptomique spatiale de la morphogenèse dentaire précoce dans un tissu embryonnaire de souris fixé au formol et à la paraffine

Summary

Le protocole actuel décrit l’utilisation de sections fixées au formol, enrichies en paraffine, provenant des régions craniofaciales E13.5 et E15.5 d’embryons de souris pour analyser les profils d’expression génique différentielle à l’aide de la transcriptomique spatiale.

Abstract

La dent en développement comprend des populations cellulaires diverses et hautement spécialisées qui travaillent ensemble pour maintenir une forme et une fonction appropriées. Élucider les interactions entre ces cellules et leur microenvironnement environnant est essentiel pour comprendre les mécanismes régulateurs sous-jacents au développement normal des dents. Les perturbations de ces processus peuvent entraîner des troubles congénitaux tels que l’agénésie dentaire, la dentinogenèse imparfaite et l’amélogenèse imparfaite. Malgré les progrès substantiels permis par le séquençage à ARN unicellulaire (scRNA-seq) dans la révélation de l’hétérogénéité cellulaire, il ne préserve pas le contexte spatial des cellules au sein des tissus, limitant la capacité à relier l’expression génique à l’architecture tissulaire. Les technologies transcriptomiques spatiales répondent à cette limitation en intégrant un profilage d’expression génique à haute résolution avec la préservation de l’architecture tissulaire native, permettant la localisation in situ des signatures moléculaires. Ici, nous décrivons un protocole étape par étape pour la collecte, la fixation et l’inclusion de la paraffine du tissu craniofacial embryonnaire de souris, adapté aux applications transcriptomiques spatiales en aval. Le flux de travail détaille la coupe optimisée et la manipulation des tissus fixés au formol, enfouis dans la paraffine, afin de préserver l’intégrité de l’ARN et la morphologie tissulaire pour une analyse spatiale à haute résolution. Cette méthode est compatible avec le séquençage et les plateformes de transcriptomie spatiale basées sur l’image, permettant un profilage transcriptique spatial reproductible de la morphogenèse dentaire précoce chez les embryons de souris. Cette approche offre des perspectives puissantes sur l’organisation spatiale et la dynamique fonctionnelle des structures craniofaciales dans les états développementaux et pathologiques, fournissant un cadre essentiel pour relier les mécanismes moléculaires à la morphologie tissulaire.

Introduction

Le développement dentaire repose sur une séquence hautement coordonnée de processus morphogénétiques lors de la croissance embryonnaire^précoce 1,2,3,4. Bien que de nombreux gènes clés et voies de signalisation aient été identifiés grâce à des études génétiques et développementales, notre compréhension de la manière dont ces facteurs interagissent pour façonner les structures craniofaciales individuelles reste limitée. Notamment, même avec des progrès substantiels dans la liaison de variantes génétiques spéci....

Protocol

Toutes les procédures animales ont été approuvées par le National Institutes of Health, le National Institute of Child Health and Human Development Animal Care and Use Committee (ACUC), dans le cadre du protocole d’étude animale #21-031.

1. Préparation de l’animal expérimental et collecte des tissus

1. Associez un mâle et une femelle sains et fertiles à Mus musculus pour des accouplements chronométrés. Identifier les femelles enceintes par la présence d’un bouchon vaginal, désigné comme jour embryonnaire (E) 0,5.
2. Euthanasiez les femelles gestantes par inhalation ....

Results

Cette méthode décrit le traitement des têtes embryonnaires de souris fraîchement disséquées pour générer des échantillons de FFPE de tissus craniofaciaux, y compris la dent en développement, qui peuvent être facilement sectionnés par microtome tout en maintenant l’intégrité de l’ARN (Figure 1). Ce protocole a été appliqué avec succès aux têtes d’embryons E13.5 (jour embryonnaire 13.5), E15.5 et E16.5 pour les régions craniofaciales à haute résolution basées .......

Discussion

Dans ce travail, nous présentons un protocole détaillé pour préparer des blocs FFPE de têtes embryonnaires de souris, optimisés pour une utilisation avec des plateformes d’imagerie spatiale à haute résolution d’ARN, incluant la transcriptomique spatiale basée sur le séquençage et l’imagerie. Un objectif clé de ce protocole est de préserver à la fois la morphologie tissulaire et l’intégrité des acides nucléiques sur les sections entières de la tête, avec un accent particulier sur la régio.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	Thermo Fischer	10010023	Use  ; pour effectuer des lavages pendant le flux de travail
50 mL de tubes coniques (Ambion) sans ARNase	Thermo Fischer	AM12502	Utilisation pour stocker des échantillons dans différentes solutions
Vibrateur orbital avancé	VWR	6683-470	À utiliser pour secouer les tissus dans la solution de fixation pendant l’incubation
Alcool, 70 %, Fisherbrand, HistoPrep	Fisher Scientific	HC-1000-1GL	À utiliser pour nettoyer et désinfecter tout l’espace de travail
Processeur de tissu à vide automatisé	Leica Biosystems	ASP300S	Utilisation pour dégager la déshydratation, la réhydratation et l’infiltration de cire des échantillons
Verre de couverture Épaisseur 1,5, 25 mm x 25 mm   ;	Corning	2850-25	Utilisation pour le montage de la culasse dans le flux de travail Visium HD
Tampon de bleu Dako, prêt à l’emploi	Agilant Technologies	CS70230-2	Utilisation pour H& Coloration E
Éosine-Y avec phloxine	Fisher Scientific	22050198	Utilisation pour H& Coloration E
Hématoxyline, Mayer, solution aqueuse prête à l’emploi	Agilant Technologies	S330930-2	Utilisation pour H& Coloration E
Bain Marie HistoCore & nbsp ;	Leica Biosystems	HIS2326	Utilisez pour faire flotter les sections à 40-43 °C ; C pour éliminer les plis des sections FFPE & nbsp ;
Loupe browser  ; 9.0.0	10X Genomics, Inc.  ;		À utiliser pour analyser les données Visium HD   ;
Lames jetables à profil bas DB80LX	Leica Biosystems	14035843496	À utiliser pour sectionner les blocs FFPE & nbsp ;
Formol tamponné neutre 10 %	Azer Scientific	NBF-4-G	À utiliser pour réparer les mouchoirs
Solution de décontamination RNaseZap RNase	Thermo Fischer	AM9782	À utiliser pour nettoyer et retirer la RNase
Microtome rotatif semi-automatisé	Leica Biosystems	RM2245	Utilisez pour sectionner les blocs FFPE tels que rapportés dans les directives.
Chauffe-coulisse avec couvercle	Première & nbsp ;	XH2004	Utilisation pour l’incubation de lames à différentes températures
Slides Superfrost Plus & nbsp ;	Fisher Scientific	12-550-15  ;	Utilisation pour attacher des sections pour Vsium HD
Lame chirurgicale n° 11	Integra Miltex	4-311	Utilisation pour la notation des tissus FFPE
Paraplaste Surgipath	Leica Biosystems	39601006	Utilisation pour effectuer l’infiltration tissulaire et l’implantation des tissus
TISsue DISH CULTURE 100X20MM 500/CS	Fisher Scientific	877222	Utilisation pour collecter et disséquer des échantillons dans un PBS 1x
Glycérol UltraPure	Thermo Fischer	15514011	Utilisation pour le montage Visium HD sur coulisse de verre de couverture avant CytAssist
Visium CytAssist	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000442	Utilisation pour les expériences de flux de travail Visium HD
Séquençage spatial de l’ARN Visium HD	10X Genomics, Inc.  ;	1000676	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales
Localisation in situ de l’ARN Xenium 5K   ;	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000724	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales
Analyseur de xénium	10X Genomics, Inc.  ;	PN-1000481	Utilisez l’imagerie de l’ARN Xenium et Xenium 5K   ;
Xenium Explorer 4	10X Genomics, Inc.  ;		À utiliser pour analyser les données Xenium   ;
Localisation in situ de l’ARN du xénium	10X Genomics, Inc.  ;	1000672	Utilisation pour réaliser des expériences transcriptomiques spatiales